CN104250639A - 一种收获和生产病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种收获和生产病毒的方法，所述收获病毒的方法包括将含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液与可溶性盐混合，所述可溶性盐的用量使得可溶性盐在混合体系中的浓度为400-1200mM；所述可溶性盐为氯化钠和/或氯化钾；所述病毒为HSV-1病毒或腺病毒。所述生产病毒的方法包括培养动物细胞，用病毒转染培养的动物细胞，按照以上方法收获病毒和提纯病毒。通过上述技术方案，本发明能够在不需低温设备的前提下操作简单地收获病毒，因此，本发明的方法特别适用于大规模生产。

Description

一种收获和生产病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种收获和生产病毒的方法，具体地，涉及一种收获病毒的方法以及包括该收获方法的生产病毒的方法。

背景技术

基于病毒的医药产品越来越受重视，包括疫苗和基因治疗病毒载体。这也给病毒类产品的生产工艺带来机遇和挑战。一般的生产工艺包括哺乳动物细胞培养、病毒的转染、病毒的收获、澄清、超滤和柱层析等一系列步骤，目标是提高产品的回收率以及纯度。就基因治疗病毒载体而言，已经有许多针对常用病毒载体纯化策略的开发研究，包括腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等，并且取得了不错的效果。也有一些病毒载体包括疱疹病毒和痘病毒等的生产工艺还处于摸索优化过程中，取得的成就并不明显。

无论是哪种产品，下游生产工艺都从细胞培养物中收获转染的病毒开始。以I型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus Type I，HSV-1病毒）为例，在实际操作中，由于病毒转染细胞的频率不同，病毒逃逸的时间不同，虽然病毒天然地会对细胞进行融合裂解，但是仍然会有相当多的一部分病毒位于细胞内或者粘附在细胞碎片上，在下一步的澄清步骤中，这部分病毒会随着细胞碎片一起被丢弃，导致病毒回收率较低。

在常规操作方法中，HSV-1病毒转染细胞后，病毒在细胞内部复制扩增，引起细胞病变现象发生，细胞变圆，从培养基质表面脱落，细胞裂解，病毒逃逸出细胞释放到收获液，这种病毒导致的细胞裂解是不完全的，无法完全释放出病毒，因此必须对收获液中的细胞进行彻底破碎。这时将收获的细胞液在-80℃条件下反复冻融，通过物理方式使细胞完全破碎，从而达到释放病毒的目的。这种冻融方法的缺点是需要低温设备，在处理大量收获液时采用此方法操作性不强且很费时，特别不利于工业大规模的生产。

发明内容

本发明的目的是克服现有的冻融方法对设备要求高而不利于大规模生产的缺陷，提供一种无需低温设备、操作简单且适于大规模生产的病毒收获方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量地研究，结果意外发现，通过往含有动物细胞的悬浮液中添加可溶性盐似乎能够降低病毒与细胞碎片之间的粘附性，从而提高病毒的回收率。因此，本发明提供了一种收获病毒的方法，该方法包括将含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液与可溶性盐混合，所述可溶性盐的用量使得可溶性盐在混合体系中的浓度为400-1200mM；所述可溶性盐为氯化钠和/或氯化钾；所述病毒为HSV-1病毒或腺病毒。

此外，本发明还提供了一种生产病毒的方法，该方法包括培养动物细胞，用病毒转染培养的动物细胞，收获病毒和提纯病毒，其中，所述收获病毒的方法为上述方法。

通过上述技术方案，本发明能够在不需低温设备的前提下操作简单地收获病毒，因此，本发明的方法特别适用于大规模生产。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，术语“含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液”是指因病毒转染导致细胞脱离培养基质以分散状态存在的动物细胞的培养液，与“悬浮液”可以替换使用；“转染”是指用病毒去感染其宿主细胞，可增殖出一群病毒后代的现象，有些被转染的细胞会随病毒后代的释放而发生裂解。HSV-1病毒是指I型单纯疱疹病毒（Herpes simplexvirus）。

本发明提供的收获病毒的方法包括将含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液与可溶性盐混合，所述可溶性盐的用量使得可溶性盐在混合体系中的浓度为400-1200mM，优选为600-1000mM；所述可溶性盐为氯化钠和/或氯化钾，优选为氯化钠；所述病毒为HSV-1病毒或腺病毒。

本发明的发明人发现，当使用的可溶性盐的种类和用量在上述优选范围内时，能够进一步促进病毒的回收，提高病毒的回收率。

根据本发明，所述可溶性盐可以以固体的形式与悬浮液混合，也可以以溶液的形式与悬浮液混合，为了使可溶性盐与转染了病毒的动物细胞充分接触，优选情况下，所述可溶性盐以可溶性盐溶液的形式与含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液混合。其中，对所述可溶性盐溶液的浓度没有特别的限制，优选地，所述可溶性盐溶液中可溶性盐的浓度为2-5M。

