CN116640740A - 肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用，属于合成生物学和基因工程技术领域。本发明提供了从肠道微生物中筛选的具有α‑1,2特异性的岩藻糖基转移酶及其编码基因，利用基因重组技术，将这些岩藻糖基转移酶的编码基因在地衣芽孢杆菌中异源表达，所获得的重组菌株可用于2’‑岩藻糖基乳糖的发酵生产。本发明所发现的岩藻糖基转移酶催化活力高，且最适催化温度与细菌的高温发酵所匹配，在母乳寡糖的发酵生产等应用中具有很大的潜力。

Description

肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用
技术领域
本发明涉及肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用，属于合成生物学和基因工程技术领域。
背景技术
母乳寡糖是只存在于母乳中的一种重要低聚糖，在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能，以及促进大脑发育等方面发挥着不可替代的作用。其中2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)占母乳寡糖总量的30％，是占比最高的一种母乳寡糖。它可由L-岩藻糖和乳糖通过岩藻糖基转移酶催化合成。
近年来，研究者已开始广泛地使用微生物发酵法生产2’-FL，主要使用的宿主菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。这些微生物的野生型基因组中已含有2’-FL合成途径的多种酶，如甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶等，然而均没有岩藻糖基转移酶。目前在2’-FL重组菌株构建中应用最为广泛的岩藻糖基转移酶基因是幽门螺杆菌来源的futC和大肠杆菌O126来源的wbgL。虽然已有研究利用以上两种微生物来源的岩藻糖基转移酶构建获得了可以生产2’-FL的重组菌，但是futC和wbgL编码的岩藻糖基转移酶在40℃以上的温度条件下催化效率极低。由于工业微生物的高温发酵对于降低染菌风险，提高发酵效率和降低发酵成本均十分有利，因此，挖掘与筛选催化效率高，且最适催化温度与细菌高温发酵条件相匹配的岩藻糖基转移酶，在2’-FL的发酵生产等应用中具有很大的潜力。
肠道微生物是与母乳寡糖具有重要相互作用的一类微生物，它们所产生酶所介导的水解或转糖基反应可以改变母乳寡糖的结构。因此，肠道微生物有可能成为新型糖基转移酶的来源。然而，肠道微生物大多难以在体外的标准条件下进行纯培养及分离，阻碍了肠道微生物来源的催化效率高且耐高温的岩藻糖基转移酶的筛选。
发明内容
针对上述缺乏一种催化效率高、耐高温的岩藻糖基转移酶，且难以筛选的技术问题，本发明的目的在于利用宏基因组学技术，提供肠道微生物来源的催化活力高、且最适催化温度与细菌高温发酵所匹配的岩藻糖基转移酶及其编码基因。经过对携带了该基因的重组微生物发酵及代谢产物检测发现所筛选出的新酶可以在42℃的条件下高效合成2’-FL，从而在母乳寡糖的发酵生产等应用中具有很大的潜力。
本发明提供一种肠道微生物来源的具有ɑ-1,2特异性的岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示，命名为HM31。
本发明提供一种肠道微生物来源的具有ɑ-1,2特异性的岩藻糖基转移酶的编码基因，所述岩藻糖基转移酶的编码基因是从肠道宏基因组中筛选获得；其核苷酸序列由SEQID NO.2所示，编码HM31；
本发明还提供所述岩藻糖基转移酶在高温发酵2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
在一种实施方式中，在一种实施方式中，所述高温发酵是在37-42℃发酵。
在一种实施方式中，将所述的岩藻糖基转移酶的重组菌进行发酵。
在一种实施方式中，所述重组菌的宿主为地衣芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述重组菌的构建方法包含以下步骤：
(1)通过同源重组将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示PLan启动子和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示木糖异构酶基因的终止子ter分别与SEQ ID NO.5所示磷酸甘露糖变位酶基因manB、SEQ ID NO.6所示甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶基因manC、SEQ ID NO.7所示GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd、SEQ ID NO.8所示GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG以及岩藻糖基转移酶基因HM31融合，获得基因表达片段H1、H2、H3、H4与O5；
(2)分别使用引物对扩增基因表达片段H1、H2、H3、H4与O5，从而在基因片段两端引入酶切位点。依次利用同源重组的方法将基因表达片段H1、H2、H3连接入pHY300PLK质粒，得到重组质粒pHY-H123。再依次利用同源重组的方法将基因表达片段H4和O5连接入pHT43质粒，得到重组质粒pHT-O45。利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步验证质粒的构建情况；
