CN112501106B - 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用，属于微生物代谢工程领域。本发明提供的2’‑岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶表达水平的调控策略，通过将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，能够大幅提高代谢通路的效率，利用相关策略构建的基因工程菌株，与现有技术相比提高13倍以上，为2’‑岩藻糖基乳糖的工业生产奠定了基础。

Description

一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用，属于微生物代谢工程领域。

背景技术

母乳中最重要的生物活性成分之一是人乳寡糖（HMOs，Human MilkOligosaccharides），HMOs结构非常复杂，根据质谱分析，推测HMOs的种类可达数千种。HMOs可通过选择性地刺激特定微生物的生长，特别是双歧杆菌等益生菌，来塑造肠道微生物菌群，有效地保障了胃肠道和免疫系统的发育和健康。另外，随着人体肠道微生物菌群研究的不断深入，充分证明了HMOs不仅能促进婴儿有益微生物菌群的形成，还能改善成年人的肠道微生物菌群。因此婴幼儿配方奶粉和功能性食品对于HMOs的需求量将不断增加。

岩藻糖基化寡糖，尤其是其中的2’-岩藻糖基乳糖，是人乳寡糖中的主要成分，且结构相对简单，具有重要价值。HMOs结构复杂，分离提取困难，利用微生物合成2’-岩藻糖基乳糖具有广阔前景。

目前微生物生产2’-岩藻糖基乳糖主要有两条代谢途径，分别是从头合成途径和补救途径（图1）。从头合成途径主要是从胞内代谢物6-磷酸果糖开始，通过磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(Gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)的顺序作用合成GDP-岩藻糖，进一步经过2’-岩藻糖基乳糖合成酶(FutC)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2’-岩藻糖基乳糖。补救途径是经过岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)的作用，将岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，进一步经过FutC的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2’-岩藻糖基乳糖。为了进一步提高2’-岩藻糖基乳糖，可以敲除乳糖降解相关的β-半乳糖苷酶LacZ，GDP-岩藻糖降解相关的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ，岩藻糖降解相关酶FucIK，过表达GDP-岩藻糖合成途径的调控蛋白RcsA，过表达β-半乳糖苷透性酶LacY，以及增强NADPH，GTP的供应等。

大肠杆菌遗传背景清晰，基因操作方便，是工业生物制造最常用的菌株。在大肠杆菌中，敲除lacZ，用质粒大量过表达所有从头合成途径关键酶ManA，manC,manB,Gmd，WcaG，FutC，LacY，2’-岩藻糖基乳糖摇瓶产量为0.83g/L,（Huang, D., et al. (2017). "Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose through modular pathway enhancement."Metab Eng 41: 23-38.），在另一个例子中，敲除lacZ，用质粒过表达从头合成途径关键酶，2’-岩藻糖基乳糖摇瓶产量为0.85 g/L（Chin, Y. W., et al. (2017). "Improvedproduction of 2'-fucosyllactose in engineered Escherichia coli by expressingputative alpha-1,2-fucosyltransferase, WcfB from Bacteroides fragilis." JBiotechnol 257: 192-198.）。江南大学（专利申请号 201911188891.7）在一种大肠杆菌中同时构建了从头合成途径和补救途径，采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和2’-岩藻糖基乳糖合成酶的表达，同时，敲除大肠杆菌宿主2’-岩藻糖基乳糖合成途径中LacZ、WcaJ和FucIK的表达，利用葡萄糖为碳源发酵，2’-岩藻糖基乳糖产量为0.8g/L。

2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径需要以高价值的岩藻糖为底物，生产成本高，基本不具有产业化应用价值。虽然构建2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径，能够生产2’-岩藻糖基乳糖，但是依然存在途径不畅通、中间代谢物积累等问题，导致2’-岩藻糖基乳糖生产水平较低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明将对2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶进行不同表达水平的调控，以提高途径效率，提高2’-岩藻糖基乳糖生产水平。

