MXPA00001260A - Recuperacion de virus de cultivos celulares utilizando una solucion salina hipertonica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para cosechar un herpesvirus de un cultivo celular infectado con este comprende tratar el cultivo con una solución salina acuosa hipertónica para producir una suspensión de virus, por ejemplo, para dar un rendimiento mejorado de virus para vacunas de virus vivos, donde en otras circunstancias podría ser utilizado el rompimiento celular para cosechar virus rompiendo las células infectadas por el virus. El paso de cosechar puede ser seguido por ejemplo por tratamiento con nucleasa, difracción y liofilización.

Description

RECUPERACIÓN DE VIRUS DE CULTIVOS CELULARES UTILIZANDO UNA SOLUCIÓN SALINA HIPERTÓNICA Campo de la Invención: Esta invención se relaciona con la producción de virus y con la cosecha de preparaciones de virus de cultivos de células infectadas por virus, por ejemplo para propósitos experimentales y terapéuticos, por ejemplo, para la producción de vacunas de virus. En aspectos particulares la invención se relaciona con los métodos y arreglos para la producción de herpesvirus. Otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la descripción dada más adelante.

Antecedentes de la Invención y Técnica Anterior: Se conocen varios métodos para la producción de preparaciones de. virus vivos, por ejemplo, preparaciones de herpesvirus, para vacunas y otros propósitos. Por ejemplo la US 3,985,615 (Osaka Res Foundation: T Kubo et al) muestra la producción de virus de varicela atenuados vivos para vacunas utilizadas por cultivo que comprende el paso en células de tejido embrionario y primario de cobayo. La US 5,024,836 (Merck: J McAleer et al) se relaciona con la producción de preparaciones de vacunas liofilizadas basadas en los mismos. ref.; 32726 La DD-209738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patruscu) ilustra la producción de otro tipo de herpesvirus, para utilizarse como vacuna contra la enfermedad de Marek producidos (a) cultivando células de embrión de pollo libres de patógenos específicos sobre microesferas de dextran; (b) inoculando el cultivo a una confluencia del 80% con virus del herpes dé pavo cepa FC-126 (clona 1, Illb) ; (c) recolectando las células infectadas en medio SPGA (sucrosa, fosfato, glutamato, fracción de albúmina bovina V) cuando el efecto citopático es del 80%; (d) someter la suspensión a tres impulsos ultrasónicos de 1 minuto de duración a intervalos de 2 minutos y centrifugar esta para recuperar un primer cultivo de vacuna: (e) suspender el sedimento en medio SPGA y repetir el paso (d) para obtener un segundo cultivo de vacuna (para incrementar el rendimiento de la vacuna en casi un 20%) ; (f) congelar las vacunas combinadas a -100 grados C antes de determinar el titulo del virus; y (g) diluir con medios SPGA y liofilizar. La JP06234659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkuykai) describe, en un ejemplo, la producción de vacuna herpesviral sobre células MRC-5 de fibroblasto diploide humano cultivadas en medio MEM a 37 grados C; que comprende la inoculación de virus sembrados cepa Oka del virus de la varicela a un MOI de 0.03 a células MRC-5 y cultivar a 37 grados C durante 2 dias. El virus se suspende entonces en una solución que contiene 6.4g de NaCl, O.lßg de KCl, 2.3g de Na2HP04.12H20, O.lßg de KH2P04, 50. Og de sucrosa, l.Og de L-glutamato de Na, 2.0 de gelatina, 25. Og de hidrolizado de gelatina y 0.1 de.EDA-3Na por 1. La EP 0 573 107, la US 5,360,736 y la US 5,607,852 (Merck: PA Friedman et al) describen procesos para la producción de vacuna de virus zoster de varicela atenuado, incluyendo un proceso para la preparación de una vacuna de virus zoster de varicela libre de células, (VZV) , atenuados, vivos, que comprende: (a) Cultivar células susceptibles a infección por VZV, seleccionadas de células diploides humanas, hasta la confluencia en cultivo de una sola capa, bajo . condiciones de nutrición suficientemente alta para alcanzar un alto grado de reproducción celular, y suministrar un disacárido no metabolizables; (b) infectar las células cultivadas de acuerdo al paso (a) tan cerca como sea posible del punto de confluencia con una alta multiplicidad de infección de células infectadas por VZV como sea práctico; (c) mantener el cultivo infectado por VZV en un estado de alta nutrición durante aproximadamente 22-96 horas y cosechar en el punto de la producción de VZV infeccioso; (d) lavar el cultivo infectado por VZV con una solución fisiológica, que opcionalmente contiene un agente lisosomotrópico, tal como el cloruro de amonio o cloroquina, antes de cosechar las células infectadas por VZV; (e) cosechar las células infectadas por VZV en un volumen mínimo de una solución estabilizante y romper las células inmediatamente o congelar las células para su rompimiento posterior; (f) romper las células infectadas por VZV para liberar opcionalmente el VZV asociado a las células, y remover los restos celulares, para proporcionar una preparación de VZV libre de células. El proceso describe el uso de densidades celulares de hasta 500,000 células/cm2 en recipientes de cultivo convencionales. El proceso se propuso para la producción en masa de vacuna viva. En relación con esto se describe un medio nutriente apropiado para hacer crecer las células en un cultivo de una sola capa que consiste esencialmente de medio SFRE-2 suplementado con entre 0.2 mg/mL y 0.4 mg/mL; lipidos de soya. Las células se seleccionan de células MRC-5, células I-38 y células Vero. La WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al) y la WO 94/21807 (Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al) son ilustrativas de la provisión de células recombinantes y método de cultivo para producir herpesvirus genéticamente desactivados tales como el virus del herpes simple para propósitos de vacunas. Sigue siendo deseable proporcionar métodos para el tratamiento de preparaciones que contienen virus, capaces de contribuir a la manufactura de preparaciones de virus con buen rendimiento y pureza.