(3)将成功构建的重组质粒pHYH123转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，获得地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，再将重组质粒pHT-O45以上述相同的方法转化地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，获得重组地衣芽孢杆菌菌BLO2。
在一种实施方式中，将所述重组菌在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于30mL的摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵，控制初始OD为0.5-1，于37℃或42℃、250r·min-1培养；
或将上述重组菌于发酵温度42℃、初始pH7.5的条件下在发酵罐中进行补料分批发酵。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为800rpm。发酵8h后连续补加蔗糖，维持其不被耗尽。
本发明还提供了所述岩藻糖基转移酶在生产含2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述产品包括婴儿配方奶粉。
有益效果
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种肠道微生物来源的新型岩藻糖基转移酶HM31，其催化效率高，且在高温发酵(42℃)下仍具有较好的催化功能，在工业应用中有助于降低染菌风险，提高发酵效率和降低发酵成本。
(2)本发明构建了表达岩藻糖基转移酶HM31的地衣芽孢杆菌重组菌BLO2，在42℃培养条件下，重组菌BLO2发酵36h后可以得到2.52g/L的2’-FL；重组菌BLO2在30L发酵罐补料分批发酵46h后2’-FL的产量达到47g/L，最大OD600为72.8。
附图说明
图1：重组质粒pHY-H123质粒图谱。
图2：重组质粒pHT-O45质粒图谱。
图3：重组质粒验证的电泳图谱；M，标准分子量Marker；泳道1，pHY-H123使用SmaI和EcoRI双酶切；泳道2，pHTO45使用EcoRV单酶切；泳道3-10，转化子菌落PCR验证样品。
图4：重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶的蛋白电泳检测；M，标准蛋白分子量Marker；泳道1，重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶。
图5：不同温度条件下重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶的酶活。
图6：发酵上清液中2'-FL的HPLC定量分析。
具体实施方式
下述实施例中涉及的菌株和引物。
表1本发明中涉及的菌株
表2引入酶切位点所用引物序列
表3引物序列
本发明所用基因序列均为人工合成。
本发明涉及到的检测方法与计算方法如下：
酶活检测方法为：反应体系为20μL，其中含有0.5μmol/L底物GDP-岩藻糖、20mmol/LMnCI2、1％Triton X-100、50mmol/L甲次胂酸盐-盐酸缓冲液(pH 5.8)、0.5nmol/L苯-β-D-半乳糖及重组菌细胞破碎上清液(其中包含总蛋白量0.5mg)，总体积为100μL。蛋白质浓度通过布拉德福德方法测定，使用以BSA为标准蛋白质的Bio-Rad蛋白质测定试剂盒。混合液在37℃下孵育1h后，用300μL氯仿/甲醇(2:1，v/v)终止反应，混匀后于12000rpm离心3min，取上清进行HPLC检测，通过HPLC检测反应体系中产物的生成量计算重组菌细胞破碎上清液中岩藻糖基转移酶HM31的酶活。酶活定义为在所设定的反应条件下1h生成1pmol产物所需要的酶量为1U。
HPLC检测2’-FL：
样品处理方法：
1.发酵液12000r/min、离心20min，
2.取上清500ul,加入终浓度为70％的无水乙醇，-20℃2h，
3.再12000r/min、离心20min后取上清液200ul置于液相进样瓶中。
色谱柱:Dikma CarboPac Ca2+300x 8.0mm,6μm(Cat.No:99304)流动相:水流速:1.0mL/min检测器:RI柱温:80℃进样量:10μL。
蛋白质浓度检测：
测定蛋白含量参照考马斯亮蓝染液法：取40μL待测样品加到200μL的考马斯亮蓝溶液中，缓慢混匀后静置5min，于595nm处检测溶液吸光值，根据蛋白浓度标准曲线y＝0.2215x-0.0006(x为595nm处的吸光值，y为蛋白浓度mg·mL-1，R2＝0.9975)计算样品中的蛋白质浓度。
比酶活(U/mg)的计算：
每毫升样品溶液中的酶活(U)除以其蛋白浓度(mg)。
实施例1岩藻糖基转移酶基因序列的确定
利用dbCAN2对比工具，将无锡市采集的婴儿肠道宏基因组与CAZyme数据库进行比对，筛选比对到family 1glycosyltransferases(GT1)的基因序列，再经过蛋白质一级结构模拟预测(ExPASy-ProtParam)、二级结构模拟预测(SOPMA)、三维结构模板预测(SWISS-MODEL)筛选出结构稳定性强的岩藻糖基转移酶基因，命名为HM31，人工合成HM31基因片段，并进行异源表达和活性测试。
具体方式为通过同源重组将PLan启动子(核苷酸序列SEQ ID NO.3所示)和木糖异构酶基因的终止子ter(核苷酸序列SEQ ID NO.4所示)分别与编码岩藻糖基转移酶HM31的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)克隆至载体pHY300-PLK上，获得重组质粒pHY-HM31。
