MXPA00008535A - Preparaciones virales y metodos para su produccion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las preparaciones de herpesvirus, pro ejemplo HSV tipo 2 cultivado, por ejemplo, virus genéticamente incapacitado, para uso en vacunas, se puede purificar, por ejemplo, para formulación farmacéutica subsecuente, con reactivos de afinidad en fase sólida que contienen grupos de unión que comprenden sulfato o sulfonato, por ejemplo grupos de polisacáridos sulfatados, por ejemplo heparina o sulfato de dextrano, y eluir, por ejemplo, con soluciones salinas. El proceso se puede combinar con otras etapas de cultivo y cosechado.

Description

PREPARACIONES VIRALES Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la producción y purificación de virus y con el cosechado y purificación de preparaciones de virus a partir de cultivos celulares infectados con virus, por ejemplo, para propósitos experimentales y terapéuticos, por ejemplo para la producción de formulaciones farmacéuticas tales como vacunas virales . En particular, los aspectos de la invención se relacionan con métodos y arreglos para la producción de preparaciones de herpesvirus. Otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la descripción que se proporciona después.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Y TÉCNICA ANTERIOR Se conocen diversos métodos para producir preparaciones de virus vivo, por ejemplo preparaciones de herpes virus, para vacuna u otros propósitos. Por ejemplo, el documento US 3,985,615 (Osaka Res Foundation: T. Kubo et al) muestra la producción de virus de varicela atenuado vivo para uso como vacuna mediante el cultivo que comprende el pasaje en células de tejido embriónico primario de cobayo. El documento US 5,024,836 (Merck: WJ REF: 122688 McAleer et al) se relaciona con la producción de preparaciones liofilizadas de vacuna en base en el mismo. El documento DD-209738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) ilustra la producción de otro tipo de herpesvirus para uso como vacuna contra la enfermedad de Marek que se produce mediante: (a) cultivar células de embrión de pollo específicas de cultivo y líneas de patógeno sobre microesferas de dextrano; (b) inocular el cultivo a 80% de confluencia con la cepa de virus de herpes de pavo FC-126 (clona 1, Illb) ; (c) recolectar las células infectadas en medio SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato, fracción V de albúmina bovina) , cuando el efecto citopático es de 80%; (d) someter la suspensión a tres pulsos ultrasónicos de 1 minuto de duración a intervalos de 2 minutos y centrifugarlos para recuperar una primera cosecha de vacuna; (e) resuspender el sedimento -en medio SPGA y repetir la etapa (d) para obtener una segunda cosecha de vacuna (para incrementar el rendimiento de vacuna en casi 20%) ; (f) congelar las vacunas combinadas a -100 °C, antes de determinar el título de virus; y (g) diluir con medio SPGA y liofilizar. El documento JP06234659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) describe, en un ejemplo, la producción de una vacuna herpes viral sobre células MRC-5 de fibroblastos diploides humanos cultivados en medio MEM a 37°C; que comprende la inoculación de virus de semilla de la cepa Oka del virus de varicela a una MOI de 0.03 a células MRC-5, y cultivar a 37°C durante 2 días . El virus después se suspende en una solución que contiene 6.4 g de NaCl, 0.16 g de KCl, 2.3 g de Na2HP04.l2H20, 0.16 g de KH2PÓ4, 50.0 g de sacarosa, 1.0 g de -glutamato de Na, 2.0 g de gelatina, 25.0 g de hidrolizado de gelatina y 0.1 g de EDA-3 Na por 1. El documento EP 0 573 107, US 5,360,736 y US 5,607,852 (Merck: PA Friedman et al) describe procesos para la producción de vacunas de virus de varicela Zoster atenuada, que incluye un proceso para preparar vacuna de virus de varicela-Zoster (VZV) libre de células, atenuada, viva, que comprende: (a) cultivar células susceptibles a infección por VZV, que se seleccionan de células diploides humanas, a confluencia en un cultivo de monocapa, bajo condiciones de nutrición lo suficientemente elevada para obtener un alto grado de replicación celular, y suministrar un disacárido no metabolizable; (b) infectar las células cultivadas de acuerdo con la etapa (a) tan cerca del punto de confluencia como sea posible con una multiplicidad de infección elevada de células infectadas con VZV como sea práctico; (c) mantener el cultivo infectado con VZV en un estado de alta nutrición durante aproximadamente 22-9.6 horas y cosechar en el punto de producción pico de VZV infeccioso; (d) lavar