根据本发明，对所述混合的条件没有特别的要求，只要能够使病毒从转染了病毒的动物细胞中释放即可，优选地，所述混合的条件包括：混合的时间为0.5-24h，更优选为2-20h。混合的温度可以根据动物细胞的特性进行适当的选择，优选地，混合的温度为0-40℃，更优选为4-30℃。

本发明的发明人发现，本发明的方法特别适用于HSV-1病毒的收获，因此，所述病毒优选为HSV-1病毒。

根据本发明，所述动物细胞可以为各种能够被HSV-1病毒或腺病毒转染的动物细胞，即，各种HSV-1病毒或腺病毒的宿主细胞，可以为原代细胞、传代细胞系或肿瘤细胞系。对于HSV-1病毒，所述动物细胞可以为非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、兔肾细胞、地鼠肾细胞、人胚成纤维细胞、人羊膜细胞或人原代神经细胞等。对于腺病毒，所述动物细胞可以为人胚肾细胞（HEK-293细胞）、人肺腺癌细胞（A549细胞）、人宫颈癌细胞（HeLa细胞）或人胚原代细胞。

本发明中，所述腺病毒可以为哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）的腺病毒，也可以为禽腺病毒属（Aviadenovirus）的腺病毒，但优选为哺乳动物腺病毒属的腺病毒，例如，人5型腺病毒。

根据本发明，含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液可以采用本领域的常规方法获得，以哺乳动物细胞为例，将哺乳动物细胞在35-37℃、4-6%CO₂条件下培养，形成致密单层细胞层后，更换转染培养基，按照感染复数（MOI，表示转染时病毒数量与细胞数量的比值）为0.01-5与HSV-1病毒混合或MOI为1-12与腺病毒混合，35-37℃继续培养48-72h，即可得到含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液。其中，用于培养动物细胞的培养基和/或转染培养基可以为各种常规使用的培养基。

本发明的收获病毒的方法特别适用于大规模的生产，因此，在每次收获病毒时，可以按照本发明的方法对大量悬浮液进行处理以收获病毒。优选地，在每次与可溶性盐混合时，含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液的体积在20L以上，更优选为20-100L。以上描述并不是限定本发明的方法仅适用于处理20L以上的悬浮液，本领域技术人员能够理解，本发明的方法同样适于从少量（如1-40ml）的悬浮液中收获病毒。

本发明提供的生产病毒的方法包括培养动物细胞，用病毒转染培养的动物细胞，收获病毒和提纯病毒，其中，收获病毒的方法为本发明提供的上述方法。

根据本发明，培养动物细胞、用病毒转染培养的动物细胞和提纯病毒的方法均可以参照本领域的常规方法进行，且针对不同的动物细胞，本领域技术人员能够选择不同的条件实施上述步骤，故在此不再赘述。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，HSV-1病毒为于2006年6月14日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）、保藏编号为CGMCC No.1736的病毒株（已经公开于CN101230334A）；腺病毒为人5型腺病毒（购自ATCC，货号为VR-1516^TM；DMEM购自Sigma（D5796）。

HSV-1病毒的回收液的滴度的测定方法为空斑方法，参照CN101376893A实施例2中步骤（1）所描述的方法，滴度越大，表明HSV-1病毒的回收率越大；腺病毒的回收液的滴度的测定方法为半数组织培养感染量方法（TCID50方法），参照“Sensitivity and Reproducibility in AdenoviralInfectious Titer Determination，Nyberg-Hoffman C,Shabram P,Li W等人，Nat.Med.，1997，3:808-811”，滴度越大，表明腺病毒的回收率越大。

转染了病毒的动物细胞的培养（悬浮液的制备）

（1）将动物细胞（购自ATCC，货号为ATCCCCL-81^TM）接种至完全培养基（含10体积%血清的DMEM）中，在37℃、5%CO₂条件下培养，待细胞在培养瓶中形成致密单层细胞层后，更换转染培养基（含1体积%血清的DMEM），按照MOI=0.05加入HSV-1病毒，37℃下继续培养，培养72小时后细胞全部变圆，摇晃后全部从培养瓶脱落，即获得含有转染了HSV-1病毒的动物细胞的悬浮液。