本发明提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，通过调控2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径酶的表达，包括，在宿主细胞基因组上插入单拷贝磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶(ManB)，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)，在质粒上多拷贝过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)和2’-岩藻糖基乳糖合成酶(FutC)，敲除β-半乳糖苷酶（LacZ），过表达β-半乳糖苷透性酶（LacY)，使得菌株能够大量积累2’-岩藻糖基乳糖；

进一步在质粒上多拷贝过表达糖外排转运蛋白SetA，能够大幅提高2’-岩藻糖基乳糖的生产水平；

进一步地，所述宿主细胞可以是大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109；

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌K12 MG1655；

进一步地，所述质粒可以是pTrc99a、pSB4K5、pET28a或pET22b；

进一步地，所述多拷贝具体为使用质粒pTrc99a(拷贝数约为20），pSB4K5（拷贝数约为5）；

进一步地，磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶(ManB)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)、GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)和β-半乳糖苷透性酶(LacY)通过Ptrc启动子进行过表达，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（ManC）通过阿拉伯糖诱导型启动子Para过表达；

所述磷酸甘露糖异构酶(ManA)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述磷酸甘露糖变位酶(ManB)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

所述2’-岩藻糖基乳糖合成酶(FutC)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述β-半乳糖苷酶（LacZ）的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述β-半乳糖苷透性酶（LacY)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述糖外排转运蛋白（SetA）的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供上述重组菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用，特别是发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。具体如下：

发酵温度为36-38℃，发酵时间24-48h，摇床转速200-220r/min，接种量1.8%-2%；

发酵培养基为：2g/LKH₂PO₄，2g/LNH₄Cl，1.7g/L柠檬酸，1.4g/LMgSO₄·7H₂O，5g/L酵母粉，10mL/L微量元素溶液，40g/L3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液，10g/L乳糖，1g/L阿拉伯糖，20g/L葡萄糖，其余为水，调节pH至7.0左右。

微量元素溶液组成为：10g/LFeSO₄·7H₂O，2.2g/LZnSO₄·7H₂O，1.0g/LCuSO₄·5H₂O，0.38g/LMnSO₄·H₂O，0.02g/LNa₂B₄O₇·10H₂O，0.1g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄，2.0g/LCaCl₂，其余为水。

有益效果:

本发明提供的2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶表达水平的调控策略，通过将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，能够大幅提高代谢通路的效率，利用相关策略构建的基因工程菌株，与较为接近的现有技术生产水平（约0.8g/L）相比提高3倍以上，进一步过表达SetA后，提高13倍以上，为2’-岩藻糖基乳糖的工业生产奠定了基础。

附图说明

图1：2’-岩藻糖基乳糖生产的从头合成途径和补救合成途径

其中，PGI，磷酸葡萄糖异构酶；ManA，甘露糖异构酶；ManB，磷酸甘露糖变位酶；ManC，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶；Gmd，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶；WcaG，GDP-岩藻糖合成酶；Fkp，岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶；FutC，2’-岩藻糖基乳糖合成酶；SetA,糖外排转运蛋白；LacZ，β-半乳糖苷酶；LacY，β-半乳糖苷透性酶。

图2：重组质粒pTrc99a-gmd-wcaG的示意图。

图3：重组质粒pTrc99a-manB-manA的示意图。

图4：重组质粒pTrc99a-futC的示意图。

图5：重组质粒pKD46-manC的示意图。

图6：重组质粒pTrc99a-futC-manC的示意图。

图7：重组质粒pSB4K5-setA的示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明实施例中所述的2’-岩藻糖基乳糖测定方法为HPLC法，具体为：

色谱柱：Carbohydrate ES 5u 250mm*4.6mm；检测器：蒸发光检测器；流动相：70%乙腈（乙腈：水）；流速：0.8mL/min，柱温：30℃；进样量：5µL。

本发明实施例采用的主要培养基如下：

LB培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)10g，Yeast Extract（酵母提取物）5g，NaCl（氯化钠）5g。

