MXPA06000056A - Preparaciones de virus y metodos - Google Patents

Abstract

Se exponen los métodos para la preparación de un virus herpético, tal como por ejemplo el virus de herpes simplex tipo 2 para uso en vacuna. Estos virus se pueden desarrollar en medios exentos de suero o que contengan suero y se pueden preparar a partir del sobrenadante que contenga el virus o las células que contengan virus. El virus se prepara para formulación farmacéutica posterior mediante los métodos que pueden incluir el tratamiento con reactivos de afinidad en fase sólida que contienen grupos de unión que comprenden sulfato o sulfonato. Se pueden utilizar estos grupos de polisacárido sulfatado como heparina o dextrano sulfato, y se eluyen con soluciones salinas. El proceso se puede combinar con otros pasos de cultivo, recolección y formulación.

Description

PREPARACIONES DE VIRUS Y MÉTODOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN.

Campo de la Invención. Esta invención se relaciona con la producción, la recolección y la purificación de virus proveniente de cultivos celulares infectados con virus, por ejemplo para fines experimentales y terapéuticos, por ejemplo para la producción de formulaciones farmacéuticas tales como por ejemplo, inoculaciones profilácticas o terapéuticas. En aspectos particulares, la invención se relaciona con los métodos y arreglos para la producción de preparaciones de virus herpéticos. Otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la descripción proporcionada más adelante. (2) Descripción de la Técnica Relacionada incluyendo la información expuesta de conformidad con el 37 CFR 1.97 y el 37 CFR 1.98. Se conocen diversos métodos para producir preparaciones de virus vivos, todos incluyen la extracción de los virus provenientes de una célula infectada por el virus, por e emplo Células Vero o P05/045-AOX células MRC5 entre otras, para fines de vacuna, terapéuticos y otros. La Patente de los Estados Unidos. No. 3,985,615 (Osaka Research Foundation: T Kubo et al) muestra la producción de virus vivos atenuados de varicela para uso en vacunas mediante cultivo que comprende el subcultivo en células primarias de tejido embrionario de cobayo. La Patente de los Estados Unidos. No. 5,024,836 (Merck: J McAleer et al) se relaciona con la producción de preparaciones de vacuna liofilizada con base en la misma. También se expone el hecho de que se sabe que las soluciones acuosas de vacunas de virus vivos son inestables durante el almacenamiento. DD-209738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) ilustra la producción de otro tipo de virus herpético, para uso como vacuna contra la enfermedad de Marek. El virus herpético se produce al (a) cultivar células de embrión de pollo exentas de patógenos específicos en microesferas de dextrano; (b) inocular el cultivo a una confluencia del 801 con la cepa del virus herpético de pavo FC-126 (clon 1, Illb); (c) recolectar las células infectadas en medio de SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato, fragmento de albúmina bovina V) cuando el efecto citopático es del P05/045-AUX 80%; (d) someter la suspensión a tres pulsos ultrasónicos con duración de 1 minuto a intervalos de 2 minutos y centrifugarla para recuperar un primer cultivo de vacuna; (e) volver a suspender el sedimento en medio SPCA y repetir el paso (d) para obtener un segundo cultivo de vacuna (para aumentar el rendimiento de la vacuna casi al 2%) ; (f ) congelar las vacunas combinadas a -100°C. antes de determinar la concentración del virus; y (g) diluir el medio SPCA y liofilizar. La JP06234659-A (Z H el Handai Bis eibut subyo Kenkyukai) describe, en un ejemplo, la producción de la vacuna herpesviral en células MRC-5 de fibroblasto diploideo humano cultivadas en medio MEM a 37°C., que comprende la inoculación del virus sembrado con la cepa Oka del virus de varicela a un MOI de 0.03 para células MRC-5 y cultivar a 37°C. durante 2 dias . El virus luego se suspende en una solución que contiene 6.4 g de NaCl, 0.16 g de KC1, 2.3 g de Na2HP04 12H20, 0.16 g de KH2P04, 50.0 g de sacarosa, 1.0 g de Na L-gluta ato, 2.0 de gelatina, 25.0 g de hidrolizado gelatinoso y 0.1 g de EDA-3Na por L. La EP 0 573 107, la Patente de los Estados Unidos. No. 5,360,736 y la Patente de los Estados Unidos. No. 5,607,852 (Merck: P A Friedman et al) P05/045-AOX describen los procesos para la producción de una vacuna con el virus atenuado de varicela zoster, incluyendo un proceso para preparar una vacuna en vivo con el virus de varicela-zos t er (VZV) exenta de células atenuadas, que comprende: (a) Cultivar células susceptibles de infección con el VZV, seleccionadas de células diploideas humanas, para confluencia en cultivo monocapa, bajo condiciones de nutrición suficientemente altas para alcanzar un alto grado de replicación celular, y suministrar un disacárido que no se pueda metabolizar; (b) infectar las células cultivadas de acuerdo con el paso (a) tan cerca del punto de confluencia como sea posible con una multiplicidad de infección tan alta de células infectadas con el VZV como sea práctico; (c) mantener el cultivo infectado con el VZV en un estado de alta nutrición durante aproximadamente 22-96 horas y recolección en el punto máximo de producción del VZV infeccioso; (d) lavar el cultivo infectado con el VZV con una solución fisiológica, que contenga opcionalmente un agente lisosomotrópico, tal como por ejemplo, cloruro de amonio o cloroquina, antes de recolectar las células infectadas con el VZV; (e) Recolectar las células infectadas con el VZV en un volumen mínimo de una solución estabilizante y P05/045-AUX cualquier descomposición de las células inmediatamente o al congelar las células para una descomposición posterior, (1) Descomponer las células infectadas con el VZV para liberar óptimamente el VZV asociado con células, y eliminar los residuos celulares, para proporcionar una preparación del VZV exenta de células. El proceso se propone para la producción en volumen de la vacuna en vivo. El medio nutriente adecuado para las células en crecimiento en el cultivo monocapa en esa conexión se describe que consiste esencialmente del medio SRFE-2 suplementado con entre 0.2 mg/mL y 0.4 mg/mL de lípido de soya y 10% de suero fetal de ternero, las células se seleccionarán a partir de células MRC-5, células WI-38 y células Vero. La Patente de los Estados Unidos. No. ,665,362 (Cantab Pharmaceuticals Research: SC Inglis et al) y la Patente de los Estados Unidos. No. 5,837,261 (Cantab Pharmaceuticals Research: SC Inglis et al) exponen células reco binantes y métodos de cultivo para producir virus herpéticos inhabilitados genéticamente tales co o por ejemplo, virus de herpes simplex para fines de vacuna, en donde el virus se desarrolla en células complementarias.