el cultivo infectado con VZV con una solución fisiológica, que opcionalmente contiene un agente lisosomotrópico tal como cloruro de amonio o cloroquina, antes de cosechar las células infectadas con VZV, (e) cosechar las células infectadas con VZV en un volumen mínimo de una solución estabilizante y romper las células inmediatamente o congelar las células para ruptura posterior; (f) romper las células infectadas con VZV para liberar de manera óptima VZV asociado a células, y mover el residuo celular, para proporcionar una preparación de VZV libre de células. El proceso describe el uso de identidades celulares de hasta ca. 500,000 células/cm2 en densidades de cultivo convencionales . Se propone el proceso para la producción en masa de vacuna viva. A este respecto, se describe un medio nutriente apropiado para hacer crecer células en cultivo de monocapa, que consiste esencialmente de medio SFRE-2 suplementado con entre 0.2 mg/ml y 0.4 mg/ml de lípido de frijol de soya, las células se seleccionan de células MCR-5, células WI-38 y células Vero. Los documentos WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC inglis et al) y WO 94/21807 (Cantab Pharmaceutical Research: Inglis et al) son ilustrativos de la provisión de células recombinantes y de métodos de cultivo para producir este virus inactivado genéticamente tal como virus de herpes simplex para propósitos de vacuna. Se sabe que el virus de herpes simplex se puede unir a sulfato de heparano en la superficie celular (E. Lycke et al, J gen Virol (1991) 72: 1131-1137).

Se ha demostrado más ampliamente que los virus se unen a polisacáridos sulfonados tales como sulfato de dextrano, heparina y sulfato de heparano (M. Baba et al, PNAS 1988 85:6132-6136; E. Licke et al, mencionado en lo anterior; y H Mitsuya et al Science 1988 240:646-649). También se sabe como llevar a cabo unión por afinidad y purificación de herpesvirus felino en un derivado sulfonado de celulosa regenerada en forma de esferas con un diámetro de partícula de 80 micrómetros y una estructura de poro que se afirma rechaza partículas de virus (PF O'Neil and ES Balkovic (1993) Bio-Technology 11(2) .-173-178) . Permanece como deseable proporcionar métodos para tratamiento de preparaciones que contienen herpes virus, especialmente procesos de purificación adicionales capaces de contribuir a la manufactura de preparaciones de virus infeccioso con buen rendimiento y pureza, por ejemplo, aquellos que se van a utilizar en vacunas.

RESUMEN Y DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la invención, las preparaciones de herpesvírus se pueden purificar de manera útil por purificación de afinidad en una fase sólida (reactivo de unión de afinidad) que une competitivamente materiales con afinidad por heparina. La invención es, por ejemplo, especialmente aplicable a preparaciones infecciosas de herpesvirus humano tales como virus de herpes simplex (HSV) , por ejemplo HSV tipo 2, el cual tiende a permanecer fuertemente asociado a las células cuando crece en cultivo. El reactivo de afinidad que presenta al virus, el cual se puede aplicar desde un líquido portador que contiene sal (por ejemplo cloruro de sodio u otra sal farmacéuticamente aceptable superior a aproximadamente 0.4M) o que contiene heparina u otro polisacárido sulfatado o sulfonatado (por ejemplo en el orden de aproximadamente 10-250, por ejemplo aproximadamente 50, micro-g/ml) después se puede lavar adecuadamente y el virus se recupera en forma infecciosa activa por el elución, por ejemplo, con una solución salina de alta concentración o con un polisacárido sulfatado o sulfonado. Los ejemplos de fases sólidas adecuadas para uso a este respecto incluyen una fase sólida que presenta heparina, y fases sólidas con funcionalidad de unión similar, por ejemplo, preferiblemente una funcionalidad .de unión de polisacárido sulfatado (o sulfonado) . Los reactivos de unión por afinidad adecuados pueden presentar grupos de unión que contienen sulfato o sulfonato junto con grupos polares no iónicos. Por ejemplo, los polísacáridos sulfatados contienen grupos sulfato y grupos hidroxi. Los ejemplos de fases sólidas que presentan polisacáridos sulfatados incluyen sulfato de dextrano o sulfato de heparina '. Preferiblemente, los grupos sulfato o sulfonato se pueden transportar en cadenas laterales, por ejemplo cadenas laterales poliméricas, en relación al material de la fase sólida, y por lo tanto pueden ser diferentes a resinas y esferas de polímeros reticuladas que se han derivatizado directamente con tales grupos ácidos. Las fases sólidas que