CN104894047A - 基于d-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 - Google Patents
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Abstract
基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于酶基因工程技术领域。以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌株，敲除其染色体上D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到D-丙氨酸缺陷型的1A751(dal-)；将梭状芽胞杆菌ATCC 35704 的DPE酶基因作亲本，在其上游融合P43启动子构建成P43-DPE，将其构建至质粒pUB110 (NCBI-Gene ID:9507338)中得到pUB-P43-DPE，将pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm用dal替代，构建成pUB-P43-DPE-dal；再转化进1A751(dal-)中，得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，保藏编号CCTCC NO: M2015257。其发酵液总酶活达16U/mL，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶基因工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。
随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%，能量值却只有蔗糖的0.3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。
自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase , DPEase, EC 5.1.3.30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖商业化生产的热点和焦点。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillus subtilis表达系统没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。
发明内容
本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要的意义。
本发明的技术方案：一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751-pUB-P43-DPE-dal，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015257。
所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (dal - )；将来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens ）ATCC 35704 的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE基因和P43启动子构建至质粒pUB110中得到pUB-P43-DPE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal 代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-DPE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751 (dal - )中表达，获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，即CCTCC NO：M 2015257。
具体步骤为：
（1）在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)的上下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂。通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收。选取lox71-spc-lox66 抗性基因片段作为筛选标记。将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起。将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中，在含有壮观霉素(spc)的平板上筛选。由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal - )-spc。
（2）将pTSC质粒导入上述宿主1A751(dal - )-spc中，在含有红霉素的平板上筛选。在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除。并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal - )。
（3）在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43，并与DPE酶基因组成表达单元P43-DPE，然后构建至质粒pUB110中，得到质粒pUB-P43-DPE。
（4）敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因(dal)构建至表达载体pUB-P43-DPE中，得到质粒pUB- P43-DPE-dal。
（5）将重组质粒pUB- P43-DPE-dal转入宿主1A751(dal - )感受态中，在LB平板上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001。
为增强表达，在DPE基因的上游添加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQ NO.1中1-300位所示。
质粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因和SEQ ID NO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal，代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。
所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal的应用，可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品及制药领域中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，其可以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖。该重组菌在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。
生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2015257，保藏日期2015年4月28日。
附图说明
图1：D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌1A751(dal - )的构建过程。
图2：食品级安全质粒pUB- P43-DPE-dal构图。
图3：重组菌SK38.001的发酵及酶活曲线。
具体实施方式
实施例1：D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal - )的构建
以质粒p7S6为模板，引物对P3/P4将lox71-spc-lox66抗生素抗性基因片段扩增并回收。在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal两侧选择800-900bp长度的片段作为同源区域，将两端的同源区域分别用引物对P1/P2 及 P5/P6扩增并回收。
用引物对P1/P6将两端同源臂片段与抗生素lox71-spc-lox66通过PCR技术融合在一起。
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：上下游引物各1.5μL；5μL Phusion HF buffer (5×)；2μL 10mM dNTP mix (2.5mM each)；2μL 上游同源臂；0.5μL lox71-spc-lox66；2μL 下游同源臂；0.5μL Phusion high-fidelity DNA聚合酶；加蒸馏水至终体积50μL。
PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。
将PCR产物转化至枯草芽孢杆菌1A751感受态，在含有抗生素spc和D-丙氨酸的平板上进行筛选，得到一株1A751 (dal - )- spc。
导入pTSC质粒（南京农业大学，闫新博士惠赠，NCBI accession no.EU864234），在IPTG的诱导下表达Cre重组酶，在重组酶的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗性基因spc被删除（图1）。
最终获得D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (dal - )。
实施例2：食品级安全质粒pUB- P43-DPE-dal的构建
为增强表达，在DPE酶基因的上游融合强启动子P43，构成P43-DPE表达单元。利用引物P7/P9 扩增P43-DPE片段。以pUB110为出发载体，利用引物对P8/P10，扩增载体骨架pUB。然后将P43-DPE和pUB片段进行PCR，形成多聚体。
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5μL Phusion HF buffer (5×)；2μL 10mM dNTP mix (2.5mM each)；2μL P43-DPE；2μL pUB；0.5μL Phusion high-fidelity DNA聚合酶；加蒸馏水至终体积50μL。
PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。
将PCR产物直接转化宿主1A751中，在含有Kan的平板上筛选，得到质粒pUB-P43-DPE。
利用同样的方法，以枯草芽孢杆菌1A751染色体DNA为模板，引物对P13/P14扩增D-丙氨酸消旋酶基因(dal)。以质粒pUB-P43-DPE为模板，引物对P11/P12扩增载体pUB-P43-DPE（Kan-, Blm-）。将片段dal和pUB-P43-DPE（Kan-, Blm-）相互PCR，转化宿主1A751 (dal - )。在LB平板上筛选得到pUB-P43-DPE-dal。（图2）。