P05/045-AÜX La Patente de los Estados Unidos. No. 6,267,967 (Cantab: M D Johnston et al) describe los procesos para la purificación del virus de herpes simplex. Las preparaciones infecciosas de virus herpéticos humanos tales como por ejemplo, el virus de herpes simplex (HSV), por ejemplo HSV tipo 2 (HSV-2), que tiende a permanecer fuertemente asociado con las células cuando se desarrolla en cultivo y reactivo de afinidad que porta el virus, que se puede aplicar a partir de una sal que contiene el líquido portador (por ejemplo cloruro de sodio u otra sal farmacéuticamente aceptable a más de aproximadamente 0.4M) o que contiene heparina u otro polisacárido sulfatado o sulfonado (por ejemplo en el orden de aproximadamente 10-250, tal como por ejemplo, aproximadamente 50, micro-g/mL) , entonces se puede lavar adecuadamen e y el virus se recupera en forma activamente infecciosa mediante elución, por ejemplo con solución a concentración alta de sal o con el polisacárido sulfatado o sulfonado. La recolección inicial del virus proveniente de este cultivo celular se puede llevar a cabo en cualquiera de una variedad de formas. Los ejemplos de los métodos incluyen la descomposición celular, por ejemplo mediante ciclos de congelación-descongelación o procedimientos de P05/045-AÜX tensión osmótica, por ejemplo con solución salina hipotónica o soluciones de glicerol, tratamiento con ultrasonidos, elución por heparina o sulfato de dextrano o equivalente, o al utilizar elución con solución salina. La Patente de los Estados Unidos 6,013,265 (UMB: L Aurelian), incorporada en la presente como referencia, o la Patente de los Estados Unidos 6,054,131 (UMB: L Aurelian), incorporada en la presente como referencia, exponen un virus reco binante de herpes simplex con desarrollo comprometido, por ejemplo el HSV-2 en el cual se ha suprimido el dominio PK. En un virus de HSV-2 tipo silvestre, la replicación empezó a las 2 horas después de la infección y alcanzó niveles máximos a 36 horas después de la infección. En el HSV-2 con PK suprimido, el principio de la replicación no se observó hasta 15 horas después de la infección en células Vero suplementadas tanto con suero al 10% como con suero al 0.5%. Cuando la replicación se reasumió este mutante alcanzó concentraciones similares a aquellas del HSV-2 a las 36 horas después de la infección en presencia de suero al 10%, pero no en células suplementadas con suero al 0.5% en el medio.