发酵培养基：2g/LKH₂PO₄，2g/LNH₄Cl，1.7g/L柠檬酸，1.4g/LMgSO₄.7H₂O，5g/L酵母粉，10mL/L微量元素溶液，40g/LMOPS，10g/L乳糖，1g/L阿拉伯糖，20g/L葡萄糖，其余为水。调节pH至7.0左右。

微量元素溶液组成为：10g/LFeSO₄·7H₂O，2.2g/LZnSO₄·7H₂O，1.0g/LCuSO₄·5H₂O，0.38g/LMnSO₄·H₂O，0.02g/LNa₂B₄O₇·10H₂O，0.1g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄，2.0g/LCaCl₂。

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：菌株E.coliK12 MG1655△lacIZ::Ptrc-wcaG-gmd-lacy的构建

以大肠杆菌MG1655为原始菌株，敲除lac操纵子序列中Plac启动子序列以及lacI、 lacZ基因，并且在lacI、lacZ基因位点上使用Ptrc启动子过表达wcaG、gmd、lacy基因。Ptrc启动子是Ptrp启动子和Plac启动子的拼合启动子，具有比Plac启动子更高的转录效率。

构建此菌株使用方法为λRed重组。主要是构建两步同源重组片段，以pKD46(GenBank:MF287367)作为同源重组质粒，进行基因的敲除及整合。第一步同源重组片段包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因和sacB基因。第二步同源重组片段包含上下游同源臂以及待整合基因。以下详细描述具体方法：

1、第一步同源重组片段mhpr-cat-sacB的构建。构建cat-sacB基因片段，其中cat为氯霉素抗性基因，sacB来源于pEX18Gm质粒；以大肠杆菌MG1655为模板，分别以mhpr-up/mhpr-2、lacy-1/lacy-down为引物，PCR得到Plac启动子片段以及lacIZ基因上、下游同源臂。以三个片段，包括cat-sacB，以及上、下游同源臂为模板，通过重叠PCR得到第一次重组片段mhpr-cat-sacB（lacI与2’-FL的表达无关）。

2、制备大肠杆菌MG1655化学转化感受态细胞并将质粒pKD46化转其中。

3、第一步同源重组。将构建好的第一次重组片段mhpr-cat-sacB电转入含pKD46质粒的感受态细胞中，菌液涂于含氨苄青霉素和氯霉素的双抗LB平板，30℃下培养进行筛选，倒置培养24h，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，以出发菌株MG1655做对照。

4、第二步同源重组片段mhpr-Ptrc-wcaG-gmd-lacy的构建。以大肠杆菌MG1655为模板，设计引物mhpr-up/mhpr-2、lacy-1-up/lacy-down，PCR得到Plac启动子片段以及lacIZ基因上下游同源臂。以pTrc99a-wcaG-gmd质粒为模板（以下会详细描述pTrc99a- wcaG-gmd质粒构建过程），mhpr-trc-up/wcaG-1-down为引物，PCR获得由Ptrc启动子和wcaG、gmd基因组成的待整合基因片段Ptrc-wcaG-gmd。以三个片段，通过重叠PCR得到第二次重组片段mhpr-Ptrc-wcaG-gmd-lacy。

5、第二步同源重组。

（1）第一次同源重组鉴定正确的重组子制备成电转化感受态细胞。（2）将第二步同源重组片段mhpr-Ptrc-wcaG-gmd-lacy转入第一次同源重组子感受态细胞中，LB培养基中30℃培养3-4h后，转入含有10%蔗糖的LB液体培养基中，37℃继续培养24h，用接种环在含有10%蔗糖的LB固体平板上划线，37℃培养12h后，单菌落分别在LB平板和含有氯霉素的LB平板上培养。（3）转化子验证，从LB平板上挑取对应不能在含有氯霉素的LB平板上生长的菌落，进行菌落PCR验证，进一步测序验证，获得发生第二次重组的目标菌株，命名为W1。

