CN112852702B - 一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明提供的食品级安全重组菌株可实现细胞培养过程中不需添加抗生素维持质粒在宿主细胞中的遗传稳定性，通过全细胞催化乳糖一步生物法安全高效合成塔格糖，经过全细胞催化工艺优化，通过控制反应体系pH，在投加100g/L底物乳糖时获得最大摩尔转化率57.23％，增加底物载量为500g/L时获得最高产量的塔格糖为96.76g/L。此种方法降低了塔格糖的生产成本，提高了底物浓度，提升了塔格糖应用于食品领域的安全等级，实现塔格糖的高效合成，为塔格糖的安全食品工业化生产奠定了坚实的研究基础。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

塔格糖，天然来源的一种稀有糖，果糖的差向异构体，甜度近似于蔗糖，但热量只有蔗糖的1/3，并具有抑制高血糖、改善肠道菌群、不致龋齿等多种生理功效，成为保健品开发和食品升级的一种很好的甜味替代剂，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。2001年D-塔格糖被美国食品和药物管理局(FDA)认定为安全食品(GRAS)，其后在2004年塔格糖被世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)批准为安全食品。2016年全球人造甜味剂市场约为32亿美元，并在随后的几年内，塔格糖市场不断扩大。

塔格糖的生产方法有化学法和生物法。钙催化剂和强酸的化学催化法生产塔格糖存在副产品和化学废物生成等缺点，生物法利用阿拉伯糖异构酶催化半乳糖异构化生成塔格糖，具有反应条件温和、副产物少和环境友性等特点。但阿拉伯糖异构酶存在对半乳糖底物不利的的动力学、热稳定性低和平衡常数低(半乳糖和塔格糖的比例约为7：3)等问题，使得塔格糖生产中高成本、低转化率的问题阻碍了塔格糖的工业化生产。2011年张厚程等人公开的《一种生物酶法生产塔格糖的方法》中，通过构建大肠杆菌工程菌株高效表达的阿拉伯糖异构酶酶法催化合成塔格糖，转化率达39.5％，且利用底物为半乳糖。另一方面，基因工程菌携带的抗生素抗性基因及培养过程添加的抗生素都对食品安全带来威胁，塔格糖的安全高产成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种食品级安全重组枯草芽孢杆菌全细胞联合催化乳糖合成塔格糖的方法。为了降低由于阿拉伯糖异构酶对半乳糖不利的动力学带来的高成本问题，利用β-半乳糖苷酶水解相对廉价的乳糖生产半乳糖降低底物成本，选用发酵技术成熟的GARS菌株-枯草芽孢杆菌作为宿主分别表达大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶与阿拉伯糖异构酶并利用丙氨酸消旋酶基因代替抗生素作为筛选标记构建食品级安全重组枯草芽孢杆菌。与纯酶转化相比，全细胞转化存在抗环境扰动性和更低的有效酶成本特点，一定程度提升胞内酶的稳定时长，通过对全细胞转化条件工艺的优化，使阿拉伯糖异构酶催化的异构化反应更多的向产物塔格糖方向偏移，实现高效合成塔格糖的目的。

本发明的第一个目的是提供一个组合物，所述组合物含有表达β-半乳糖苷酶的重组菌和表达阿拉伯糖异构酶的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌表达丙氨酸消旋酶基因alrA。

在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶与阿拉伯糖异构酶均来自于大肠杆菌，核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述丙氨酸消旋酶基因alrA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168为宿主，以pMA5为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌B.subtilis 168去除了丙氨酸消旋酶基因alrA。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体pMA5去除了卡那霉素和博来霉素抗性基因。

在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；博来霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，具体步骤如下：

1)利用cre/lox特异性重组系统敲除枯草芽孢杆菌B.subtilis 168上的丙氨酸消旋酶alrA基因，获得D-丙氨酸营养缺陷型菌株B.subtilis 168D1；

2)将丙氨酸消旋酶alrA基因代替表达载体pMA5的卡那霉素和博来霉素抗性基因获得表达载体pMA5a；

3)将来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶基因分别构建至表达载体pMA5a获得质粒pMA5a-lacZ和pMA5a-araA；

4)将质粒pMA5a-lacZ和pMA5a-araA分别导入D-丙氨酸营养缺陷型菌株B.subtilis168D1获得重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ和B.subtilis168D1/pMA5a-araA。