P05/045-ADX Sigue siendo conveniente proporcionar métodos para la producción de preparaciones que contengan virus herpéticos, capaces de contribuir a la fabricación de preparaciones de virus infecciosos en buen rendimiento y pureza, por ejemplo aquellos que se utilizarán en vacunas o como terapias. BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN. Las modalidades de la invención incluyen los procesos para preparar virus herpéticos para una vacuna o terapia, que comprenden (a) cultivar células hospederas infectadas con el virus, y (b) separar del medio las .células infectadas y (3) utilizar el sobrenadante para proporcionar una preparación viral adecuada para inmunoterapi a o vacunación de un animal . Por consiguiente, un objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento del virus herpético para utilizarse en una vacuna o terapia. Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento de virus herpéticos que sea simple, económico, y fácil de llevar a cabo. Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para P05/045-AUX el aislamiento de virus herpéticos que no implique la aportación de aditivos para ayudar en la purificación. Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento de virus herpéticos que no requiera la descomposición de células para producir el virus herpético . Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento de virus herpéticos que utilicen únicamente componentes económicos. Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el desarrollo de virus herpéticos que se realicen en ausencia de suero. Otro objetivo de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento de virus herpéticos que se realicen en ausencia de suero. Un objetivo final de las modalidades de la presente invención es proporcionar los procesos para el aislamiento de virus herpéticos que implique facilidad de obtención y reactivos económicos y sin efectos adversos en el ambiente.

P05/045-AUX DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De manera más sorprendente, hemos encontrado que un HSV-2 que tenga suprimido el dominio PK se transfiere fácilmente más allá de la pared celular de la célula en donde se haya desarrollado y se encuentra en abundancia en el fluido del cultivo así como también en la célula. Se encontró que los niveles de virus en cada área estarán dentro de 1 log de los niveles del otro y ya que el sobrenadante contiene 30-300 veces, más o menos, el volumen de la masa celular, el nivel disponible del virus es substancialmente superior en el sobrenadante que en la célula. Esto hace evidente la necesidad de la descomposición celular para liberar la partícula viral encontrada normalmente dentro de la célula infectada. La descomposición celular tiene las desventajas de requerir una purificación considerable de impurezas que consisten de componentes celulares y de reactivos agregados para efectuar la descomposición celular. Nuevamente, de manera más sorprendente, hemos encontrado que los medios celulares que están exentos de suero son compatibles con el desarrollo de un HSV-2 al que se le haya suprimido el dominio PK, incluso P05/045-AÜX aunque este mutante haya mostrado anteriormente que tendrá un desarrollo comprometido en medio que contiene suero fetal de ternero al 10% y no será reproductor en medio que contiene suero fetal de ternero al 0.5%. En las modalidades de la invención, los medios adecuados para la producción de virus incluyen, por ejemplo, EMEM con suero al 10%, o por ejemplo, VP-SFM (Invitrogen, Bethesda, MD) que tiene una concentración muy baja de proteína (5 µg/mL y no contiene proteínas o péptidos de origen animal o humano) pero que no contenga el factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF) e insulina recombinante humana o, como un ejemplo, RenCyte (InVitro Services and Systems, Góttingen, Alemania) que no tiene proteína o suero. Otros medios disponibles comercialmente que se podrían utilizar, por ejemplo, incluyen PC-1 o HL-1 (Cambrex Bioscience, alker sville , MD) que tiene insulina agregada . En las modalidades de la invención, las líneas celulares que apoyan el desarrollo limitado del HSV-2 recombinante con el PK suprimido incluyen las células mencionadas en la Patente de los Estados Unidos 6,013,265 (UMB:L Aurelian) o la Patente de los P05/045-AUX Estados Unidos 6,054,131 (UMB:L Aurelian) y de mayor preferencia son células Vero o MRC-5. En las modalidades de la invención, se obtiene un grado mucho mayor de pureza mediante el uso del sobrenadante celular según se opone a la descomposición de las células, debido a que las proteínas contaminantes se retienen dentro de la célula, y el ICPlOdeltaPK permite una concentración muy alta de partículas virales en el medio de crecimiento celular, por ejemplo hasta 109 ufp/ L. En las modalidades de la invención, la purificación de afinidad típicamente se puede llevar a cabo en un sobrenadante de virus que se haya obtenido a partir de un cultivo de células hospederas infectadas adecuadamente tales como por ejemplo, células Vero o MRC-5. Puede ser conveniente hacer pasar una preparación viral recolectada inicialmente a través de un filtro de membrana, por ejemplo en un filtro de membrana de aproximadamente 5 mieras o más fino, para proporcionar una suspensión viral clarificada, antes de la purificación de afinidad. Utilizando los ejemplos de la invención, por ejemplo como se describirá más adelante, es posible preparar fracciones virales que contengan niveles reducidos útilmente de ADN y proteína con relación a la P05/045-AUX concentración del virus. El producto viral de la purificación de afinidad si se desea se puede someter a cualesquiera pasos de purificación seleccionados adicionales. La preparación viral recolectada de esta forma se puede tratar con la enzima de nucleasa ya sea antes (o de menor preferencia después de) la purificación de afinidad, para reducir cualquier contenido de ácido nucleico contaminante a niveles aceptables. Las preparaciones virales obtenidas mediante el uso de los pasos de procesamiento, según se describe en la presente, se pueden procesar adicionalmente y hacer que formen parte de las composiciones farmacéuticas, por ejemplo con ingredientes convencionales per-se de vacunas virales u otros agentes farmacéuticamente aceptables útiles en los virus herpéticos estabilizantes. La invención se describe e ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitativo.