构建重组质粒pHY-HM31的具体方法为：首先以地衣芽孢杆菌基因组为模板，使用引物对PF11-F/R扩增PLan启动子序列，使用引物对PF13-F/R扩增终止子ter序列；以化学合成的SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，使用引物对PF32-F/R扩增HM31编码基因序列。然后通过同源重组，将上述三个片段一次性连接至使用HindIII和BamHI双酶切线性化的pHY300-PLK上，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒，得到重组质粒pHY-HM31。
将重组质粒pHY-HM31转化入地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，获得重组菌BHM31。在LB平板上培养重组菌，于37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于30mL的摇瓶发酵培养基，控制初始OD为0.5-1，于37℃或42℃、250r·min-1培养。发酵48h收集细胞，使用超声波破碎后获得粗酶液，检测破碎液上清中岩藻糖基转移酶的酶活。具体方法为：反应体系为20μL，其中含有0.5μmol/L底物GDP-岩藻糖、20mmol/L MnCI2、1％Triton X-100、50mmol/L甲次胂酸盐-盐酸缓冲液(pH 5.8)、0.5nmol/L苯-β-D-半乳糖及重组菌细胞破碎上清液(其中包含总蛋白量0.5mg)，总体积为100μL。蛋白质浓度通过布拉德福德方法测定，使用以BSA为标准蛋白质的Bio-Rad蛋白质测定试剂盒。混合液在37℃下孵育1h后，用300μL氯仿/甲醇(2:1，v/v)终止反应，混匀后于12000rpm离心3min，取上清进行HPLC检测，通过HPLC检测反应体系中底物的减少量和产物的生成量间接计算重组菌细胞破碎上清液中岩藻糖基转移酶HM31的酶活。酶活定义为在所设定的反应条件下1h生成1pmol产物所需要的酶量为1U。结果显示重组菌BHM31细胞破碎液上清的中酶活为6.6U/mL。
实施例2岩藻糖基转移酶HM31的克隆及产2’-FL重组菌的构建
首先化学合成SEQ ID NO.2的核苷酸序列，用实施例1相同的方法，得到重组质粒pHY-HM31。
接着通过同源重组方式将PLan启动子(核苷酸序列SEQ ID NO.3所示)和木糖异构酶基因的终止子ter(核苷酸序列SEQ ID NO.4所示)分别与磷酸甘露糖变位酶基因manB(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶基因manC(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd(其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG(其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)连接至载体pHY300-PLK，构成含有4个表达框的质粒pHY-manB，pHY-manC，pHY-gmd，pHY-wcaG。
重组质粒的构建方法如下：
以重组质粒pHY-manB的构建方法为例：使用实施例1中相同的方法分别扩增PLan启动子序列和ter终止子序列；以化学合成的SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为模板，使用引物对PF42-F/R扩增manB编码基因序列，然后通过同源重组，将上述三个片段一次性连接至使用HindIII和BamHI双酶切线性化的pHY300-PLK上，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒，得到重组质粒pHY-manB。
以化学合成的SEQ ID NO.6所示核苷酸序列为模板，使用引物对PF52-F/R扩增manC编码基因序列，用上述相同方法，得到重组质粒pHY-manC。以化学合成的SEQ ID NO.7所示核苷酸序列为模板，使用引物对PF62-F/R扩增gmd编码基因序列，用上述相同方法，得到重组质粒pHY-gmd。以化学合成的SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为模板，使用引物对PF72-F/R扩增wcaG编码基因序列，用上述相同方法，得到重组质粒pHY-wcaG。
以重组质粒pHY-manB为模板，使用引物对P1进行扩增，获得含酶切位点的包括PLan启动子、manB基因和ter终止子的表达盒片段，命名为H1。用相同方法，分别以pHY-manC，pHY-gmd，pHY-wcaG，pHY-HM31为模板，使用引物对P2-P5分别进行扩增，得到相应表达盒片段，分别命名为H1、H2、H3、H4、O5。反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。依次利用同源重组的方法将基因表达片段H1、H2、H3连接入pHY300PLK质粒，得到重组质粒pHY-H123(图1)。再依次利用同源重组的方法将基因表达片段H4和O5连接入pHT43质粒，得到重组质粒pHT-O45(图2)。利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步验证质粒的构建情况(图3)。