第二步同源重组中所需质粒pTrc99a-wcaG-gmd的构建方法为：以pTrc99a质粒（GenBank:U13872）为模板，使用引物pTrc99a-GW-F/pTrc99a-BA-R，PCR扩增得到含有Ptrc启动子的线性pTrc99a载体片段。以大肠杆菌MG1655为模板，分别使用引物gmd-F/gmd-R、wcaG-F/wcaG-R，PCR扩增得到wcaG、gmd基因片段。使用无缝克隆酶pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit（全式金）将wcaG、gmd与线性载体pTrc99a片段连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-wcaG-gmd。质粒示意图如图2所示。

表1：构建基因组过表达wcaG、gmd和lacy的重组菌株所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		gmd-F	aacagacctttgtttaactttaagaaggagatataccatgtcaaaagtcgctctcatc
gmd-R	tcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaattatgactccagcgcgatc
		wcaG-F	aagaaggagatataccatgagtaaacaacgagtttttattgctg
wcaG-R	gctcgaattcttacccccgaaagcggtct
		pTrc99a-BA-R	aagttaaacaaaggtctgtttcctgtgtgaga
pTrc99a-GW-F	tcgggggtaagaattcgagctcggtaccc
		mhpr-up	cgacgtttgccgcttctga
mhpr-2	tcaacgtaaatgcatgccg
		mhpr-trc-up	cggcatgcatttacgttgagcgcaacgcaattaatgtg
wcaG-1-down	ggtatatctccttcttaaagttaaacaaattacccccgaaagcggtct
		lacy-1-up	ctttaagaaggagatataccatgtactatttaaaaaacacaaacttttg
lacy-down	ttactgcgacggctgact
		lacy-1	atgtactatttaaaaaacacaaacttttg

实施例2：菌株W1△adhE::Ptrc-manB-manA的构建

为过表达manB、manA基因，在W1菌株的基础上进行manB、manA的基因组整合，整合位点选择为adhe（乙醇脱氢酶）基因位置。基因整合方法与实施例1一致。需构建第一步同源重组片段adhe-cat-sacB。所需引物为adhe-up/adhe-2、adhe-down-FF/adhe-down，以大肠杆菌MG1655为模板，通过PCR得到同源重组上下游同源臂。构建cat-sacB基因片段，其中cat为氯霉素抗性基因，sacB来源于pEX18Gm质粒。以三个片段，cat-sacB以及adhe基因上、下游同源臂为模板，进一步通过重叠PCR得到第一步同源重组片段。构建第二步同源重组片段adhe-Ptrc-manB-manA，以大肠杆菌MG1655为模板，设计引物adhe-up/adhe-2、adhe-down-F/adhe-down，PCR得到adhe基因上、下游同源臂。以pTrc99a-manB-manA质粒为模板（以下会详细描述pTrc99a-manB-manA质粒构建过程），adhe-trc-up/adhe-T2-R为引物，PCR获得由Ptrc启动子和manB、manA基因组成的待整合基因片段Ptrc-manB-manA。以三个片段为模板，通过重叠PCR得到第二次重组片段adhe-Ptrc-manB-manA。通过以上λ Red重组的方法，进行Ptrc-manB-manA基因的整合，构建菌株命名为W2。

第二步同源重组中所需质粒pTrc99a-manB-manA的构建方法为：以pTrc99a质粒为模板，使用引物pTrc99a-BA-F/pTrc99a-BA-R，PCR扩增得到含有Ptrc启动子的线性pTrc99a载体片段。以大肠杆菌MG1655为模板，分别使用引物manB-F/manB-R、manA-F/manA-R，PCR扩增得到manB、manA基因片段。使用无缝克隆酶将manB、manA与线性载体pTrc99a片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-manB-manA。质粒示意图如图3所示。