EJEMPLO 1 Un proceso de acuerdo con un ejemplo de la invención, para recolectar y purificar partículas virales, puede hacer uso de un cultivo de células Vero infectadas con el HSV-2 (por ejemplo un mutante P05/045-AUX con el PK suprimido del HSV2 como se describe en la Patente de los Estados Unidos 6,013,265 ( UMB : L Aurelian) o la Patente de los Estados Unidos 6,054,131 (UMB:L Aurelian) para uso en vacuna), y se desarrolla esencialmente de manera conocida en suero al 10% con medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado con suero fetal de ternero al 10% (FCS) y antibióticos. Las células Vero confluentes se infectaron con el HSV-2, ICP10 deltaPK (CS) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.01 y se incubó a aproximadamente 34°C. Cuando se observó que el efecto citopático será del 80-100%, por ejemplo 24-72 horas después de la infección, el cultivo se puede tratar cuando esté listo para la recolección del virus. Alternativamente, las células Vero se pueden infectar con el HSV-2 y se desarrollan según se dirige en un medio exento de suero tal como por ejemplo, VP SFM a partir de Invitrogen, Bethesda, MD o RenCyte (InVitro Services and Systems, Góttingen, Alemania ) . Para recolectar el virus, el medio de cultivo se decantó y se utilizó directamente o se purificó adicionalmente. También son adecuados para utilizarse niveles de virus utilizando RenCyte o VP- P05/045-AUX SFM. El medio que contiene el virus entonces se puede utilizar directamente para inmunizar y para uso farmacéutico, estabilizado con agentes de estabilización o se puede purificar adicionalmente. Por ejemplo, la pre-filtración se puede llevar a cabo por ejemplo con un filtro que tenga un tamaño de poro en la variación de 0.4-5 mieras (no decisivo) para proporcionar una suspensión viral clarificada, antes de la purificación de afinidad adicional. El sobrenadante líquido proveniente de la centrifugación se puede diluir o diafiltrar para obtener concentraciones iónicas adecuadas. El medio de cultivo opcionalmente se puede tratar con una enzima de nucleasa (Benzonase (TM) que tiene actividad DNasa, y actividad RNasa) hasta aproximadamente 50 unidades/mL en presencia de aproximadamente 2-10 mM de ion de magnesio, por ejemplo durante hasta aproximadamente 1 hora a una temperatura de aproximadamente 4°C. hasta la temperatura ambiente. Sin embargo, con frecuencia se puede encontrar que el medio de cultivo tiene un contenido suficientemente bajo de ADN que no es necesario un paso de tratamiento con DNasa por separado .

P05/045-AUX El líquido que contiene el virus se puede purificar adicionalmente en un material para cromatografía en columna con heparina HP de Pharmacia (con base en un gel de agarosa bastante reticulado) (por ejemplo con diámetro de aproximadamente 34 mieras) que se puede obtener de Pharmacia Biotech en la forma de columnas preparadas con HiTrap (TM) .

