CN114875013A - 一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β‑半乳糖苷酶的方法。属于基因工程以及微生物工程技术领域，本发明通过人工合成lacZBa基因、设计引物、PCR获得B.aryabhattai Gel‑09来源β‑半乳糖苷酶目的基因，构建重组质粒pCut‑lacZBa，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600，得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产β‑半乳糖苷酶lacZBa。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达β‑半乳糖苷酶，产酶水平高，便于分离纯化，且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

Description

一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的 方法

技术领域

本发明属于酶工程和微生物工程技术领域，涉及一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，特别是涉及一种高效分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的重组枯草芽孢杆菌。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统是一种具有重要价值的原核表达系统。1958年，枯草芽孢杆菌吸收外源基因这一特性被发现，该系统逐渐被广泛研究，目前枯草芽孢杆菌表达系统已被广泛用于淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等多种工业酶的生产中。

枯草芽孢杆菌表达系统具有众多的优点：培养条件相对简单，在成分较为普通的培养基中仍可生长到高密度；发酵工艺成熟，可以进行高密度发酵；该系统没有明显的密码子偏好且遗传性较强，噬菌体和质粒均能作为载体；另外，枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，结构简单，不含有内毒素，无致病性，也被称作食品安全菌；枯草芽孢杆菌表达系统具有强大的蛋白分泌系统，枯草芽孢杆菌中至少有4种依赖于信号肽的蛋白质分泌表达系统，具体为经典分泌途径(Sec依赖的蛋白质分泌途径)、双精氨酸分泌途径(Tat依赖的蛋白质分泌途径)、ABC分泌途径(ATP结合性盒式转运蛋白)以及假菌丝蛋白输出途径。因此，相较于大肠杆菌表达系统，外源蛋白在枯草芽孢杆菌中更易实现高效的胞外表达，除此之外，通过对枯草芽孢杆菌启动子以及表达强度的调控，更易避免包涵体的产生。

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)，全称为β-D-半乳糖苷酶，又称为乳糖酶，能够水解β-1,4-半乳糖苷键，将底物乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，有些也兼有转糖苷作用，是一种具有重要应用价值的工业酶。全世界有70％以上的成年人口存在乳糖不耐受问题，其中90％以上是东亚人。β-半乳糖苷酶能催化乳糖分子中β-1,4-糖苷键的水解，可用于无乳糖、低乳糖牛奶等乳制品的生产，具有重要应用价值。同时，乳糖的水解可以形成更多葡萄糖和半乳糖，更利于牛奶的发酵和提高酸奶中乳酸的含量。此外，乳糖水解为溶解度更高的单糖，可避免在炼乳和冰淇淋等产品中形成乳糖结晶(砂砾现象)，有利于提高产品的风味和质量。由于乳品工业对β-半乳糖苷酶的巨大需求，近年来β-半乳糖苷酶的生产受到了广泛关注。重组表达是获得高产β-半乳糖苷酶的主要方法，但表达水平却受包括目标蛋白的性质、密码子使用偏好、表达系统、发酵条件等多种因素影响。以往的研究表明，大多数细菌来源的β-半乳糖苷酶是胞内酶。胞内酶的工业化生产有许多缺点：可溶性表达较低；容易形成包涵体；下游操作过程复杂且成本高昂。因此，如何实现天然胞内β-半乳糖苷酶的胞外分泌，对β-半乳糖苷酶的高效制备具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种具有高分泌能力的重组枯草芽孢杆菌，能够将天然胞内β-半乳糖苷酶高效地胞外分泌生产。

技术方案：本发明所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主，以pCut为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09来源的天然胞内β-半乳糖苷酶。

进一步的，构建权利要求1所述的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)的方法，将SEQID NO.2所示的编码天然胞内β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体pCut连接，转入宿主重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600；具体的：

(1)、扩增SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶基因；

(2)、将克隆出的目的基因SEQ ID NO.2连接到表达载体pCut，构建重组载体pCut-lacZBa，转化至克隆宿主E.coli JM109进一步克隆、

(3)、将重组质粒pCut-lacZBa通过化学转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主，获得枯草芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因工程菌。

进一步的，一种高效分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，将所述的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)接种至发酵培养基中，于37℃，200rpm培养60-96h。