本发明的第三个目的是提供一种安全高效合成塔格糖的方法，所述方法为：将所述重组菌分别接种于LB培养基中，于35–39℃、200–220r/min培养10-12h后，按照1％(v/v)接种量转接于TB培养基中，30–39℃、200–220r/min培养20–30h后收集菌液，离心收集菌体，使用生理盐水清洗细胞后悬浮于0.2mol/L Na₂HPO₄-柠檬酸的缓冲液中获得悬液；以乳糖为底物，加入重组菌B.subtilis 168D1/pMA5a-lacZ和B.subtilis 168D1/pMA5a-araA悬液反应70～90h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在pH 8.0-9.0的条件下反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在温度为45-55℃的条件下反应。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中表达β-半乳糖苷酶的重组枯草芽孢杆菌和表达阿拉伯糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌的细胞数量比为1:(15～20)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应体系中添加2～5mmol/L的Mn²⁺。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应体系中添加透化剂0.1％TritonX-100。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应体系中菌悬液浓度为OD₆₀₀为40～50。

本发明还提供了一种上述食品级安全重组枯草芽孢杆菌或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。

有益效果：(1)本发明提供了一种一步法合成塔格糖的生物催化方法，该方法具有安全高效的特点。

(2)本发明利用cre/lox特异性重组系统及基因重组技术构建了培养过程不需添加抗生素而保持质粒稳定性的食品级重组枯草芽孢杆菌底盘细胞，为众多食品级产品的合成提供了安全的细胞支持平台。

(3)本发明将来源于大肠杆菌来源的β-半乳糖甘酶和阿拉伯糖异构酶在公认的食品安全菌株-B.subtilis 168工程改造菌株中进行表达，对混合菌悬液全细胞转化乳糖一步法合成塔格糖的最适条件进行探究，在投加100g/L底物乳糖时获得最大摩尔转化率57.23％，增加底物载量为500g/L时获得最高产量的塔格糖为96.76g/L，降低了塔格糖合成过程的成本，提高了塔格糖应用于食品领域的安全等级，实现塔格糖的高效合成，为塔格糖的工业化生产奠定了良好的研究基础。

附图说明

图1：构建食品级重组枯草芽孢杆菌的原理图。

图2：敲除丙氨酸消旋酶基因alrA的枯草芽孢杆菌验证的核酸电泳图；其中M为10000bp marker；1：B.subtilis 168PCR产物；2：B.subtilis D1(Zeo^r)PCR产物；3：B.subtilis 168D1(Kan^r)PCR产物；4：B.subtilis 168D1 PCR产物。

图3：重组质粒验证的核酸凝胶电泳图；其中M为10000bp marker；1为重组质粒pMA5a上alrA基因；2为重组质粒pMA5a-araA上araA基因；3为重组质粒pMA5a-lacZ上lacZ基因。

图4：β-半乳糖甘酶和阿拉伯糖异构酶表达的SDS-PAGE分析；其中，M：proteinmarker，1：B.subtilis 168D1/pMA5a粗酶液(对照)2：B.subtilis 168D1/pMA5a-lacZ粗酶液，3：B.subtilis 168D1/pMA5a-lacZ破壁沉淀，4：B.subtilis 168D1/pMA5a-araA粗酶液，5：B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ破壁沉淀。

图5：全细胞转化条件优化分析(两菌株混合比例、最适pH、温度、金属离子Mn²⁺浓度、透化剂TritonX-100浓度、菌悬液浓度等)。

图6：塔格糖的合成分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的pMA5、p7Z6、pTSC质粒和枯草芽孢杆菌B.subtilis 168均购自Invitrogen公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L。

TB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)12g/L、酵母提取物(Yeast extract)24g/L、K₂HPO₄·3H₂O 16.4g/L、KH₂PO₄ 2.3g/L、甘氨酸(Glycine)7.5g/L、甘油(glycerin)5g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

底物和产物的测定方法：

采用高效液相色谱HPLC对底物和产物进行检测：Carbomix-Ca-NP色谱柱，超纯水流动相，流速0.6mL/min，柱温80℃，示差检测器，检测温度50℃，进样量20μL。

β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶的酶活测定方法：

酶活测定反应体系(1mL)：100g/L底物、200μL纯酶、Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L，pH 7.0)，37℃下反应20min，置于冰上终止反应。蛋白质浓度测定采用Bradford法测定。