presentan otros agentes de unión que comprenden sulfato o que comprenden sulfonato a los ya mencionados, tales como copolímeros de urea y ácido difenildisulfónico, o sulfato de protamina, también se pueden utilizar. En un aspecto preferido de la invención, la purificación por afinidad puede formar parte de un proceso para producir preparaciones purificadas de herpesvirus, la cual comprende las etapas de: (i) cultivar células huéspedes infectadas con el virus, por ejemplo células huéspedes de mamífero adecuadas tales como células Vero o células MRC5, o células recombinantes derivadas de células Vero, preferiblemente cultivadas en microportadores e infectadas con HVS-2 (o en modalidades adicionales, células infectadas con otros virus tales como VZV) , (ii) cosechar el virus del cultivo, preferiblemente por un proceso de elución, por ejemplo utilizando un eluyente polisacárido sulfatado tal como sulfato de dextrano o sulfato de heparina, o un eluyente salino, y (iii) purificar por afinidad el virus cosechado utilizando una fase sólida que presenta un agente de unión por afinidad sulfatado, preferiblemente uno de los identificados antes, por ejemplo un polisacárido sulfatado, por ejemplo heparina, para el virus . En un aspecto adicional de la invención, un agente preferido para la liberación de herpesvirus de células de cultivo de células infectadas con virus, por ejemplo células Vero, comprende sulfato de dextrano. Un ejemplo de una preparación de sulfato de dextrano adecuada para uso en esta invención tiene, por ejemplo un peso molecular de aproximadamente 5,000, pero se pueden elegir diversas preparaciones . Un ejemplo de una forma adecuada de fase sólida que presenta heparina para la etapa de purificación por afinidad comprende un material de cromatografía en columna Pharmacia Heparin HP (basado en un gel de agarosa altamente reticulado) (por ejemplo de un diámetro de aproximadamente 34 micrómetros) que se puede obtener de Pharmacia Biotech en forma de columnas preparadas HiTrap (TM) . También se puede esperar que sean adecuadas muchas otras preparaciones en fase sólida derivadas de heparina o sulfato de heparina. Un ejemplo adicional y actualmente preferido de un reactivo de unión por afinidad para el uso de la invención presenta cadenas de poliacrilamida pendientes sustituidas por grupos sulfoisobutilo, por ejemplo, que comprende agrupamientos tales como -CO.NH. C (CH3) 2. CH2. S03. Un ejemplo adecuado y preferido de tal reactivo de afinidad es, por ejemplo, el disponible comercialmente de Merck (Darmastadt, Alemania) bajo la designación Fractogel (TM) EMD S03 650 (M) y se basa en ceras de poliacrilamida las cuales han sido diseñadas para proporcionar, por ejemplo, unidas covalentemente a las mismas, cadenas de poliacrilamida pendientes en las cuales muchos de los grupos amida están sustituidos por grupos sulfoisobutilo. Un ejemplo adicional de un reactivo de unión por afinidad útil es una preparación de esferas de Sephacryl (TM: Pharmacia) que tienen grupos de sulfato de dextrano de aproximadamente 106 m. ., unido de manera tentacular a las mismas, es decir, unidas covalentemente a las mismas y que se proyectan desde la superficie de las esferas. La invención también proporciona en otro aspecto, como un intermediario en la purificación de herpesvirus, una preparación de un reactivo de afinidad como se establece en lo anterior, que presenta el herpesvirus infeccioso unido al mismo. Por lo tanto, las preparaciones de herpesvirus de pueden purificar de manera útil por purificación de afinidad en una fase sólida que presenta heparina, o sobre una fase sólida con funcionalidad de unión similar, preferiblemente una funcionalidad de unión de polisacárido sulfatado; es decir, una fase sólida que puede unir competitivamente materiales con afinidad por heparina. Los ejemplos de tales fases sólidas son aquellos que presentan polisacárido, por ejemplo sulfato de dextrano o sulfato de heparano (heparina) . Alternativamente, se pueden utilizar fases sólidas que presenten otros agentes de unión que comprendan sulfato tales como copolímeros de urea y ácido bifenildisulfónico o sulfato de protamina. La purificación de afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un eluyente de gradiente salino, por ejemplo de 0.1M a 1.5M de NaCl amortiguado. Alternativamente, el material de virus se puede aplicar en condiciones salinas relativamente altas, por ejemplo de aproximadamente 0.8M o en presencia de heparina o de sulfato de dextrano, y el procedimiento puede comprender una etapa de lavado a una concentración de NaCl