具体的，在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶lacZBa的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述β-半乳糖苷酶lacZBa的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第一个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO.2所示的编码β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体连接，转入重组枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pCut。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis WB400，Bacillus subtilis WB800。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

本发明的第二个目的是提供一种高效分泌β-半乳糖苷酶的方法，所述方法是将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于37℃，200rpm培养60-96h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为TB培养基。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点：1、本发明的β-半乳糖苷酶lacZBa原为胞内酶，以食品准入的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主构建了表达β-半乳糖苷酶lacZBa的重组枯草芽孢杆菌，可使β-半乳糖苷酶lacZBa胞外分泌表达，并且发酵上清液中的酶活力达到5.3U·mL^-1；2、本发明的β-半乳糖苷酶lacZBa在枯草杆菌表达系统中并非通过经典分泌途径(Sec依赖的蛋白质分泌途径)或双精氨酸分泌途径(Tat依赖的蛋白质分泌途径)胞外分泌的，而是通过非经典分泌途径胞外分泌；3、本发明对比了在大肠杆菌表达系统(Ec)和枯草杆菌表达系统(Bs)中的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的酶学性质的差异，lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适pH分别为5.5和6.0，lacZBa(Bs)最适pH比lacZBa(Ec)低了0.5。lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适温度分别为50℃和45℃，lacZBa(Bs)最适温度比lacZBa(Ec)高了5.0℃。lacZBa(Bs)的pH稳定性较lacZBa(Ec)明显提高，在不同pH条件下，其残余酶活均保持在65％以上。lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)在50℃下的半衰期分别为108h和36h，lacZBa(Bs)热稳定性较lacZBa(Ec)提高了3倍。

附图说明

图1是本发明中重组质粒pCut-lacZBa、pCut-SPphoD-lacZBa和pCut-SPamyE-lacZBa的质粒图谱示意图；

图2是本发明中SDS-PAGE分析Tat信号肽和Sec信号肽和无信号肽对β-半乳糖苷酶lacZBa在Bacillus subtilis WB600胞外分泌的影响示意图；

其中，M，蛋白质标准品；1、2、3，Bacillus subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀；4、5、6，Bacillus subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀；7、8、9，Bacillus subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀；

图3是本发明中枯草芽孢杆菌表达系统中蛋白质主要分泌途径示意图；

图4是本发明中通过SDS-PAGE分析比较lacZBa在大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统中的表达；M，蛋白质分子量标准；1.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的破细胞沉淀；2.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的破细胞上清；3.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的发酵液上清；4.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清；5.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的破细胞上清；6.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的破细胞沉淀；

图5是本发明中在大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适pH和pH稳定性的比较图；

图6是本发明中在大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适温度和温度稳定性的比较图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli JM109购自北京索莱宝科技有限公司，Bacillus subtilis WB600购自Novagen公司，质粒pCut由实验室保藏。

(上述菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600、大肠杆菌JM109均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基和溶液配制如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1；

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g·L^-1；

TB培养基：甘油5.0g·L^-1、胰蛋白胨12.0g·L^-1、酵母粉24.0g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O16.4g·L^-1、KH₂PO₄ 2.3g·L^-1；

10×最低盐溶液：K₂HPO₄·3H₂O 1.834g·L^-1，KH₂PO₄ 0.6g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 0.2g·L^-1，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 0.1g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.02g·L^-1；

GMⅠ溶液：10×最低盐溶液10mL，50％葡萄糖1mL，5％酪蛋白0.4mL，10％酵母汁1mL，2mg·mL^-1L-色氨酸2.5mL，无菌水42.5mL；

GMⅡ溶液：10×最低盐溶液10mL，50％葡萄糖1mL，5％酪蛋白0.08mL，10％酵母汁0.04mL，0.5M MgCl₂ 0.5mL，0.1M CaCl₂ 0.5mL，2mg·mL^-1L-色氨酸0.5mL，无菌水87.5mL；

100×EGTA溶液：EGTA 0.111g·L^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

β-半乳糖苷酶酶活的测定方法：

在试管中加入1.8mL 100mmol·L^-1pH 6.0的磷酸缓冲液，再向反应体系中加入100μL的稀释不同梯度的β-半乳糖苷酶酶液，放入50℃的水浴锅中保温5min，分别向反应体系中加入100μL的oNPG溶液精确反应10min后，加入1mL预冷的1mol·L^-1Na₂CO₃溶液中止反应并显色，于紫外分光光度计420nm处测定吸光值；