通过酶催化反应中生成的葡萄糖的量来定义β-半乳糖苷酶的酶活，生成的塔格糖的量来定义阿拉伯糖异构酶的酶活。

β-半乳糖苷酶酶活定义为：标准条件下(pH 7.0、37℃)以乳糖为底物，每分钟催化生成1μmol产物葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。

阿拉伯糖异构酶酶活定义为：标准条件下(pH 7.0、37℃)以半乳糖为底物，每分钟催化生成1μmol产物塔格糖所需酶量为一个酶活单位。

实施例1：丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168D1及丙氨酸消旋酶基因回补枯草芽孢杆菌B.subtilis 168D1/pMA5a的构建

(1)丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168D1的构建及验证

1)从NCBI中获取枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168中丙氨酸消旋酶alrA和alrB前后各800bp序列作为同源臂，通过p7Z6质粒图谱分析，设计引物，使用引物P1/P2、P3/P4和P5/P6分别扩增出枯草芽孢杆菌168中丙氨酸消旋酶alrA前后各800bp序列及p7Z6质粒上的lox71-zeo^r-lox66盒序列，使用引物P7/P8、P9/P10分别扩增出枯草芽孢杆菌168中丙氨酸消旋酶alrB前后各800bp序列。通过使用引物P1/P4进行融合PCR将丙氨酸消旋酶alrA前后各800bp序列和p7Z6质粒上的lox71-zeo^r-lox66盒序列连接成一整段基因片段A；通过使用引物P7/P10进行融合PCR将丙氨酸消旋酶alrB前后各800bp序列和p7Z6质粒上的lox71-zeo^r-lox66盒序列连接成一整段基因片段B。

2)利用化学转化法将上述基因片段A和B分别导入枯草芽孢杆菌168感受态中，得到转化子，并涂布含有30mg/L博来霉素的LB固体平板进行筛选。由于同源臂的存在，发生同源重组，得到敲除丙氨酸消旋酶alrA的枯草芽孢杆菌168和敲除丙氨酸消旋酶alrB的枯草芽孢杆菌168。

3)将带有卡那霉素抗性基因的温敏型质粒pTSC导入敲除丙氨酸消旋酶alrA的枯草芽孢杆菌168，使用IPTG进行诱导，在温敏型质粒pTSC上编码的cre重组酶的作用下，lox71和lox66位点发生特异性重组，删除zeo抗性基因，成为lox72双突变位点，获得无zeo抗性基因的转化子。将该转化子点种于添加100μg/mL D-丙氨酸的LB平板上，51℃培养48h，消除温敏型质粒pTSC，获得无抗不含质粒的丙氨酸消旋酶基因敲除菌B.subtilis 168D1，如图1。丙氨酸消旋酶基因敲除菌B.subtilis 168△alrB构建方法同菌株B.subtilis168D1。

将丙氨酸消旋酶基因敲除菌B.subtilis 168D1和B.subtilis 168△alrB分别点种于无抗LB平板和无抗添加100μg/mL D-丙氨酸的LB平板上，37℃培养12h，在无抗LB平板上不生长而在添加D-丙氨酸的无抗LB平板上生长的即为成功构建的丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌。结果如图2所示，表明成功构建敲除alrA的枯草芽孢杆菌改造菌株，获得了D-丙氨酸营养缺陷型菌株B.subtilis 168D1。

(2)丙氨酸消旋酶基因回补枯草芽孢杆菌B.subtilis 168D1/pMA5a的构建

使用引物P11/P12扩增枯草芽孢杆菌基因组上的丙氨酸消旋酶基因alrA，使用引物P13/P14在pMA5载体上卡那霉素和博来霉素抗性基因两端反向扩增质粒pMA5以去掉卡那霉素和博来霉素抗性基因，将PCR产物丙氨酸消旋酶基因alrA基因片段和去掉卡那霉素和博来霉素抗性基因质粒pMA5分别进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收纯化，使用同源重组酶连接alrA基因片段和去掉卡那霉素和博来霉素抗性基因质粒pMA5得到重组载体pMA5a(图3)；通过化学转化将重组质粒pMA5a导入到大肠杆菌JM109中得到转化子并涂布于LB固体培养基，37℃静置培养10-12h，使用引物P1/P4进行菌落PCR并验证成功后，挑取阳性克隆接种至10mL LB培养基中37℃，180rpm/min培养12h，按照细菌质粒提取试剂盒提取质粒；将扩增后的质粒通过化学转化的方式导入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168D1中得到转化子，并涂布于LB固体平板上，37℃静置培养10-12h，使用引物P1/P4进行菌落PCR验证后，挑取阳性克隆接种至10mL LB培养基中37℃，180rpm培养12h，获得重组菌株B.subtilis168D1/pMA5a。