将成功构建的重组质粒pHYH123按照Li,Y.；Jin,K.；Zhang,L.；Ding,Z.；Gu,Z.；Shi,G.Development of an Inducible Secretory Expression System in Bacilluslicheniformis Based on an Engineered Xylose Operon.Journal ofAgricultural andFood Chemistry 2018,66,9456-9464.的方法转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，获得地衣芽孢杆菌工程菌BLH1。具体转化方法为：首先挑取新鲜的地衣芽孢杆菌单菌落接种至50mLLBSP培养基(10g·L-1蛋白胨，10g·L-1氯化钠，5g·L-1酵母膏，0.50mol·L-1山梨醇)，于37℃，200rpm培养12h。接着，取0.4mL培养液转接至50mL LBS培养基中，于37℃，200rpm培养至菌体浓度达到600nm的吸光度(OD600)为0.6～0.8，冷冻离心(3000g，8min)收集菌体。用20mLSHMP培养基(0.5mol·L-1山梨醇，0.5mol·L-1甘露醇，10％甘油)重悬菌体，然后冷冻离心弃掉上清液以洗涤菌体，总共洗涤4次。完成后用1mL SHMP培养基重悬菌体细胞，取出90μL置于1.5mL离心管，向其中加入200ng左右的质粒，轻轻混匀后冰浴5min。之后将混合物转移到预冷的电转杯中，放入电转仪实施电穿孔，条件为：电压，1000V；时间，5ms。电击后迅速向混合物中加入800μL LBSPG培养基(10g·L-1蛋白胨，10g·L-1氯化钠，5g·L-1酵母膏，0.50mol·L-1山梨醇，0.38mol·L-1甘露醇)并轻轻混匀，于37℃100rpm培养2h，涂布于抗性平板37℃培养。
再将重组质粒pHT-O45以上述相同的方法转化地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，获得重组地衣芽孢杆菌菌BLO2。
实施例32’-FL的摇瓶发酵
将实施例2中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLO2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于30mL的摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵，控制初始OD为0.5-1，于37℃或42℃、250r·min-1培养。每隔12h取样，发酵液于4℃、12000r·min-1条件下离心10min，上清液用于检测产物(图6)。结果显示，在42℃培养条件下，工程菌BLO2发酵36h后可以得到2.52g/L的2’-FL，在37℃下，36h发酵液中2’-FL的产量为1.96g/L。
实施例4酶学性质表征
(1)重组菌培养基细胞破碎
使用摇瓶发酵培养基对重组菌株BLO2进行发酵，发酵条件为37℃、250rpm，培养时间48h。将发酵液于12000rpm离心10min后，弃上清收集菌体。使用破碎细胞溶液A(10mM磷酸钠缓冲溶液(pH＝7.0)+0.5mol·L-1NaCl+3g·L-1溶菌酶)对菌体进行洗涤，重复3次后，仍然用溶液A将菌体稀释至OD600为3，37℃孵育1-1.5h，至可以观察到有絮状的沉淀产生，置于冰上进行细胞破碎，破碎条件设置为每工作1秒停2秒，总破碎时间为8min。待液体澄清后即为破碎成功。12000rpm，10min离心所得到的细胞破碎液。
(2)重组岩藻糖基转移酶HM31的分离纯化
纯化方式采用Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠进行纯化。每15mL的离心管里含有蛋白纯化磁珠2-3mL，并配备磁力架。相关操作步骤如下：①磁珠再生：加5mL ddH2O，混匀，磁性分离；加5mL再生缓冲液，混匀，磁性分离操作2次；加5mL ddH2O，混匀，室温旋转5min，磁性分离操作2次；加5mLNi2+再生缓冲液，室温混匀20min，磁性分离；加5mL ddH2O，混匀，磁性分离操作4次。②磁珠预处理：加5mL结合缓冲液，混匀，磁性分离操作2次；③目的蛋白与磁珠结合：在经过预处理的离心管中加入适量的2mg以内的蛋白样品，放置到漩涡振荡器上震荡15s，充分混匀后将离心管置于旋转混合仪上室温20-30min，保证目的蛋白与磁珠的充分结合，结束后进行磁性分离。④磁珠洗涤：加10mL洗涤缓冲液，轻轻翻转后进行磁性分离，操作两次，可收集倾倒出液体。目的：洗去杂蛋白和未结合的蛋白。为避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白，可将磁珠转移到新的离心管中。⑤目的蛋白洗脱：加5-8mL洗脱缓冲液，磁性分离操作3次，并收集倾倒出液体。⑥磁珠后处理：加5mL水，磁性分离操作2次；加磁珠保存液5mL，保存于4℃冰箱中。收集纯化的酶液，将其转移至合适大小并经过预处理的透析袋中，过夜透析除去咪唑和盐，中间更换2-3次透析液，结束后测定蛋白浓度。如有必要可对酶液进行超滤浓缩。
(3)重组岩藻糖基转移酶HM31的比酶活测定