另取100μL oNPG溶液、1.8mL 100mmol·L^-1pH 6.0的磷酸缓冲液和1mL 1mol·L^-1的Na₂CO₃于50℃水浴中保温10min后，加入100μLβ-半乳糖苷酶酶液，此吸光值作为空白对照；

酶活的(U)定义为：在上述分析测定条件下，将每分钟催化产生1μmol oNP的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。

实施例1：含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-SPamyE-lacZBa表达载体的构建；

所述β-半乳糖苷酶lacZBa的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGTACATCGGCGTCGATTATTACCCTGAACATTGGCCAGAGAATATGATAGAAGAAGATATCCAAGGTATTAAAGAGTTAGGATCAAATATGGTGAGAATAGGGGAGTTCGCTTGGCATCTTATGGAGCCTAAAGAAGGGCAATATGACTTTTCTTTTTTTGATAGCGTTATCAATAAGCTTAAAAAACAGAATATTGACGTTATGTTTGGTACCCCTACTGCCACTTTTCCGGCTTGGCTTGCGAAGCAGCATCCTTCTATTTTATCAAAAGATGAAAATGGGGCGGTCAGAGCATTTGGAGGAAGACGTCAATATTGTTTTAATTCTCCTCTTTACCGGCAGTATAGCGCTCAGATTACAGAACAACTAGTAAAGCACTACTGCTCAGAAGAAGCAATCGTAGCATGGCAAGTTGACAATGAATTTGGCCATGAAGGCAGTGATATGTGTTACTGCGAACAATGTCATAAAGAGTTTCAGCAGTTTTTGGAAAGAAAATATAAAGATATTAATGAGTTAAATGAAAAGTATGGCACTATTTTCTGGGGACAAACGTATAACGACTTTACCGAAGTGCCTATGCCTGTAAAAACAATTACGACACACAGCCCTTCGTTAAAGCTAGACTGGGCCCGCTTTCGCTCTTTTTCGTTAAACAGATACGCTCACGAACAAACAGCGATTGTGAAGAAATATAAAGGTGATCACCAGCTGTTGACCACGAACGTATCAGGAGGCTTTTTTGATAAATGGTTCGATCATGAAGAAAACCTAGAAGTAATGGACTTTGTATCCTATGATAATTATCCGGTATGGGGCGGTCAAACAGAGCCAATTACCCCGGCTCATATTGCACTAGGTCATGATTTTAATAGAGGCTTGTTACATAAAAATTTCTGGATTGTAGAGGAATTAATGGGTGCTCAAGGTCATGATATCATCGGTTATCTACCGCGACCTAATCAGGCAAAAATGTGGTCTTATCAAGCTTTTGCTCATGGATGCACGAATATGCTGTATTTTCGCTGGCGCGGAATGACAAGAGGAGCTGAGCAATACTGCTACGGAATTGTAGGTCACGATAATCACTATGGAAAACGTTACAAAGAAGTTCAGTCGTTATTTAGTGAAATCGTTCATTACGAACATGTGCTTGAGTCTGATATTAAATCGGAGATTGCCGTTTTATATGACTATGAAAATATATGGTCATGGCGTTTTCAGCAGCAAAGTGAAGGGTTTGACTTTACGGAAGAGCTTCTTAGAGGGTATACACCGTTTTATAAGTTGAATACACCTATTGATGTTATTCCTGCTACAAGAGATTTTTCAAGCTATAAAGTACTGGTTGTTCCGGCTTTGCAAATCATTGATAAAGAACTAGGTAAAAGATTTACTGAATTTACTGAAAACGGAGGCGTCATCGTTTTTACGTTTAGAACCGGCATTAAAGACAAACAAAATAATATTCACTTTAAACAGACGCTGCCCGGATATGTAAAAGAAATAACAGGGATTGAAATTCATGAAGTGGAAGCACTGTCTTCTACTCAAAAAGCAGCTATTAAAGGAAAAGGACCGTATGAAGGAGAACAAGCAAGTGCGTCCGTGTGGAGAGACATTATCACACCTGTAACAGCTGAAGTGCTGTATGAGTATGATGATCCATTTTATAATCAAGCGGCTGTAACAAAAAATCAGTTTGGTCGCGGGACGGTCTATTATGTAGGCTGTGGAATTGAAGGGCAAACGTTTGAAAAAATGGCGCTTGATATTGTAAAACAGCAGCAGATTGAGCATACGGAAAGTGAAGATGGAGTTGAAGTATATCCTCGCAAGCTTGGAGAGACAAGTTATTACTTCCTTATGAACCATACGCCAGAAGTAAAAGTATTTAAAGATATTGTTCTGCAGCCTTACGAAAGTCGAGTTGTAGAAAACATGTAG；