RESUMEN Y DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un aspecto de la presente invención, un cultivo celular infectado con un herpesvirus puede ser tratado para producir una suspensión de virus cosechando una incubación con una solución salina acuosa hipertónica. La solución salina puede ser puesta en contacto con el cultivo celular para producir un liquido que contiene virus útiles y un contenido muy reducido de células y restos celulares en comparación con (por ejemplo) el producto del rompimiento ultrasónico. . Este proceso puede por ejemplo ser particularmente aplicable para dar un rendimiento mejorado de virus para la manufactura de vacunas de virus vivos en un caso donde en otras circunstancias podria utilizarse un rompimiento celular para cosechar virus rompiendo células infectadas por el virus de un cultivo celular que produce virus . Muchas sales farmacéuticamente aceptables son adecuadas y aceptables para este propósito, por ejemplo el cloruro de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio y otras. De manera preferible la solución salina puede comprender cloruro de sodio a una concentración por ejemplo de aproximadamente 0.8 a 0.9 M o superior. Si se utiliza sulfato de sodio, la concentración puede ser preferiblemente de alrededor de 0.4MO más. Pueden ser utilizadas otras sales, si se desea a osmolaridad o fuerza iónica similar a las concentraciones indicadas anteriormente. Los virus pueden con frecuencia estar a una concentración de hasta 1M o 2M pero en cada caso, se prefiere no muy por encima de la concentración indicada, de modo que se evite la absorción excesiva de proteina en el liquido salino. Los amortiguadores y otros constituyentes pueden elegirse de manera adecuada de acuerdo con la práctica normal para manejar los virus de interés. La incubación de la cosecha puede llevarse a cabo con agitación suave, y de manera preferible se lleva a cabo de tal manera que no implica rompimiento o solo un rompimiento celular minimo. El cultivo celular a ser tratado para la incubación de la cosecha puede por ejemplo ser un cultivo de una sola capa y un cultivo microportador o un cultivo en botella giratoria. La solución salina de la cosecha puede ser amortiguada y mantenida a un pH y temperaturas por si adecuadas para el cultivo de las células infectadas por virus, por ejemplo aproximadamente pH 7 y de manera ventajosa aproximadamente 34 grados C para el virus del herpes simple. El tiempo de contacto entre las células cultivadas y el liquido de la cosecha no es especialmente critico y puede por ejemplo estar en el intervalo de aproximadamente 2-24 horas. Se ha encontrado que en relación con ciertos ejemplos de por ejemplo aproximadamente 4 horas de tiempo de contacto son preferibles debido a que pueden ofrecer buen rendimiento con niveles aceptablemente bajos de proteina celular. Después del contacto entre las células infectadas cultivadas y cosechar el liquido, el liquido que contiene las partículas de virus cosechadas, puede ser separado por decantación o cualquier otro método adecuado; las células cultivadas en si pueden dejarse permanecer unidas a la superficie sobre la cual se cultivaron, y pueden ser desechadas después de la separación del liquido de la cosecha. El liquido de la cosecha puede entonces si se desea ser tratado por filtración y/o centrifugación para remover las células residuales. De manera deseable, la preparación cosechada puede ser diluida o diafiltrada a una concentración aproximadamente isotónica, por ejemplo aproximadamente 138 mM en cloruro de sodio. De acuerdo a un aspecto más de la invención, la preparación de virus cosechada de esta manera puede ser tratada con enzima nucleasa para reducir cualquier contenido de ácido nucleico contaminante a niveles aceptables. El liquido diluido puede por ejemplo ser tratado con la enzima nucleasa benzonasa (MR) , para degradar ácidos nucleicos libres (principalmente ADN, y usualmente también ARN) hasta aproximadamente 50 unidades/ml en presencia de aproximadamente 2-10 mM de ion magnesio, ya sea por hasta una hora de aproximadamente 4°C hasta la temperatura ambiente. El nivel de enzima nucleasa y otra proteina puede entonces reducirse por ejemplo por diafiltración contra un amortiguador de formulación adecuado a través de una membrana con una retención de virus con un limite de exclusión de por ejemplo 500 kD. Después de esos tratamientos los virus cosechados pueden ser transferidos a un portador liquido deseado y congelados, liofilizados o de otro modo estabilizados de cualquier manera adecuada. Los procesos de acuerdo a los ejemplos de la invención pueden ofrecer ventaja particular en relación con virus altamente asociados con células, es decir aquellos virus que tienen un grado particularmente alto de asociación celular en cultivo, por ejemplo el virus del herpes simple tipo 2 (HSV-2), el virus de la pseudorrabia (PRV) , virus del herpes del pavo y virus zoster de la varicela (VZV) . Con ciertos herpesvirus y condiciones de cultivo (por ejemplo con el virus del herpes simple tipo I (HSV-1)) puede existir una liberación espontánea de virus de las células infectadas hacia el liquido del cultivo, de modo que la aplicación de un proceso de acuerdo a un ejemplo de la presente invención puede algunas veces aqui ser innecesario y en consecuencia tales ejemplos de la invención son los menos preferidos.