将纯化获得的重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶进行反应，反应体系为20μL，其中含有0.5μmol/L底物GDP-岩藻糖、20mmol/LMnCI2、1％Triton X-100、50mmol/L甲次胂酸盐-盐酸缓冲液(pH5.8)、0.5nmol/L苯-β-D-半乳糖及重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶0.5mg，总体积为100μL，混合液在37℃下孵育1h后，用300μL氯仿/甲醇(2:1，v/v)终止反应，混匀后于12000rpm离心3min，取上清进行HPLC检测，通过HPLC检测反应体系中底物的减少量和产物的生成量间接计算重组岩藻糖基转移酶HM31的酶活，并计算比酶活。结果显示重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶的比酶活为33.7U/mg。
(4)重组岩藻糖基转移酶HM31的温度特性表征
参照以上酶活检测反应的方法，将纯化获得的重组岩藻糖基转移酶HM31纯酶分别在30℃，37℃，42℃和50℃进行反应。反应结束后通过HPLC检测反应体系中产物的生成量间接计算重组岩藻糖基转移酶HM31的酶活。结果显示42℃条件下的酶活达到89.5U/mL，为37℃条件下酶活的1.3倍，在50℃条件下酶活(69.1U/mL)也高于37℃。
实施例5工程菌BLO2在20L发酵罐内发酵生产2’-FL
将实施例2中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLO2活化后，于37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于30mL的摇瓶发酵培养基，控制初始OD为0.5-1，于发酵温度42℃、初始pH7.5的条件下在发酵罐中进行补料分批发酵。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为800rpm。发酵8h后以20mL/h的速率连续补加50％的蔗糖溶液，维持其不被耗尽。
发酵培养基：棉籽蛋白30g/L、蔗糖75g/L、乳糖80g/L、K2HPO4·3H2O 9.12g/L、KH2PO4 1.36g/L、FeCl30.5 g/L、(NH4)2HPO410 g/L(pH7.5)。30L发酵罐装液量15L。发酵罐规模的补料分批发酵46h后2’-FL的产量达到47g/L，最大OD600为72.8。
对比例1：
具体实施方式与实施例2相同，区别在于，将岩藻糖基转移酶基因HM31换为来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的岩藻糖基转移酶futC(GenBank:ABO61750.1)，将所构建的重组菌以实施例5-6所示发酵方法进行发酵，发酵温度为42℃，摇瓶发酵生产2’-FL的产量为1.02g/L；20L发酵罐发酵的2’-FL产量为23g/L。
对比例2：
具体实施方式与实施例2相同，区别在于，将岩藻糖基转移酶基因HM31换为来源于大肠杆菌(Escherichia coli O126)的岩藻糖基转移酶wbgL(GenBank:ABO61750.1)，将所构建的重组菌以实施例5-6所示发酵方法进行发酵，发酵温度为42℃，摇瓶发酵生产2’-FL的产量为0.82g/L；20L发酵罐发酵的2’-FL产量为17g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种耐高温的岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述岩藻糖基转移酶在高温发酵2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将表达权利要求1所述的岩藻糖基转移酶的重组菌进行发酵。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组菌的宿主为地衣芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：
(1)在磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶基因manC、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG以及岩藻糖基转移酶基因的两端分别融合SEQ ID NO.3所示的启动子和SEQ ID NO.4所示的终止子，获得含上述基因的表达片段；
(2)将步骤(1)构建的表达片段以manB、manC与gmd的顺序连接至质粒pHY300PLK上，得到重组质粒1；再将基因wcaG与权利要求2所述基因连接至质粒pHT43，得到重组质粒2；
(3)将步骤(2)构建的重组质粒1、重组质粒2转化至地衣芽孢杆菌，获得重组地衣芽孢杆菌菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为：37℃～42℃，发酵至少46h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的培养基含有：棉籽蛋白5-30g/L、蔗糖40-75g/L、乳糖40-80g/L、K2HPO4·3H2O7.28-9.12g/L、KH2PO41.36-3.15g/L、FeCl30.5-1g/L、(NH4)2HPO45-10g/L；初始pH为6.5-7.5。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵过程还进行补料，所述补料是在发酵6-10h后补加蔗糖。
9.权利要求1所述岩藻糖基转移酶在生产含2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括婴儿配方奶粉。
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