de aproximadamente 0.7M seguido por una etapa de elución de NaCl a aproximadamente 1.5M. Con frecuencia no hay necesidad de dializar una preparación de virus rica en sal antes de aplicarla a la columna de heparina. Las concentraciones precisas de sal con frecuencia no son críticas por si mismas, y se pueden ajustar fácilmente y optimizar de acuerdo con los detalles de los otros reactivos y condiciones. La purificación por afinidad típicamente se puede llevar a cabo en una preparación de virus que se ha obtenido de un cultivo de células huéspedes infectadas adecuadamente tales como células Vero. La cosecha inicial del virus de tal cultivo celular se puede llevar a cabo en cualquiera de diversas formas. Los ejemplos de métodos utilizables (aunque menos preferidos) incluyen la ruptura celular, por ejemplo por ciclos de congelado-recalentado o por procedimientos de tensión osmótica, por ejemplo, con solución salina hipotónica o soluciones de glicerol; de manera un poco más preferible, un rendimiento de virus superior con menores cantidades de proteína contaminante con frecuencia se pueden obtener utilizando sonicación. Sin embargo, de manera más preferible, la cosecha inicial de los virus del cultivo se puede llevar a cabo sin ruptura sustancial de células, por ejemplo mediante la utilización de elución por heparina o sulfato de dextrano o equivalente, o bien mediante la utilización de elución con solución salina. Puede ser conveniente pasar tal preparación viral cosechado inicialmente a través de un filtro de membrana, por ejemplo, un filtro de membrana de aproximadamente 5 micrómetros o más fino, para proporcionar una suspensión viral clarificada antes de la purificación por afinidad. Utilizando los ejemplos de la invención, por ejemplo como se describe después, es posible preparar fracciones virales que contengan niveles reducidos y útiles de ADN y proteína en relación al título de virus. El producto viral de la purificación por afinidad, si se desea, se puede someter a cualquier otra etapa de purificación elegida adicional. Puede ser especialmente útil incluir una etapa de esterilización por filtro, por ejemplo, con un filtro de poro fino del orden de aproximadamente 0.22 micrómetros de tamaño de poro. En los ejemplos actualmente preferidos de la presente invención, la purificación por afinidad se puede llevar a cabo en el producto de un cultivo celular infectado con un herpesvirus, después de tratamiento previo del cultivo por una incubación de cosechado con un polisacárido sulfato, por ejemplo, con sulfato de dextrano o una solución de sulfato de heparina, para proporcionar una suspensión viral. La solución de polisacárido sulfato se puede poner en contacto con el cultivo celular, por ejemplo a una concentración en el orden de aproximadamente 50 microgramos/ml para el sulfato de heparina o de aproximadamente 100 microgramos/ml para sulfato de dextrano, por ejemplo en amortiguador de citrato pH 7 durante un período de contacto en el orden de aproximadamente 3 horas, para proporcionar un líquido que contiene un contenido de virus útil y un contenido muy reducido de células o de residuos celulares en comparación con (por ejemplo) el producto de ruptura ultrasónica. Este proceso puede ser, por ejemplo, particularmente aplicable para proporcionar un rendimiento mejorado de virus para la elaboración de una vacuna de virus viva. Alternativamente, pero de manera menos preferida actualmente, se puede utilizar en esta etapa una solución salina acuosa hipertónica, por ejemplo cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio u otros. Preferiblemente, tal solución salina puede comprender cloruro de sodio, por ejemplo, a aproximadamente 0.8 a 0.9M de concentración o superior. Si se utiliza el sulfato de sodio, la concentración preferiblemente puede ser de aproximadamente 0.4M o superior. Se pueden utilizar otras sales, si se desea, a osmolaridad o fuerza iónica similares a la de las concentraciones indicadas antes. El virus puede con frecuencia resistir una concentración salina 1M o 2M, pero en cada caso, se prefiere no sobrepasar la concentración indicada antes, de manera que se evite proteína celular excesiva en el líquido salino. El amortiguador y otros constituyentes se pueden elegir adecuadamente de acuerdo con la práctica normal para el manejo de los virus relacionados . La incubación de cosechado se puede llevar a cabo con agitación suave, y preferiblemente se lleva a cabo de manera tal que involucra una ruptura celular nula o mínima . El cultivo celular que se va a tratar para incubación para