所述β-半乳糖苷酶基因(SEQ ID NO.2)编码的β-半乳糖苷酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MYIGVDYYPEHWPENMIEEDIQGIKELGSNMVRIGEFAWHLMEPKEGQYDFSFFDSVINKLKKQNIDVMFGTPTATFPAWLAKQHPSILSKDENGAVRAFGGRRQYCFNSPLYRQYSAQITEQLVKHYCSEEAIVAWQVDNEFGHEGSDMCYCEQCHKEFQQFLERKYKDINELNEKYGTIFWGQTYNDFTEVPMPVKTITTHSPSLKLDWARFRSFSLNRYAHEQTAIVKKYKGDHQLLTTNVSGGFFDKWFDHEENLEVMDFVSYDNYPVWGGQTEPITPAHIALGHDFNRGLLHKNFWIVEELMGAQGHDIIGYLPRPNQAKMWSYQAFAHGCTNMLYFRWRGMTRGAEQYCYGIVGHDNHYGKRYKEVQSLFSEIVHYEHVLESDIKSEIAVLYDYENIWSWRFQQQSEGFDFTEELLRGYTPFYKLNTPIDVIPATRDFSSYKVLVVPALQIIDKELGKRFTEFTENGGVIVFTFRTGIKDKQNNIHFKQTLPGYVKEITGIEIHEVEALSSTQKAAIKGKGPYEGEQASASVWRDIITPVTAEVLYEYDDPFYNQAAVTKNQFGRGTVYYVGCGIEGQTFEKMALDIVKQQQIEHTESEDGVEVYPRKLGETSYYFLMNHTPEVKVFKDIVLQPYESRVVENM；

表达载体的构建具体步骤如下：

设计并化学合成一段核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因，根据合成的β-半乳糖苷酶基因设计引物F1和R1：

F1：5’-CGAATGAGCTTACAGATGTACATCGGCGTC GATT-3’(SEQ ID No.3)；

R1：5’-GGTTATGCTAGAAGCTTCTACATGTTTTCTACAACTCGACT-3’(SEQ ID No.4)；

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，B.aryabhattai Gel-09基因组模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃2min)；72℃继续延伸20min；收集PCR产物进行胶回收；

根据质粒pCut上下游序列设计一对引物F2和R2：

F2：5’-AAGCTTCTAGCATAACCCCTTG-3’(SEQ ID No.5)；

R2：5’-CTGTAAGCTCATTCGATTTGTTCG-3’(SEQ ID No.6)；

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，质粒模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃6min20s)；72℃继续延伸20min；向反应产物中加入2μL DpnⅠ，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5-2h，然后进行胶回收；

将基因lacZBa胶回收片段与表达载体pCut-SPamyE胶回收片段进行连接后，转化E.coli JM109，涂布到含有终浓度100μg·mL^-1氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并测序验证；最终，测序正确的重组质粒即为pCut-SPamyE-lacZBa(见图1)。

实施例2：含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-SPphoD-lacZBa表达载体的构建

具体步骤如下：

含有β-半乳糖苷酶基因lacZBa(SEQ ID No.2)的重组质粒pCut-SPamyE-lacZBa上下游序列设计一对引物：

F3：5’-ATGCTGCGATGTACATCGGCGTCGATT-3’(SEQ ID No.7)；

R1：5’-AATAAATCCCCCTTTTTGAAAATAC-3’(SEQ ID No.8)；

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，pCut-SPamyE-lacZBa质粒模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃2min)；72℃继续延伸20min；向反应产物中加入2μL DpnⅠ，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5-2h，进行胶回收，得到片段A；