实施例3： 重组菌的发酵
1. DPE酶活测定方法：1mL的反应体系中，加入800μL的用磷酸盐缓冲液（50mM, pH7.0）溶解的100g/L的D-果糖，200μL的发酵液，55℃保温10min，然后煮沸10min以终止酶反应。
2. 用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U）：每分钟催化产生1μmol D-psicose 所需要的酶的量。
3. 用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃、200rpm，培养12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37℃、200rpm，并定时取样，测定OD600，酶活数据（图3）。
种子培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，以纯净水配制。
发酵培养基：葡萄糖(15g/L)，酵母膏(15g/L)，NaCl(8g/L)，MgSO4(1g/L)，Na2HPO4(1g/L)，pH 7.25，以纯净水配制。
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 1-300位为P43启动子，301-1170为DPE酶基因
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
atgaagcatg gtatttatta cgcgtactgg gaacaggaat gggcagcaga ttacaagcgg 360
tatgtagaga aggcggcaaa gcttggattc gatatactgg aggttggcgc ggcgccactg 420
ccggactatt ctgcgcagga ggtaaaggaa ctgaaaaaat gcgccgatga taacggtatc 480
cagctgaccg cgggatatgg tcccgccttc aatcataata tgggttcctc agatccgaag 540
atcagggaag aggcgcttca atggtataaa cgcctgttcg aggtgatggc aggccttgat 600
attcatctga ttggcggagc gctttattca tactggccgg tggactttgc cacagccaat 660
aaggaagagg actggaagca cagcgtggag ggaatgcaga ttctggcgcc catcgccagc 720
cagtatggca tcaatctggg aatggaagtc ctgaaccgct ttgagagcca tatcttaaat 780
acttcggaag aaggcgtgaa gttcgtgacg gaagtaggca tggataatgt gaaagtcatg 840
ctggatacgt tccacatgaa catcgaggaa tcgagcattg gcgacgcgat ccgccatgcc 900
gggaaacttc ttggacactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggtacc cggaaagggc 960
cgcaccccat ggagggagat cggggatgcc ttgcgcgaga ttgagtatga cggaaccgtg 1020
gttatggagc catttgtacg catgggcgga caggtaggct ctgatatcaa ggtctggaga 1080
gacatcagca agggcgcggg agaggaccgg ctggatgagg atgcaaggcg cgcggtagag 1140
ttccagagat acatgcttga atggaagtaa 1170
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 1167
<212> DNA
<213> D-丙氨酸消旋酶功能基因
<400> 2
Atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60
gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120
aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180
gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240
aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300
tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360
aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420
aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480
tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540
atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600
cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660
ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt 720
cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa 780
ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg 840
gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc cgaaaattga aagggaccga catccttgtg 900
aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga atttgcatgg accaatttat ggtggagctg 960
gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc acattaatag gccggcaggg ggatgaatat 1020
atttccatgg atgagattgc aggaaggctc gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca 1080
ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat 1140
cctttattgc aggtaaatat aagcaat 1167
Claims (6)
1.一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751-pUB-P43-DPE-dal，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015257。
2.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (dal - )；将来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704 的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE基因和P43启动子构建至质粒pUB110中得到pUB-P43-DPE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal 代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-DPE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751 (dal - )中表达，获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，即CCTCC NO：M 2015257。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为：
（1）在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal的上下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66 抗性基因片段作为筛选标记，将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中，在含有壮观霉素spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal - )-spc；
（2）将pTSC质粒导入上述宿主1A751(dal - )-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal - )；
（3）在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43，并与DPE酶基因组成表达单元P43-DPE，然后构建至质粒pUB110中，得到质粒pUB-P43-DPE；
（4）敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因dal构建至表达载体pUB-P43-DPE中，得到质粒pUB- P43-DPE-dal；
（5）将重组质粒pUB- P43-DPE-dal转入宿主1A751(dal - )感受态中，在LB平板上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQ NO.1中1-300位所示。
5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于质粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因和SEQ ID NO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal，代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。
6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal的应用，其特征在于可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品及制药领域中的应用。
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