cosechado puede ser, por ejemplo, un cultivo de monocapa o un cultivo de microportador, o bien un cultivo de botella giratoria. El polisacárido de sulfato de cosechado, por ejemplo sulfato de dextrano o una solución salina, se puede amortiguar y mantener a un pH y temperatura en si mismos adecuados para el cultivo de las células infectadas con virus, por ejemplo, de aproximadamente pH 7 con amortiguador de citrato y de manera ventajosa de aproximadamente 34 °C, para herpesvirus tales como virus de herpes simplex. Un tiempo de contacto entre las células cultivadas y el líquido de cosechado no es especialmente crítico y por ejemplo puede estar en el intervalo de aproximadamente 2-24 horas. Se ha encontrado respecto a ciertos ejemplos que, por ejemplo, es preferible un tiempo de contacto de aproximadamente 4 horas, debido a que puede proporcionar un buen rendimiento con bajos niveles aceptables de proteína celular. Después del contacto entre las células infectadas cultivadas y el líquido cosechado, el líquido que contiene las partículas de virus cosechadas se puede separar por decantación o por cualquier otro método adecuado: las células cultivadas en si mismas se puede permitir que permanezcan unidas a la superficie en la cual se cultivan, y se pueden desechar después de la separación del líquido de cosechado. El líquido de cosechado después puede ser tratado, si se desea, por filtración o centrifugación, o ambas cosas, para remover las células residuales. Si se desea cambiar el medio en el cual está contenida la preparación de virus cosechado, esto se puede realizar por dilución o diafiltración, por ejemplo, hasta la concentración aproximadamente isotónica, por ejemplo de aproximadamente 138 mM en cloruro de sodio amortiguado.

De acuerdo con otro rasgo adicional que se puede aplicar a un proceso de acuerdo con la invención, la preparación de virus cosechada de esta manera se puede tratar con una enzima nucleasa ya sea antes (o menos preferiblemente después) de la purificación por afinidad para reducir cualquier contenido de ácido nucleico contaminante a niveles aceptables . El liquido que contiene virus puede ser tratado, por ejemplo, con la enzima de nucleasa Benzonase (TM) , para degradar ácidos nucleicos libres (de manera importante ADN, y habitualmente también ARN) , hasta aproximadamente 50 unidades/ml en presencia de ion magnesio aproximadamente 2-10 mM, ya sea hasta por aproximadamente 1 hora a una temperatura desde aproximadamente 4°C hasta la temperatura ambiente. El nivel de enzima nucleasa -y otra proteína se puede reducir, por ejemplo, ya sea por la etapa de purificación de afinidad como se describe aquí o por otro medio tal como, por ejemplo, diafiltración contra un amortiguador de formulación adecuado, a través de una membrana con un límite de exclusión de 500 kD. Después de tales tratamientos, el virus cosechado se puede transferir a un líquido portador deseado, y se puede congelar, secar en congelamiento/liofilizar o estabilizar de alguna otra manera de cualquier modo adecuado. Generalmente, el herpesvirus se puede formular con un portador o excipiente o farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente se puede esterilizar o congelar o liofilizar, por ejemplo se puede congelar a aproximadamente -80°C para uso como una vacuna. Por lo tanto, la invención se puede utilizar en la producción de vacunas estabilizadas que contienen herpesvirus infeccioso tal como el virus de herpes simplex humano, por ejemplo HSV tipo 2, por ejemplo en forma de un mutante genéticamente incapacitado de tal virus . Los procesos de acuerdo con los ejemplos de la invención pueden ofrecer ventajas particulares respecto a virus altamente asociados a células, es decir, aquellos virus que tienen un grado particularmente alto de asociación celular en cultivo, por ejemplo, virus de herpes simplex tipo 2 (HSV-2) , herpesvirus bovino (BHV) , herpesvirus de pavo y virus de varicela zoster (VZV) , algunas veces también para virus de pseudo-rabia (PRV) . Con ciertos herpesvirus y condiciones de cultivo (por ejemplo con virus de herpes simplex tipo 1 (HSV-1) o PRV) , puede haber una liberación espontánea . sustancial de virus de células infectadas a líquido de cultivo celular, de manera que la aplicación de una etapa de proceso de liberación utilizando un polisacárido sulfatado o solución salina como se describe aquí puede ser innecesario, y en consecuencia, los ejemplos de la invención pueden omitir tal etapa antes de aplicar el líquido que contiene virus del cultivo celular a la etapa de purificación por afinidad.