以B.subtilis 168基因组DNA为模板，根据SPphoD基因片段的上下游序列设计一对引物F4和R4：

F4：5’-AGGGGGATTTATTATGGCATACGACAGTCGTTT-3’(SEQ ID No.9)；

R4：5’-GACGCCGATGTACATCGCAGATTTACTTCAAAGGC-3’(SEQ ID No.10)；

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，B.subtilis 168基因组模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃15s)；72℃继续延伸20min；收集PCR产物进行胶回收，得到片段B；

将胶回收片段A与胶回收片段B进行连接后，转化E.coli JM109，涂布到含有终浓度100μg·mL^-1氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并测序验证；最终，测序正确的重组质粒即为pCut-SPphoD-lacZBa(见图1)。

实施例3：含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-lacZBa表达载体的构建

具体步骤如下：

以B.aryabhattai Gel-09基因组为模板，根据β-半乳糖苷酶基因(SEQ ID No.2)上下游序列设计一对引物F6和R1，如下：

F6：5’-AGGGGGATTTATTATGTACATCGGCGTCGATT-3’(SEQ ID No.11)；

R1：5’-GGTTATGCTAGAAGCTTCTACATGTTTTCTACAACTCGACT-3’(SEQ ID No.4)

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，B.aryabhattai Gel-09基因组模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃2min)；72℃继续延伸20min；收集PCR产物进行胶回收。

根据质粒pCut上下游序列设计一对引物F2和R2：

F2：5’-ATAATAAATCCCCCTTTTTGAAAATA-3’(SEQ ID No.12)；

R2：5’-AAGCTTCTAGCATAACCCCTTG-3’(SEQ ID No.13)；

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，质粒模板DNA 1μL，Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃6min20s)；72℃继续延伸20min；向反应产物中加入2μL DpnⅠ，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5-2h，然后进行胶回收；

将基因lacZBa胶回收片段与表达载体pCut胶回收片段进行连接后，转化E.coliJM109，涂布到含有终浓度100μg·mL^-1氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并测序验证；最终，测序正确的重组质粒即为pCut-lacZBa(见图1)。

实施例4：重组质粒pCut-SPamyE-lacZBa、pCut-SPphoD-lacZBa和pCut-lacZBa转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600

(1)、用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌，然后在LB固体平板上划线，37℃培养过夜活化；

(2)、挑取单菌落接种于10mL GMⅠ液体培养基中，37℃过夜培养18h，测定光密度值OD₆₀₀用于计算步骤(3)中的接种量；

(3)、取一定量的过夜培养物，接种到4.5mL的GMⅠ液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养4-5h；

(4)、吸取1mL菌液(步骤3中)至含有9mL预热的GMⅡ的液体培养基中，37℃，200rpm，振荡1.5h；

(5)、向上述培养菌液中加入100μL 100×EGTA溶液，37℃，100rpm，振荡10min；此时培养物中有很多感受态细胞形成；

(6)、5000rpm离心10min，缓慢弃掉上清，收集菌体；用1mL GMⅡ的液体培养液轻轻悬浮，分装成0.5mL/管，即为感受态细胞；

重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞：

(1)、利用Nanodrop分别测定pCut-SPamyE-lacZBa，pCut-SPphoD-lacZBa，pCut-lacZBa的质粒浓度，用于计算下一步所加质粒量；

(2)、向3管感受态细胞中分别加入1μg的pCut-SPamyE-lacZBa，pCut-SPphoD-lacZBa，pCut-lacZBa重组质粒，37℃，100rpm振荡培养30min，再200rpm振荡培养60min；

(3)、4000rpm离心5min，离心去除大部分的上清液，重悬细胞，涂在含有终浓度30μg·mL^-1的四环素的筛选平板上，37℃培养过夜，挑取阳性克隆子并保存甘油管，最终获得含有目的基因的基因工程菌B.subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa，B.subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa，B.subtilis WB600/pCut-lacZBa。

实施例5：摇瓶发酵产酶

将实施例4中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至TB发酵培养基(均含有终浓度30μg·mL^-1的四环素)中，放至37℃、200rpm恒温培养60-96h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液；