La invención puede ser aplicada con cualesquiera adaptaciones apropiadas de los detalles como será fácilmente accesible a aquellos expertos en la técnica a herpes virus de varios tipos, incluyendo por ejemplo el virus del herpes simple silvestre y herpesvirus genéticamente desactivados tales como el virus del herpes simple, y por ejemplo otros herpes virus que se mencionan en los documentos citados aqui. Las preparaciones de virus obtenidas por el uso de los pasos del proceso descritos aqui pueden ser procesados y hacerse parte de composiciones farmacéuticas por ejemplo con ingredientes convencionales per-se de vacunas de virus. La invención se describe e ilustra además por el siguiente ejemplo no limitante.

EJEMPLO : Un proceso de acuerdo al ejemplo de la invención, para cosechar y purificar partículas de virus, puede utilizar un cultivo de células Vero infectadas con HSV-2, creciendo esencialmente de manera conocida en medio del cultivo convencional contenido en botellas giratorias a aproximadamente 100 mi de medio por botella. El medio de cultivo, el tipo de célula y las condiciones de cultivo pueden ser por ejemplo como sigue: Las células Vero pueden pasarse a 2 x 10~7 células por botella giratoria. El cultivo puede llevarse a cabo utilizando medio de DMEM con 4.5 g/1 de glucosa sin piruvato de sodio y con Glutamax-1 (MR) (L-alanin-L-glutamina) , 862 mg/1. a incubación puede llevarse a cabo por ejemplo a aproximadamente 37 °C y durante aproximadamente 120 horas (5 dias) . Unos cultivos de células confluentes pueden entonces ser infectados con HSV-2 a una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.01, diluyendo el virus en DMEM a un nivel donde se agrega 1 mi a cada botella giratoria, el cual es entonces regresado al aparato de incubación giratorio a aproximadamente 34-37 °C. Cuando se observa que el efecto citopático es del 80-100%, por ejemplo 65-72 horas después de la infección, las botellas giratorias pueden ser tratadas como si estuvieran listas para cosechar los virus. El medio de cultivo puede ser decantado de cada botella y reemplazado por 10 mi por botella de una solución de cloruro de sodio amortiguado (0.8-0.9 M) con un contenido de citrato de sodio 0.01M pH 7.0. Las células en la botella giratoria en contacto con esta solución de cloruro de sodio amortiguada puede hacerse girar y cultivarse a aproximadamente 34 °C durante aproximadamente 4 horas.

Las células cultivadas en si mismas en la botella giratoria pueden permanecer en gran medida unidas a la superficie de la botella y pueden ser desechadas después de la separación del liquido que contiene las partículas del virus cosechadas.

El liquido en la botella, que comprende la solución salina amortiguado y el material del cultivo celular en suspensión, incluyendo el virus, puede ser removido por medio de una pipeta y centrifugado a aproximadamente 3000 rpm en una centrifuga Sorvall RT6000 (MR) durante aproximadamente 10 minutos (por ejemplo a RCFmax de aproximadamente 1876) . Las células en el sedimento y aquéllas que permanecen en la botella, son desechadas (bajo condiciones de contención de virus apropiado) y el sobrenadante se retira por medio de una pipeta para el siguiente paso, el cual puede ser la centrifugación a flujo continuo. La prefiltración puede llevarse a cabo con un filtro de 0.8 micrones. El liquido sobrenadante de la centrifugación puede ser diluida o diafiltrada a una concentración final (con respecto al ion sodio) de 138mM. El liquido diluido puede entonces ser tratado con enzima nucleasa Benzonasa (MR) , para degradar ácidos nucleicos libres (principalmente la enzima utilizada tiene actividad de DNasa, y usualmente también, como la Benzonasa (MR) , tendrá actividad de Rnase) a hasta aproximadamente 50 unidades/ml en presencia de aproximadamente 2-10 mM de ion magnesio, por ejemplo durante hasta aproximadamente 1 hora a una temperatura de aproximadamente 4°C hasta la temperatura ambiente.