La invención se puede aplicar con cualquier adaptación apropiada de detalle como será fácilmente accesible para aquellos expertos en la técnica, para herpesvirus de diversos tipos que incluyen, por ejemplo, virus de herpes simplex tipo silvestre y virus de herpes genéticamente incapacitados tales como virus de herpes simplex, y por ejemplo otros virus de herpes como se menciona en los documentos que se describen aquí . Las preparaciones de virus obtenidas mediante el uso de las etapas de procesamiento como se describen aquí se pueden procesar adicionalmente y se pueden volver parte de las composiciones farmacéuticas, por ejemplo, con ingredientes convencionales per se de vacunas de virus. La invención se describe e ilustra adicionalmente por el siguiente ejemplo no limitante.

EJEMPLO Un proceso de acuerdo con un ejemplo de la invención, para cosechar y purificar partículas de virus, puede hacer uso de un cultivo de células Vero infectadas con HSV-2 (por ejemplo, un mutante carente de gH, de HSV2 , como se describe en WO 94/21807 para uso de vacuna, que crece esencialmente de una manera conocida en un medio de cultivo convencional contenido en frascos giratorios, a aproximadamente 100 ml de medio por frasco. El medio de cultivo, el tipo de célula y las condiciones de cultivo pueden ser, por ejemplo, como sigue. Las células Vero se pueden someter a pasajes a 2 x 107 células por frasco giratorio. El cultivo se puede llevar a cabo utilizando medio DMEM con 4.5 g/1 de glucosa sin piruvato de sodio y con Glutamax-1 (TM) (L-alanil-L-glutamina) , 862 mg/1, la incubación se puede llevar a cabo, por ejemplo, de aproximadamente 37°C y durante aproximadamente 120 horas (5 días) . Los cultivos de células confluentes después se pueden infectar con HSV-2 a una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.01, al diluir el virus en DMEM hasta un nivei en donde se agrega 1 ml a cada frasco giratorio el cual después se regresa al aparato de incubación giratorio a aproximadamente 34-37°C. Cuando se observa que el efecto citopático es de 80-100%, por ejemplo a las 65-72 horas-después de la infección, los frascos giratorios se tratan como si estuvieran listos para cosecha de virus . El medio de cultivo se puede decantar de cada frasco y se puede sustituir por 10 ml por frasco de una solución amortiguadora de cosechado que contiene citrato de sodio 0.01M, pH 7.0 y aproximadamente 50 microgramos/ml de sulfato de heparina, o bien aproximadamente 100 microgramos/ml de sulfato de dextrano. Las células en el frasco giratorio en contacto con esta solución amortiguadora de cosechado se puede hacer girar e incubar a aproximadamente 34 °C durante aproximadamente 4 horas . Las células cultivadas por si mismas en el frasco giratorio pueden permanecer unidas en gran medida a la superficie del frasco y se pueden desechar después de la separación del líquido que contiene las partículas de virus cosechadas . El líquido en el frasco, que comprende una solución cosechadora amortiguada y un material del cultivo de células en suspensión, que incluyen virus, se puede remover de la pipeta y se centrifuga a aproximadamente 3000 rpm en una centrifuga Sorvall RT6000 (TM) durante aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, a una RFCmax de aproximadamente 1876) . Las células en el sedimento, y las que permanecen en la botella, se desechan (bajo condiciones-apropiadas de contención de virus) y el sobrenadante es tomado por la pipeta para la siguiente etapa, la cual puede ser centrifugación de flujo continuo. La filtración previa se puede llevar a cabo, por ejemplo, con un filtro que tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0.8-5 micrómetros (no crítico) para proporcionar una suspensión viral clarificada, antes de la purificación por afinidad. El líquido sobrenadante de la centrifugación se puede diluir o diafiltrar hasta una concentración final (con respecto del ion sodio) de 138 mM (en ciertas modalidades de la invención, el líquido diluido puede ser tratado, opcionalmente si se desea, con una enzima nucleasa Benzonase (TM) , para degradar ácidos nucleicos libres (la enzima actualmente preferida de manera importante tiene actividad de ADNasa, y habitualmente también, similar a Benzonase (TM) , y tendrá actividad de ARNasa) hasta aproximadamente 50 unidades/ml en presencia de ion magnesio de aproximadamente 2-10 mM, por ejemplo durante aproximadamente 1 hora a una temperatura desde aproximadamente 4°C hasta la temperatura ambiente. Sin embargo, con frecuencia se puede encontrar que la etapa de purificación por afinidad puede reducir suficientemente el contenido de ADN en