（2）将动物细胞（购自ATCC，货号为ATCCCRL-1573^TM）接种至完全培养基（含10体积%血清的DMEM）中，在37℃、5%CO₂条件下培养，待细胞在培养瓶中形成致密单层细胞层后，更换转染培养基（含1体积%血清的DMEM），按照MOI=10加入腺病毒，37℃下继续培养，培养72小时后细胞全部变圆，摇晃后全部从培养瓶脱落，即获得含有转染了腺病毒的动物细胞的悬浮液。

实施例1

将（1）中获得的含有转染了HSV-1病毒的动物细胞的悬浮液（100L）与氯化钠溶液（浓度为2M，氯化钠溶液的用量使得氯化钠在混合体系中的浓度为600mM）在4℃下混合20小时，获得HSV-1病毒的回收液。测得回收液的滴度为5.1×10⁶pfu/ml。

实施例2

将（1）中获得的含有转染了HSV-1病毒的动物细胞的悬浮液（40L）与氯化钠溶液（浓度为5M，氯化钠溶液的用量使得氯化钠在混合体系中的浓度为1000mM）在30℃下混合5小时，获得HSV-1病毒的回收液。测得回收液的滴度为2.5×10⁶pfu/ml。

实施例3

将（1）中获得的含有转染了HSV-1病毒的动物细胞的悬浮液（20L）与氯化钠溶液（浓度为4M，氯化钠溶液的用量使得氯化钠在混合体系中的浓度为800mM）在25℃下混合2小时，获得HSV-1病毒的回收液。测得回收液的滴度为2×10⁷pfu/ml。

实施例4

按照实施例3的方法收获病毒，不同的是，混合的时间为1小时。测得回收液的滴度为4×10⁶pfu/ml。

实施例5

按照实施例3的方法收获病毒，不同的是，将“氯化钠溶液”用“氯化钾溶液”代替。测得回收液的滴度为9×10⁶pfu/ml。

实施例6

按照实施例3的方法收获病毒，不同的是，氯化钠溶液的用量使得氯化钠在混合体系中的浓度为400mM。测得回收液的滴度为3.5×10⁶pfu/ml。

实施例7

将（2）中获得的含有转染了腺病毒的动物细胞的悬浮液与氯化钠溶液（浓度为5M，氯化钠溶液的用量使得氯化钠在混合体系中的浓度为800mM）在25℃下混合2小时，获得腺病毒的回收液。测得回收液的滴度为1×10¹⁰IU/ml。

对比例1

将（1）中获得的含有转染了HSV-1病毒的动物细胞的悬浮液（40ml）置于-80℃的超低温保存箱中1h，取出融化，重复3次即获得HSV-1病毒的回收液。测得回收液的滴度为2×10⁷pfu/ml。

对比例2

按照实施例3的方法收获病毒，不同的是，悬浮液不与氯化钠溶液混合，而直接被置于25℃下2小时，测得回收液的滴度为1.7×10⁶pfu/ml。

从以上实施例可以看出，通过本发明方法获得的病毒回收液的滴度较高，说明本发明方法能够在不需低温设备的前提下操作简单地收获病毒。

从实施例3和实施例4-6的结果可以看出，控制各个条件（可溶性盐种类和终浓度等）在本发明优选的范围内能够进一步提高病毒的回收率。

此外，从实施例1-7和对比例1可以看出，采用现有的冻融的方法从悬浮液中收获病毒需要使用超低温保存箱，而通常1台超低温保存箱处理1L悬浮液所需要的时间约为1.5天，如果增加悬浮液的量，为了保证悬浮液充分冷冻，则需要大大延长冷冻时间，显然冻融方法不适合用于大规模生产中。而采用本发明的方法可以直接从较大量的悬浮液中收获病毒，对设备的要求低，无需使用超低温保存箱即可实现病毒的收获。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种收获病毒的方法，其特征在于，该方法包括将含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液与可溶性盐混合，所述可溶性盐的用量使得可溶性盐在混合体系中的浓度为400-1200mM；所述可溶性盐为氯化钠和/或氯化钾；所述病毒为I型单纯疱疹病毒或腺病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，可溶性盐的用量使得可溶性盐在混合体系中的浓度为600-1000mM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述可溶性盐为氯化钠。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性盐以可溶性盐溶液的形式与含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液混合，且可溶性盐溶液中可溶性盐的浓度为2-5M。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合的条件包括：混合的温度为0-40℃，混合的时间为0.5-24h。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述混合的条件包括：混合的温度为4-30℃，混合的时间为2-20h。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒为I型单纯疱疹病毒。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在每次与可溶性盐混合时，含有转染了病毒的动物细胞的悬浮液的体积为20-100L。

9.一种生产病毒的方法，该方法包括培养动物细胞，用病毒转染培养的动物细胞，收获病毒和提纯病毒，其特征在于，收获病毒的方法为权利要求1-8中任意一项所述的方法。