表1引物表

表2 PCR反应体系

PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，退火30s(退火温度由引物决定)，72℃延伸(延伸时间由扩增片段长度决定，30s·kb^-1)，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

同源重组：使用商品化同源重组试剂盒，购自南京诺唯赞有限公司。

胶回收：胶回收试剂盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司。

实施例2：大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶分别在B.subtilis168D1/pMA5a中的异源表达

(1)基因表达载体的构建及转化

使用引物P15/P16和P17/P18，利用PCR分别扩增出大肠杆菌基因组上β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶基因，利用Nde I和Mlu I快切酶对实施例1中获得的质粒pMA5a进行双酶切，利用同源重组将PCR产物β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶基因片段分别和酶切产物连接后导入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168D1中，获得重组菌株B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ和B.subtilis168D1/pMA5a-araA。

(2)β-半乳糖苷酶(lacZ)和阿拉伯糖异构酶(L-AI)的表达和酶活测定

将实施例2步骤(1)获得的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ、B.subtilis168D1/pMA5a-araA分别在10mL LB培养基中，37℃、180r/min培养12h后，按1％(v/v)接种量转接到50mL TB培养基中，并在37℃、180rpm培养24h进行β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶的表达，收集菌液，离心收集细胞，使用生理盐水洗细胞两次，悬浮于5mLNa₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L，pH 8.0)，向细胞中添加30μL溶菌酶(200mg/mL)冰上放置5h后超声破碎(400w破1s停3s，30min)，通过10,000r/min离心20min获得破壁上清、破壁沉淀，取上清用0.22μm滤膜过滤得粗酶液。

分别对破壁上清液、破壁沉淀进行SDS-PAGE分析，如图4所示，β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶分别在110kDa和55kDa附近均有很明显的条带，成功实现了异源表达。经过酶活测定，β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶的酶活数据如下表1：

表2：β-半乳糖苷酶lacZ和阿拉伯糖异构酶araA酶活

实施例3：全细胞转化条件优化分析

(1)B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA全细胞转化最适细胞数量混合比例分析

控制投加菌量OD₆₀₀一致，均为OD₆₀₀＝20的条件下，调整B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis 168D1/pMA5a-araA的细胞数量之比分别为1:1、1:10、1:15、1:20、1:30。

反应体系5mL：0.2mol/L Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(pH 8.0)、100g/L乳糖、5mmol/LMn²⁺、0.1％透化剂TritonX-100。50℃反应12h后离心收集上清，置于冰上终止反应，经离心处理后利用HPLC分析底物和产物量。

如图5(A)所示，当B.subtilis 168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA全细胞转化混合比例为1:15时，产量最高为16.06g/L，是混合比例为1:1时的1.5倍。

(1)全细胞转化最适pH和温度

测定最适pH：将B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA以1:15的细胞数量比混合后，投入不同pH的缓冲液中，其他反应条件与实施例3步骤(1)中一致，测定β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶的相对酶活。如图5(C)所示，当pH为8.0和9.0时，相对酶活达到90％以上，全细胞转化最适pH为8.0，后续实验选用0.2mol/L Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(pH 8.0)。

测定最适温度：将B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA以1:15的细胞数量比混合后，投入pH 8.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中，并设置反应温度为30、40、50、60、70℃，其他反应条件与实施例3步骤(1)中一致，测定β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶的相对酶活。如图5(D)所示，当温度为50℃时，相对酶活最高，全细胞转化最适温度为50℃。

(2)全细胞转化最适金属离子浓度分析

将B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA以1:15的细胞数量比混合后，在反应体系分别添加Mn²⁺浓度为0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0mmol/L测定最适添加浓度，其他反应条件与实施例3步骤(1)中一致。如图5(E)所示，反应体系中Mn²⁺的最适添加浓度为3.0mmol/L，随着Mn²⁺添加浓度的增大，相对转化率逐渐下降，因此全细胞转化最适金属离子种类及浓度为3.0mmol/L Mn²⁺。

(3)全细胞转化最适透化剂浓度分析

将B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA以1:15的细胞数量比混合后，控制反应体系中TritonX-100的添加浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0％，其他条件与实施例3步骤(1)中一致，测定最适添加浓度。如图5(F)所示，反应体系中TritonX-100的添加浓度为0.1％时，随着TritonX-100的添加浓度的增大，相对转化率逐渐下降，因此全细胞转化最适透化剂浓度为0.1％TritonX-100。