表2：构建基因组过表达manB和manA的重组菌株所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		manB-F	aacagacctttgtttaactttaagaaggagatataccatgaaaaaattaacctgctttaaagc
manB-R	gcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaattactcgttcagcaacgtca
		manA-F	aagaaggagatataccatgcaaaaactcattaactcagtg
manA-R	agctcgaattcttacagcttgttgtaaacacgc
		pTrc99a-BA-R	aagttaaacaaaggtctgtttcctgtgtgaga
pTrc99a-BA-F	caagctgtaagaattcgagctcggtaccc
		adhe-up	catgctaatgtagccaccaaa
adhe-2	gtgcgttaagttcagcgaca
		adhe-trc-up	tgtcgctgaacttaacgcacgcgcaacgcaattaatgtg
adhe-T2-R	ttaagcggatcaaaaagagtttgtagaaacgc
		adhe-down-F	actctttttgatccgcttaatcagtagcgc
adhe-down	ttgcaccaccatccagataa
		adhe-down-FF	caccacctacaaagcggtacatccgcttaatcagtagcgc

实施例3：质粒pTrc99a-futC-manC构建

为高拷贝过表达futC、manC基因，需构建质粒pTrc99a-futC-manC。其中使用Ptrc启动子过表达futC基因，使用阿拉伯糖诱导型启动子Para过表达manC基因，因此需单独构建pTrc99a-futC质粒以及pKD46-manC质粒，在此基础上构建pTrc99a-futC-manC质粒。

pTrc99a-futC质粒的构建：以pTrc99a质粒为模板，使用引物ptrc99a-BA-R/ptrc99a-ty-F，PCR扩增得到含有Ptrc启动子的线性pTrc99a载体片段。选择来自幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶基因futC，使用引物futc-11/futc-12，以携带全基因合成的futC的pUC57质粒DNA为模板，PCR扩增得到futC基因片段，其中futC基因部分密码子优化，使用无缝克隆酶将futC与线性载体pTrc99a片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-futC。质粒示意图如图4所示。

表3：构建质粒pTrc99a-futC所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		ptrc99a-BA-R	aagttaaacaaaggtctgtttcctgtgtgaga
ptrc99a-ty-F	gaattcgagctcggtacccggg
		futc-11	aacagacctttgtttaactttaagaaggagatataccatggcttttaaagtggtgca
futc-12	cgggtaccgagctcgaattcttaagcgttatacttttgggatttt

pKD46-manC质粒的构建。以pKD46质粒为模板，使用引物pKD46-1-R/pKD46-1-F，PCR扩增得到线性pKD46载体。以大肠杆菌MG1655为模板，使用引物manC-F/manC-R，PCR扩增得到manC基因片段。使用无缝克隆酶将manC与线性载体pKD46片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pKD46-manC。质粒示意图如图5所示。

表4：构建质粒pKD46-manC所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		manC-F	tttgtttaactttaagaaggagatatacatatggcgcagtcgaaactcta
manC-R	gtgaggatgcgttacacccgtccgtagcgat
		pKD46-1-F	cgggtgtaacgcatcctcacgataatatcc
pKD46-1-R	tctccttcttaaagttaaacaaaagagctcgaattcccaaaaaaac

以上述构建的质粒pTrc99a–futC以及pKD46-manC为模板，分别以rrnBT2-R/amp-F与arac-F/arac-R为引物，PCR获得含有futC基因的线性载体片段和Para-manC基因片段，使用无缝克隆酶将Para-manC基因片段与含有futC基因的线性载体片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-futC-manC。质粒示意图如图6所示。

表5：构建质粒pTrc99a-futC-manC所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		rrnBT2-R	aagagtttgtagaaacgcaaaaag
amp-F	tttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatcc
		arac-F	tgcgtttctacaaactcttcacatttccccgaaaagtgc
arac-R	tttagaaaaataaacaaagtagaacaactgttcaccgttac