Alternativamente, el reactivo de afinidad puede ser perlas de Fractogel (TM) FMD S05 650 M de Merck (Darmstadt) como se describió anteriormente, utilizado de forma generalmente similar. En un ejemplo adicional de este paso, un sobrenadante de cultivo del virus HSV-2 se podría aplicar a una columna de heparina preparada lavando con solución salina amortiguada con fosfato. Aproximadamente 100 mL de preparación viral que contiene tanto como 108 ufp/mL se podría cargar a la columna. El virus se podría eluir fraccionalmente y se podrían recolectar las fracciones que contienen el virus concentrado. Si se desea, como un paso de purificación adicional opcional, el eluato que contiene el virus intermedio proveniente de la columna se podría someter a filtración de flujo cruzado tangencial (diafiltración ) por ejemplo al utilizar un P05/045-AUX filtro/membrana con un límite de exclusión de 500 kD en un Filtron (TM) u otro dispositivo flujo cruzado tangencial . El reténtate proveniente del paso de ultrafiltración de flujo cruzado, si se desea, opcionalmente se podría tratar mediante diafiltración contra un amortiguador de cit rato/solución salina, y el reténtate se sometió finalmente a filtración de 0.2 mieras (esterilización) precedida opcionalmente por filtración con un filtro entre aproximadamente 0.45 mieras y 5 mieras, utilizando el mismo amortiguador nuevamente. Si se desea, este paso se puede utilizar para preparar el líquido que contiene la preparación viral hasta aproximadamente 20 mg/mL en un estabilizador adecuado tal como por ejemplo, una proteína estabilizante, por ejemplo albúmina de suero humano a aproximadamente 20 mg/mL. Algunas veces puede ser útil prelavar los filtros con un líquido que contenga el mismo estabilizante en el mismo amortiguador, antes de utilizar los filtros para tratar la preparación viral. El producto resultante se puede obtener como una suspensión de partículas virales en un P05/045-AUX estabilizante, en el cual el nivel de ADN residual puede ser satisfactoriamente bajo. La invención se puede aplicar útilmente, por ejemplo para el cultivo y recolección de un virus de HSV-2 recombinante para utilizarse en vacunas, el virus tiene una supresión con respeto al gen de PK y se ha cultivado en una línea celular de células Vero o células MRC 5. La presente invención y la exposición se extienden a los métodos y composiciones y a los productos resultantes según se describe en la presente, y a las modificaciones y variaciones de los pasos y características mencionados y descritos en la presente descripción y reivindicaciones, incluyendo todas las combinaciones y subcombinaciones de los pasos y características de las mismas, incluyendo las variaciones en el orden y selección de pasos, y los documentos citados en la presente se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todos los fines.

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Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para preparar un virus herpético para una vacuna o terapia, que comprende: (a) cultivar células hospederas infectadas con el virus, (b) la separación del medio de las células infectadas y (c) utilizar el sobrenadante para proporcionar una preparación viral adecuada para inmunoterapia o vacunación de un animal.

2. El proceso según la reivindicación 1 en donde el virus herpético es un HSV-2 que tiene suprimido el dominio PK.

3. El proceso de la reivindicación 1, en donde el virus herpético es ICP1 Odel t aPK .

4. El proceso de la reivindicación 1, en donde el cultivo se lleva a cabo en un medio exento de suero .

5. El proceso de la reivindicación 1, en donde el cultivo se lleva a cabo en un medio que contiene bajos niveles de proteína. P05/045-ADX

6. El proceso de la reivindicación 1, en donde el cultivo se lleva a cabo en un medio con factor de crecimiento epidérmico agregado.

7. El proceso de la reivindicación 1, en donde el cultivo se lleva a cabo en un medio con insulina agregada.

8. El proceso de la reivindicación 1, que comprende además: (d) poner en contacto la preparación que contiene el virus herpético para que sea purificada, con un reactivo de unión por afinidad que comprende una fase sólida que porta un grupo de unión que comprende sulfato o sulfonato que pueda unir los materiales con afinidad para heparina, para unir así el virus herpético al reactivo de unión por afinidad, y (e) eluir el virus herpético proveniente del reactivo de unión.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además el paso: (d) formular el virus herpético con un portador, excipiente o agentes P05/045-AUX estabilizantes farmacéuticamente aceptables .

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende además el paso: (e) esterilizar y congelar o liofilizar la preparación .

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el virus herpético comprende un virus herpético infeccioso.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación farmacéutica resultante es para utilizarse como una in unoterapia .

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el reactivo de unión por afinidad porta grupos de unión que contienen grupos sulfato y polares no iónicos.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el reactivo de unión por afinidad porta heparina o dextrano sulfato.

15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el reactivo de unión por afinidad porta grupos de polisacárido sulfatado.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el reactivo de unión por P05/045-AUX afinidad porta cadenas colgantes de poliacrilamida sustituidas por grupos sulfoisobutilo .

17. Un proceso para desarrollar un virus herpético que comprende el paso: (a) cultivar células hospederas infectadas con el virus en un medio exento de suero .

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17 en donde el virus herpético es un HSV-2 que tiene suprimido el dominio PK. P05/045-AOX