(4)全细胞转化最适菌悬液浓度分析

在B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA细胞数量混合比例为1:15的条件下控制反应体系中菌悬液浓度OD₆₀₀分别为20、30、40、50、60、70，50℃反应0、12、24、48、72和96h后取500μl离心收集上清，沸水浴10min终止反应，其他条件与实施例3步骤(1)中一致。如图5(B)所示，菌悬液浓度OD₆₀₀为50时，塔格糖生成量最高为26.96g/L，是菌悬液浓度OD₆₀₀为20时塔格糖生成量的1.7，因此全细胞转化最适菌悬液浓度OD₆₀₀为50。

经全细胞转化条件优化分析后，B.subtilis168D1/pMA5a-lacZ：B.subtilis168D1/pMA5a-araA菌量最适添加比例为1:15，在0.2M Na2HPO4-柠檬酸(pH8.0)、50℃、添加3mmol/L Mn²⁺、0.1％TritonX-100、菌悬液浓度OD600为50时，塔格糖生成量最高为最优全细胞转化条件。

实施例4：塔格糖的合成

扩大全细胞转化反应体系为1L，在优化后的最适条件下投加100～500g/L乳糖，通过2mol/L HCl和NaOH调节反应体系pH始终为8.0，在反应的5、10、20、40、60、80h后，取样1mLHPLC检测反应体系中的底物、中间产物和最终产物含量。检测结果如图6，在投加100g/L底物乳糖时塔格糖产量为30.05g/L，获得最大摩尔转化率57.23％，增加底物载量为500g/L时获得最高产量的塔格糖为96.76g/L，摩尔转化率为36.77％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法

<130> BAA210095A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60

gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120

aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180

gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240

aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300

tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360

aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420

aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480

tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540

atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600

cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660

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<212> DNA

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ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180

tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240

gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300

tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360

acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420

cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480

ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540

ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600

caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660

acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720

ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780

ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840

gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa 900

ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac 960

ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat 1020

ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat 1080

catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg 1140

aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac 1200

acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc 1260

atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc 1320

gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg 1380

aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat 1440

ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt 1500

tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc 1560

atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc 1620

cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat 1680

ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat 1740

gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg gcgatacgcc gaacgatcgc 1800

cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa 1860

gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc 1920

agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat 1980

ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagttg 2040

attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc 2100

gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag 2160

tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat 2220

ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac 2280

cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg 2340

ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc 2400

cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa 2460

gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccgct 2520

cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat 2580

ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg 2640

gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga 2700

ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat 2760

ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc 2820

gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc 2880

agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa 2940

gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg 3000

agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc 3060

tggtgtcaaa aatga 3075

<210> 3

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgacgattt ttgataatta tgaagtgtgg tttgtaattg gcagccagca tctgtatggc 60