实施例4：质粒pSB4K5-setA构建

2’-岩藻糖基乳糖的外排也是生产的限制因素，因此需过表达2’-岩藻糖基乳糖外排蛋白。选择来自大肠杆菌的外排蛋白基因setA，构建质粒pSB4K5-setA，使用Ptrc启动子进行该基因的过表达。

质粒构建过程如下：以pSB4K5-I52002（GenBank:EU496099）质粒为模板，使用引物psb4K5-1/psb4K5-2，PCR扩增得到线性pSB4K5载体。以野生型E.coliMG1655基因组DNA以及pTrc99a质粒DNA为模板，分别以setA-up/setA-ps-1、trc-1/pTrc99a-BA-R为引物进行PCR扩增，得到setA基因以及Ptrc启动子，使用无缝克隆酶将Ptrc、setA与pSB4K5线性载体片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pSB4K5-setA。质粒构建示意图如图7所示。

表6：构建质粒pSB4K5-setA所用引物

引物名称	序列5<sup>，</sup>-3<sup>，</sup>
		psb4K5-1	gcctggggtgcctaatgag
psb4K5-2	aacccttctcacctcggc
		setA-up	cagacctttgtttaactttaagaaggagatataccatgatctggataatgacgatggc
setA-ps-1	gccgaggtgagaagggtttcaaacgtctttaacctttgcgg
		trc-1	ctcattaggcaccccaggcgcgaattgatctggtttgacagc
pTrc99a-BA-R	aagttaaacaaaggtctgtttcctgtgtgagattgttatccgcTC

实施例5：2’-岩藻糖基乳糖生产菌株构建

为实现2’-岩藻糖基乳糖的初步生产，需构建基因工程菌株大肠杆菌W2(pTrc99a- futC-manC)。实现2’-岩藻糖基乳糖的初步生产后，构建菌株W2(pTrc99a-futC-manC,pSB4K5-setA)实现2’-岩藻糖基乳糖的外排。为构建相关菌株，将质粒pTrc99a-futC-manC导入大肠杆菌W2后构建出大肠杆菌W2（pTrc99a-futC-manC），进一步的将质粒pSB4K5-setA导入大肠杆菌W2（pTrc99a-futC-manC）后构建出大肠杆菌W2（pTrc99a-futC-manC，pSB4K5-setA）。

实施例6：2’-岩藻糖基乳糖生产菌株发酵验证

构建2’-岩藻糖基乳糖生产菌株后，对其进行发酵培养，使用HPLC进行2’-岩藻糖基乳糖的检测分析。发酵，检测过程如下：

重组大肠杆菌W2(pTrc99a-futC-manC)的发酵方法及2’-岩藻糖基乳糖检测结果

(1)挑取获得的基因工程菌株W2(pTrc99a-futC-manC)单菌落转接到5mLLB液体培养基中，加入氨苄青霉素（终浓度50μg/mL），37℃、220r/min培养过夜；

(2)将菌液转接到40mL发酵培养基中（500ml三角瓶），接种量为2%，加入氨苄青霉素（终浓度50μg/mL）。37℃，220rpm，培养24h后取样5ml，继续培养48h后取样5ml检测2’-岩藻糖基乳糖产量。

(3)收集大肠杆菌发酵液后，利用超声破碎细胞仪破碎细胞，12000r/min离心10min，收集上清，煮沸十分钟，离心10分钟，取样进行HPLC检测分析，测2’-岩藻糖基乳糖的产量，结果为三次平行取平均值。

基因工程菌株大肠杆菌W2(pTrc99a-futC-manC,pSB4K5-setA)的发酵方法及2’-岩藻糖基乳糖检测结果

(1)挑取获得的基因工程菌株W2(pTrc99a-futC–manC,pSB4K5-setA)单菌落分别转接到5mLLB液体培养基中，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素，37℃、220r/min培养过夜；

(2)将菌液转接到40mL发酵培养基中（500ml三角瓶），接种量为2%，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素，37℃，220rpm，培养24h和48h后分别取样5ml检测2’-岩藻糖基乳糖产量。