El liquido de reacción puede entonces ser sometido a filtración por flujo transversal tangencial (diafiltración) utilizando un filtro/membrana con un límite de exclusión 500kD en un Filtron (MR) u otro dispositivo de flujo transversal tangencial, utilizando una velocidad de recirculación de 1000 ml/min., una velocidad de filtración de 100 ml/min. y un contralavado de 100 mi de citrato de sodio 0.01 M pH 7.25 con un contenido de cloruro de sodio 138 mM. La fracción retenida del paso de ultrafiltración por flujo transversal puede entonces ser tratado por diafiltración contra 5-10 volúmenes de amortiguador de citrato/solución salina para reducir la cantidad de enzima nucleasa, y la fracción retenida se somete finalmente a una filtración de 0.2 micrones (con esterilización) opcionalmente precedida por una filtración con un filtro de aproximadamente 0.45 micrones a 5 micrones utilizando nuevamente el mismo amortiguador, después de hacer que el liquido contenga la preparación de virus hasta 20 mg/ml en una proteina estabilizadora adecuada, de manera preferible seroalbúmina humana a aproximadamente 20 mg/ml. Puede ser útil para prelavar los filtros con un liquido que contenga la misma proteina estabilizadora en el mismo amortiguador, antes de utilizar los filtros para tratar la preparación de virus. El producto resultante puede obtenerse como una suspensión de partículas de virus en amortiguador salino y proteina estabilizadora, en la cual el nivel de ADN residual puede ser satisfactoriamente bajo. Se ha encontrado que el rendimiento de tal , proceso es en términos útiles bueno en comparación con el proceso que implica el rompimiento celular ultrasónico para liberar partículas de virus, seguido por la separación de partículas de virus de restos celulares. La invención puede ser aplicada de manera muy útil, por ejemplo en una modalidad preferida llevada a cabo de acuerdo al ejemplo descrito anteriormente, al cultivo y cosecha de virus HSV-2 genéticamente desactivado para usarse en vacunas, virus el cual tiene una supresión con respecto al gen gH esencial para la producción de nuevas partículas de virus infecciosas, y es cultivable sobre una linea celular la cual se basa en células Vero las cuales se han vuelto recombinantes y capaces de expresar el gen gH viral el cual está ausente del genoma viral, por ejemplo como se describe en las especificaciones de la WO 92/05263 y WO 94/21807 (y véase también A Forrester et al, J Virol 66 (1992) 341-348, también H E Farrell et al. J Virol 68 (1994) 927-932) y CMcLeanet al. J Infect Dis 170 (1994) 1100-1109). También puede ser preferible, de acuerdo a la conveniencia, cultivar las células y virus sobre varias formas de microportadores en una forma conocida per se, en lugar de botellas giratorias.

La presente invención y el grado de descripción de I?S métodos y composiciones en los productos resultantes descritos aqui, y las modificaciones y variaciones . de las características mencionadas y descritas aqui, incluyendo las combinaciones y subcombinaciones de las mismas, y los documentos citados aqui se incorporan por lo tanto como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un proceso para cosechar un herpes virus de un cultivo celular infectado con éste, caracterizado porque comprende tratar el cultivo con una solución salina acuosa hipertónica para producir una suspensión de virus.
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión de virus es tratada además para formular como una preparación farmacéutica adecuada para utilizarse como una vacuna de virus.
3. 3. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la sal comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0.8 M o mayor.
4. 4. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque la solución salina de cosecha está amortiguada a un pH de aproximadamente 7 y una temperatura de aproximadamente 34 °C para cosechar el virus del herpes simple.
5. 5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la preparación cosechada se diluye entonces o diafiltra a una concentración aproximadamente isotónica.
6. 6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la preparación del virus cosechada es tratada con enzima nucleasa.
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la preparación después del tratamiento con nucleasa es diafiltrada contra un amortiguador de formulación, a través de una membrana con un limite de exclusión de retención de virus.
8. 8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el virus cosechado, después de la transferencia al liquido portador deseado, se congela, liofiliza o en otras circunstancias se estabiliza .
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus comprende al virus del herpes simple del tipo 2 (HSV-2) virus pseudorrabia (PRV) , virus del herpes del pavo o virus zoster de la varicela (VZV) .