ccggaaaccc tgcgtcaggt cacccaacat gccgagcacg tcgttaatgc gctgaatacg 120

gaagcgaaac tgccctgcaa actggtgctg aaaccgctgg gcaccacgcc ggatgaaatc 180

accgctattt gccgtgacgc gaattacgac gatcgttgcg ctggtctggt ggtgtggctg 240

cacacctttt ccccggccaa aatgtggatc aacggcctga ccatgctcaa caaaccgttg 300

ctgcaattcc acacccagtt caacgcggcg ctgccgtggg atagcatcga tatggacttt 360

atgaacctga accagactgc acatggcggt cgcgagttcg gcttcattgg cgcgcgtatg 420

cgtcagcaac atgctgtcgt taccggtcac tggcaggata aacaagcaca tgagcgtatc 480

ggctcctgga tgcgtcaggc ggtctctaaa caggataccc gtcatctgaa agtctgccgt 540

tttggcgata acatgcgtga agtagcggtc accgatggcg ataaagttgc cgcacagatc 600

aagtttggtt tctccgtcaa tacctgggcg gttggcgatc tggtgcaggt ggtgaactcc 660

atcagcgatg gcgatgttaa cgcgctggtc gatgagtacg aaagctgcta caccatgacg 720

cctgcgacac aaatccacgg cgaaaaacga cagaacgtgc tggaagcggc gcgtattgag 780

ctggggatga agcgtttcct ggaacaaggt ggcttccacg cgttcaccac cacctttgaa 840

gatttgcacg gtctgaagca gcttcctggt ctggccgtac agcgtctgat gcagcagggc 900

tacggctttg cgggcgaagg cgactggaaa actgccgccc tgcttcgcat catgaaggtg 960

atgtcaaccg gtctgcaggg cggcacctcc tttatggagg actacactta ccacttcgaa 1020

aaagataatg acctggtgct cggctcccat atgctggaag tctgtccgtc gatcgccgta 1080

gaagagaaac cgatcctcga cgttcaacac ctcggtattg gcggtaaaga cgatcctgcc 1140

cgcctgatct tcaacactca aaccggtccg gccattgtcg ccagtctgat tgatctcggc 1200

gatcgttacc gtctgctggt taactgcatc gacactgtga aaacaccgca ctccctgccg 1260

aaactgccgg tggcgaatgc gctgtggaaa gcgcaaccgg atctgccaac tgcttccgaa 1320

gcgtggatcc tcgctggtgg cgcgcaccat accgttttca gccatgcgct gaacctcaac 1380

gatatgcgcc agttcgccga gatgcacgac attgaaatca cggtgattga taacgacacc 1440

cgcctgccag cgtttaaaga cgcgctgcgc tggaacgaag tgtattacgg atttcgtcgc 1500

atg 1503

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgaatggac caataataat gactagagaa gaaagaatga agattgttca tgaaattaag 60

gaacgaatat tggataaata tggggatgat gttaaggcta ttggtgttta tggctctctt 120

ggtcgtcaga ctgatgggcc ctattcggat attgagatga tgtgtgtcat gtcaacagag 180

gaagcagagt tcagccatga atggacaacc ggtgagtgga aggtggaagt gaattttgat 240

agcgaagaga ttctactaga ttatgcatct caggtggaat cagattggcc gcttacacat 300

ggtcaatttt tctctatttt gccgatttat gattcaggtg gatacttaga gaaagtgtat 360

caaactgcta aatcggtaga agcccaaacg ttccacgatg cgatttgtgc ccttatcgta 420

gaagagctgt ttgaatatgc aggcaaatgg cgtaatattc gtgtgcaagg accgacaaca 480

tttctaccat ccttgactgt acaggtagca atggcaggtg ccatgttgat tggtctgcat 540

catcgcatct gttatacgac gagcgcttcg gtcttaactg aagcagttaa gcaatcagat 600

cttccttcag gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct 660

gagaaacttc tggaatcgct agagaatttc tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga 720

cacggatata tagtggatgt gtcaaaacgc ataccattt 759

<210> 5

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgttacagt ctatcccggc attgccagtc ggggatatta aaaagagtat aggtttttat 60

tgcgataaac taggtttcac tttggttcac catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt 120

aatgaggttc ggattcatct atgggaggca agtgatgaag gctggcgctc tcgtagtaat 180

gattcaccgg tttgtacagg tgcggagtcg tttattgctg gtactgctag ttgccgcatt 240

gaagtagagg gaattgatga attatatcaa catattaagc ctttgggcat tttgcacccc 300

aatacatcat taaaagatca gtggtgggat gaacgagact ttgcagtaat tgatcccgac 360

aacaatttga ttagcttttt tcaacaaata aaaagctaa 399

Claims (6)

1.一种组合物，其特征在于，含有表达β-半乳糖苷酶的重组菌和表达阿拉伯糖异构酶的重组菌；

所述重组菌表达丙氨酸消旋酶基因alrA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述β-半乳糖苷酶与阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

所述重组菌以枯草芽孢杆菌B. subtilis 168为宿主，以pMA5为表达载体；

所述枯草芽孢杆菌B. subtilis 168去除了丙氨酸消旋酶基因alrA；所述载体pMA5去除了卡那霉素和博来霉素抗性基因。

2.一种合成塔格糖的方法，其特征在于，以乳糖为底物，加入权利要求1所述组合物反应70~90 h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是在pH 8.0-9.0，温度为45-55℃的条件下反应。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的反应体系中，表达β-半乳糖苷酶的重组菌和表达阿拉伯糖异构酶的重组菌的细胞数量比为1：（15~20）；方法的反应体系中菌悬液浓度为OD ₆₀₀ 为40~50。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系中添加2~5 mmol/L的Mn²⁺和透化剂0.1% TritonX-100。

6.权利要求1所述组合物或权利要求2~5任一所述合成塔格糖的方法在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。

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