el material de manera que es innecesaria una etapa de tratamiento de ADNasa separada. Además, si se utiliza Benzonase o una enzima similar, necesita tenerse cierta precaución en vista de la afinidad de la enzima por heparina y una columna de heparina y materiales similares, es deseable en tal caso seguras condiciones de manera que el eluato de virus final de la columna de afinidad este sustancialmente libre de la enzima Benzonase) . El líquido intermedio que contiene virus puede ser purificado en un material de cromatografía en columna Pharmacia Heparin HP (basado en gel de agarosa altamente reticulado) (por ejemplo de un diámetro de aproximadamente 34 micrómetros) obtenible de Pharmacia Biotech en columnas preparadas HiTrap (TM) . La tasa de aplicación de virus puede ser, por ejemplo por 5 ml de material de columna, por ejemplo aproximadamente 300 ml a una concentración de virus de aproximadamente 8 x 106 ufp/ml, alimentado a una velocidad de flujo de aproximadamente 1.3 ml/min. Utilizando esta forma de columna en un ejemplo de esta etapa de purificación, con un gradiente salino que comienza en aproximadamente NaCl 138 mM e incrementándose a NaCl 1.5M, por ejemplo, durante aproximadamente 10 volúmenes de columna, la saturación viral en el eluato se produce a aproximadamente 230 minutos de flujo, punto en el cual han pasado aproximadamente 3.5 x 109 ufp dentro de la columna y aproximadamente 1.2 x 108 ufp han aparecido en el eluato. Se espera que teóricamente se puedan acomodar aproximadamente 1013 ufp/ml de virus, en este material de columna absorbente, en la práctica digamos a aproximadamente 1-2 x 109 ufp/ml. Alternativamente, el reactivo de afinidad pueden ser esferas de Fractogel (TM) EMD S03 650 M de Merck (Darmastadt) como se describe antes, utilizadas de manera generalmente similar, por ejemplo el virus se puede aplicar en un líquido portador que contiene, por ejemplo, aproximadamente 0.8M de cloruro de sodio o 50 microgramos/ml de heparina, y después del lavado se eluye con eluyente que contiene cloruro de sodio 1.5M. En un ejemplo adicional de esta etapa, una preparación de virus HSV-2 liberada de un cultivo de células Vero en heparina (Monoporin (TM) heparina grado farmacéutico inyectable de peso molecular bajo, 50 micro-g/ml en fosfato pH 7, 10 mM y NaCl 138 mM) se centrifuga a aproximadamente 3000 rpm (c. 1000 g) durante 10 minutos y después se filtra a través de un filtro de 5 micrómetros. Se prepara una columna de heparina como ya se ha mencionado mediante lavado con 5 volúmenes de columna de solución salina amortiguada con fosfato. Se cargan aproximadamente 100 ml de filtrado de virus (aproximadamente 7 x 107 ufp/ml) en la columna. Después del lavado con 5/10 volúmenes de columna de solución salina 0.7M amortiguada, el virus se eluye fraccionariamente con solución salina amortiguada 1.5M y se recolectan las fracciones que contienen el tipo indicado por absorción a 260 nm. El producto resultante tiene (por 107 ufp de virus) menos de 2 ng de ADN y menos de 1 micro-g de proteína, y se recolecta a una concentración de aproximadamente 2 x 109 ufp/ml. Se debe diluir hasta concentración isotónica de aproximadamente 108 ufp/ml, y se congela o se almacena o utiliza de alguna otra manera. Parece que se puede obtener una buena recuperación de virus a partir de la columna. En ciertos contextos de uso (actualmente menos preferidos) , como una etapa de purificación adicional opcional, si se desea, el líquido intermediario que contiene virus se puede someter a una filtración de flujo transversal tangencial (diafiltración) por ejemplo, utilizando un filtro/membrana con un límite de exclusión de 500 kD en un dispositivo de flujo transversal tangencial Filtron (TM) u otro dispositivo, utilizando una tasa de recirculación de 1000 ml/min, una velocidad de filtrado de 100 ml/min, y una retrodescarga de 100 ml de citrato de sodio, pH 0.01M, 7.25 que contiene cloruro de sodio 138 mM. El retenido de la etapa de ultrafiltración de flujo cruzado opcionalmente, si se desea, se puede tratar por diafiltración contra 5-10 volúmenes de citrato/amortiguador salino, y el retenido finalmente se somete a filtración de 0.2 micrómetros (esterilización) precedida opcionalmente por filtración con un filtro desde aproximadamente 0.45 micrómetros hasta 5 micrómetros, utilizando nuevamente el mismo amortiguador. Si se desea, esta etapa se puede utilizar para elaborar el líquido que contiene la preparación de virus hasta aproximadamente 20 mg/ml en un estabilizador adecuado tal como una proteína estabilizante, por ejemplo albúmina sérica humana, a aproximadamente 20 mg/ml. Algunas