对粗酶液中的酶活进行测定，结果显示，在含有SPamyE信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa的发酵液中没有检测到lacZBa活性；在含有SPphoD信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa发酵液中，发酵72h后，上清液中β-半乳糖苷酶酶活仅为0.54U·mL^-1；而在不含有任何信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清中的β-半乳糖苷酶酶活力为5.3U·mL^-1；重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-lacZBa胞外β-半乳糖苷酶活力是含有SPphoD信号肽重组菌株所产胞外酶活力的9.8倍，实现了天然胞内β-半乳糖苷酶胞外的高效分泌(见图2和表1)。

与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌具有更强的蛋白胞外分泌能力；如图3，在枯草芽孢杆菌表达系统中至少有四种不同的蛋白质分泌途径，其中，Sec分泌途径是最主要的分泌途径；Tat分泌途径是枯草芽孢杆菌中另一种重要的蛋白质分泌途径；Sec分泌途径和Tat分泌途径均需要相应的信号肽参与，而在本发明中，lacZBa在存在信号肽时会抑制其分泌表达，因此lacZBa可能通过涉及非经典分泌途径的类似机制分泌。

表1三种不同分泌途径lacZBa产量的比较

将实验室保藏的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-lacZBa接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至TB发酵培养基(含有终浓度50μg·mL^-1的卡那霉素)中，先放至37℃、200rpm恒温培养3h，再加入0.2mmol·L^-1IPTG于30℃、200rpm继续培养36h产酶；发酵结束，离心收集发酵上清和细胞沉淀，细胞沉淀用磷酸缓冲液悬浮后进行细胞破碎，再离心收集细胞破碎上清和沉淀(见图4)。

实施例6：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达中酶学性质的比较研究

具体步骤如下：

(1)、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-半乳糖苷酶的最适pH及pH稳定性

在不同的pH(pH 4.5-8.0)条件下，每隔0.5个单位设置一个点测定β-半乳糖苷酶酶活力，以确定重组β-半乳糖苷酶的最适pH。测定的最高酶活力定为100％，计算其他pH条件下的相对酶活(检测结果见图5a)；为了研究重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性，将酶液分别在pH 4.5-8.0的缓冲体系下于4℃保存24h，测定其残余酶活，定义初始酶活力为100％(检测结果见图5b)；

如图5a所示，在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)最适pH为6.0，在枯草芽孢杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)最适pH为5.5；如图5b所示，在对比了两者pH稳定性后发现，β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)较lacZBa(Ec)的pH稳定性明显增强，其在不同pH条件下的残余酶活均在65％以上；

(2)、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-淀粉酶的最适温度及温度稳定性

在不同的pH(pH 4.5-8.0)条件下，每隔0.5个单位设置一个点测定β-半乳糖苷酶酶活力，以确定重组β-半乳糖苷酶的最适pH；测定的最高酶活力定为100％，计算其他pH条件下的相对酶活(检测结果见图6a)；为了研究重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性，将酶液分别在pH 4.5-8.0的缓冲体系下于4℃保存24h，测定其残余酶活，定义初始酶活力为100％(检测结果见图6b)；

如图6a所示，在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)的最适温度为45℃，在枯草芽孢杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)的最适温度为50℃；如图6b，lacZBa(Bs)在50℃下的半衰期为108h，其热稳定性较lacZBa(Ec)明显提高，说明在枯草芽孢杆菌表达系统中的β-半乳糖苷酶更耐热，这可能是由于枯草芽孢杆菌具有更加完善的蛋白折叠机制，所表达蛋白折叠更好，从而具有更好的稳定性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶lacZBa的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，

所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法是：将SEQ ID NO.2所示的编码β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体连接，转入至重组枯草芽孢杆菌中。

3.根据权利要求2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，

所述表达载体为pCut。

4.根据权利要求2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，

所述重组枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis WB400，Bacillus subtilis WB800。

5.根据权利要求1或2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，

以重组枯草芽孢杆菌为宿主，以pCut为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09来源的天然胞内β-半乳糖苷酶。

6.根据权利要求5所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，具体操作方法如下：将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于37℃，200rpm中培养60-96h。

7.根据权利要求6所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，

所述发酵培养基为TB培养基。

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