(3)收集大肠杆菌发酵液后，利用超声破碎细胞仪破碎细胞，12000r/min离心10min，收集上清，煮沸十分钟，离心10分钟，取样进行HPLC检测分析，测2’-岩藻糖基乳糖的产量，结果为三次平行取平均值。

表7 2’-岩藻糖基乳糖生产

菌种	48h浓度（g/L）	24h浓度（g/L）
			W2(pTrc99a<i>-futC-manC</i>)	3.01±0.4	1.46±0.52
W2(pTrc99a<i>-futC-manC</i>,pSB4K5-<i>setA</i>)	11.45±0.81	6.69±0.72

本发明的核心思想是将ManA，ManB，Gmd，WcaG维持在相对较低的过表达水平，将FutC和ManC维持在相对较高的过表达水平，从而可以调控从头合成途径发挥更高的效率。除了利用本发明中提供的实施例外，其它常规手段，例如通过在基因组上多拷贝过表达FutC和ManC，或者利用较弱启动子过表达ManA，manB，Gmd和WcaG，利用较强启动子过表达FutC和ManC，也能够起到调控途径酶表达水平的作用。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种生产2＇-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用

<130> 1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 1

atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120

catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180

gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240

ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300

aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360

gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420

cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480

gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540

agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600

attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660

tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720

ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780

gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840

tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900

ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960

tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020

gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080

cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140

cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 2

atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60

aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120

attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371

<210> 3

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 3

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 4

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

aaactgctgt ttctcggatc gtcctgcatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360

gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966

<210> 5

<211> 1437

<212> DNA

<213> 大肠杆菌mg1655()

<400> 5

atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60

ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120

ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180

aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240

aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300

gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360

gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420

gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480

attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540

tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600

tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660

cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720

tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780

gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840

ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900

ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960

accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020

gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080

catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140

gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200

cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260

attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320

acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380

tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437

<210> 6

<211> 906

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌()

<400> 6

atggctttta aagtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat tacttctttt 120

gattggagca ataggaaaat gcaattagag cttttcccta ttgatttacc ctatgcgaat 180

gcaaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agatacgctc 240

aaatacatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgtgt ttgaatacga gcctaaattg 300

ttaaagccaa gccgcttgac ttatttttat ggctattttc aagatccacg atattttgat 360

gctatatccc ctttaatcaa gcaaactttc accctacccc acccaccccc tcccgaaaat 420

ggaaataata aaaaaaaaga ggaagaatac caccgcaaac ttgctttgat tttagccgct 480

caaaacagcg tgtttgtgca tataagaaga ggggattatg tggggattgg ctgtcagctt 540

ggcattgact atcaaaaaaa ggcgcttgag tatatggcaa aacgcgtgcc aaacatggaa 600

cttttcgtgt tttgcgaaga cttagaattc acgcaaaatc ttgatcttgg ctaccctttt 660

atggacatga ccactaggga tagagaagaa gaggcgtatt gggatatgct gctcatgcaa 720

tcctgtcagc atggcattat cgctaatagc acttatagct ggtgggcggc ttatttgata 780

gaaaatccag aaaaaatcat tattggcccc aaacactggc tttttgggca tgagaatatc 840

ctttgtgagg aatgggtgaa aatagaatcc cattttgagg taaaatccca aaagtataac 900

gcttaa 906

<210> 7

<211> 3075

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 7

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 60

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180

tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240

gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300

tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360

acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420

cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480

ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540

ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600

caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660

acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720

ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780

ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840

gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa 900

ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac 960

ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat 1020

ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat 1080

catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg 1140

aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac 1200

acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc 1260

atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc 1320

gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg 1380

aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat 1440

ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt 1500

tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc 1560

atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc 1620

cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat 1680

ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat 1740

gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg gcgatacgcc gaacgatcgc 1800

cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa 1860

gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc 1920

agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat 1980

ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagttg 2040

attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc 2100

gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag 2160

tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat 2220

ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac 2280

cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg 2340

ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc 2400

cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa 2460

gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccgct 2520

cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat 2580

ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg 2640

gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga 2700

ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat 2760

ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc 2820

gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc 2880

agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa 2940

gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg 3000

agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc 3060

tggtgtcaaa aataa 3075

<210> 8

<211> 1254

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 8

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

<210> 9

<211> 1179

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 9

atgatctgga taatgacgat ggctcgccgt atgaacggtg tttacgcggc atttatgctg 60

gtcgctttta tgatgggggt ggccggggcg ctacaggctc ctacattgag cttatttctg 120

agtcgtgagg ttggcgcgca acctttctgg atcggcctct tttatacggt gaatgctatt 180

gctgggatcg gcgtaagcct ctggttggca aaacgttctg acagtcaggg cgatcggcga 240

aaactgatta tattttgctg tttgatggct atcggcaatg cgctattgtt tgcatttaat 300

cgtcattatc tgacgcttat cacctgtggt gtgcttctgg catctctggc caatacggca 360

atgccacagt tatttgctct ggcgcgggaa tatgcggata actcggcgcg agaagtggtg 420

atgtttagct cggtgatgcg tgcgcagctt tctctggcat gggttatcgg tccaccgttg 480

gcctttatgc tggcgttgaa ttacggcttt acggtgatgt tttcgattgc cgccgggata 540

ttcacactca gtctggtatt gattgcattt atgcttccgt ctgtggcgcg ggtagaactg 600

ccgtcggaaa atgctttatc aatgcaaggt ggctggcagg atagtaacgt acggatgtta 660

tttgtcgcct cgacgttaat gtggacctgc aacaccatgt acattattga tatgccgttg 720

tggatcagta gcgagttagg attgccagac aaactggcgg gtttcctgat ggggacggca 780

gctggactgg aaataccagc aatgattctg gctggctact atgtcaaacg ttatggtaag 840

cggcgaatga tggtcatagc agtggcggca ggagtactgt tttacaccgg attgattttc 900

tttaatagcc gtatggcgtt gatgacgctg caacttttta acgctgtatt tatcggcatt 960

gttgcgggta ttgggatgct atggtttcag gatttaatgc ctggaagagc gggggcagct 1020

accaccttat ttactaacag tatttctacc ggggtaattc tggctggcgt tattcaggga 1080

gcaattgcac aaagttgggg gcactttgct gtctactggg taattgcggt tatttctgtt 1140

gtcgcattat ttttaaccgc aaaggttaaa gacgtttga 1179

Claims (9)

1.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，是在宿主细胞基因组上插入单拷贝磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG，在质粒上多拷贝过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC和2’-岩藻糖基乳糖合成酶FutC，敲除宿主细胞基因组上的β-半乳糖苷酶LacZ，在宿主细胞基因组上过表达β-半乳糖苷透性酶LacY获得的；

所述宿主细胞为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，还包括在质粒上多拷贝过表达糖外排转运蛋白SetA。

3.如权利要求1所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109。

4.如权利要求1所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述质粒是pTrc99a、pSB4K5、pET28a或pET22b。

5.如权利要求1所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶Gmd、GDP-岩藻糖合成酶WcaG和β-半乳糖苷透性酶LacY通过Ptrc启动子进行过表达。

6.如权利要求1所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，

所述磷酸甘露糖异构酶ManA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述磷酸甘露糖变位酶ManB的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶Gmd的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述GDP-岩藻糖合成酶WcaG的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述2’-岩藻糖基乳糖合成酶FutC的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述β-半乳糖苷酶LacZ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述β-半乳糖苷透性酶LacY的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

7.如权利要求2所述的一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述糖外排转运蛋白SetA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

8.权利要求1-7任意所述重组菌株在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，具体如下：发酵温度为36-38℃，发酵时间24-48h，摇床转速200-220r/min，接种量1.8%-2%。

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