veces puede ser útil prelavar los filtros con un líquido que contiene el mismo estabilizador en el mismo amortiguador, antes de utilizar los filtros para tratar la preparación de virus. El producto resultante se puede obtener como una suspensión de partículas de virus en amortiguador salino y estabilizante tal como proteína estabilizante, en la cual el nivel de ADN residual puede ser satisfactoriamente bajo. Se ha encontrado que el rendimiento del proceso tal como se acaba de describir es útilmente bueno, por ejemplo en comparación con procesos que involucran ruptura ultrasónica de células para liberar las partículas de virus, seguido por separación de las partículas- de virus de los residuos celulares. La invención se puede aplicar de manera útil, por ejemplo, en una modalidad preferida que se lleva a cabo de acuerdo con el ejemplo descrito antes, para el cultivo y cosechado de virus HSV-2 incapacitado genéticamente, para uso en una vacuna, virus el cual tiene una supresión con respecto al gen gH esencial para la producción de partículas virales infecciosas nuevas, y es cultivable en una línea de células la cual se basa en células Vero, las cuales se han vuelto recombinantes y son capaces de expresar el gen gH viral no se encuentra en el genoma .viral, por ejemplo, como se describe en las especificaciones WO 92/05263 y WO 94/21807 (y véase también A Forrester et al, J. Virol 66 (1992) 341-348, además H E Farrell et al, J Virol 68 (1994) 927-932) y C McLean et al. J. Infect Dis 170 (1994) 1100-1109) . La presente invención y descripción se extiende a los métodos y composiciones asi como a los productos resultantes como se describen aquí, y a modificaciones y variaciones de las etapas y rasgos mencionados y descritos en la presente descripción y reivindicaciones, que incluyen todas las combinaciones y subcombinaciones de las etapas y rasgos de la misma, y que incluyen variaciones en el orden y la selección de etapas, así como los documentos mencionados aquí los cuales se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para purificar una preparación de herpesvirus, por ejemplo una preparación de virus de herpes simplex humano (HSV) tipo 2, cultivado e infeccioso, el cual comprende: (a) cultivar células huéspedes infectadas con el virus, (b) cosechar el virus del cultivo por elución utilizando un eluyente capaz de liberar virus del cultivo, (c) poner en contacto el eluato que contiene virus que se va a purificar, con un reactivo de unión por afinidad que comprende una fase sólida que presenta un grupo de unión- que comprende sulfato o sulfonato que puede unir materiales con afinidad por heparina, por lo que une al virus con el reactivo de unión por afinidad, (d) lavar el reactivo de unión por afinidad que presenta el virus, y (e) eluir al virus del reactivo de unión.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente capaz de liberar el virus del cultivo contiene solución salina.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente capaz de liberar al virus del cultivo contiene heparina o sulfato de heparina.

. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende la etapa adicional de mas tarde formular el herpes virus con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente esterilizar y congelar o liofilizar la preparación.

5. El proceso de conformidad con una de - las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el reactivo de unión por afinidad presenta grupos de unión que contienen sulfato, por ejemplo grupos de unión que contienen sulfato y grupos polares no iónicos.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el reactivo de unión por afinidad presenta grupos polisacáridos sulfatados, por ejemplo grupos de heparina o de sulfato de dextrano.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el reactivo de unión por afinidad presenta cadenas de poliacrilamida pendientes sustituidas por grupos sulfoisobutilo.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus se aplica al reactivo de afinidad a partir de un líquido que contiene cloruro de sodio u otra sal farmacéuticamente aceptable' en una concentración mayor de aproximadamente 0.4M, o un polisacárido sulfatado o sulfonado, y la elución se lleva a cabo con un eluyente que contiene ya sea un eluyente polisacárido sulfatado o sulfonado, o bien un eluyente salino.

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 u 8, caracterizado pprque el reactivo de afinidad utilizado en la etapa (iii) es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza para la producción de una vacuna que contiene herpesvirus infeccioso, por ejemplo virus de herpes simplex tipo 2.