CN114276971A

CN114276971A - 一种利用甘露糖合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114276971A
Application number: CN202210018189.1A
Authority: CN
Inventors: 李庆刚; 李玉; 李浩正; 郑艳玲; 宗剑飞; 肖卫华; 彭则涛; 程亚楠; 李畅; 路福平
Original assignee: Shandong Synthetic Vision Biotechnology Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Synthetic Vision Biotechnology Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明涉及一种构建重组大肠杆菌利用甘露糖合成GDP‑岩藻糖，进而生产2′‑岩藻糖基乳糖并提高甘露糖利用率的方法，属于微生物代谢工程领域。所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除lac操纵子序列中P_lac启动子序列以及lacI、lacZ基因，并且在1acI、lacZ基因位点上过表达wcaG、gmd、lacy基因，之后在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA，过表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、α‑(1,2)‑岩藻糖基转移酶编码基因futC、甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manC所得。本发明提供的2′‑岩藻糖基乳糖从头合成途径生产2′‑岩藻糖基乳糖的发酵策略，能够大幅提高大肠杆菌发酵生产2′‑岩藻糖基乳糖碳源利用率。

Description

一种利用甘露糖合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一种产2′-岩藻糖基乳糖重组大肠杆菌的构建方法，该菌种具有提高的甘露糖利用效率，属于微生物代谢工程领域。

背景技术：

母乳低聚糖(HMO)是一类独特的、天然存在于母乳中的碳水化合物，对人体健康有诸多益处，目前，人们将重点放在它作为食品添加剂的应用上。

2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)是一种占比最大的母乳低聚糖(HMO)产品(约占31％)，其在肠道中可被有益微生物菌群利用，调节肠道微生物；并且在婴儿奶粉中加入2′-FL可以增强新生婴儿的免疫力，有效的增强新生婴儿体质；2′-FL在大脑发育、神经元传递和突触的形成中也起作用，所以在饮食中添加2′-FL可以促进大脑发育并且能够改善学习和记忆能力。目前，2′-FL主要用于生产婴儿配方奶粉、功能食品和饮料，也可以用做食品添加剂，所以直接合成2′-FL具有良好的前景。

目前，合成2′-FL的方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成需要对2′-FL进行重复且多次的保护和去保护，过程非常繁琐，这会降低产率并且增加成本。利用微生物进行2′-FL 的合成，是目前大范围生产2′-FL可行的方法，而且与化学合成方法相比，生物合成方法更加安全快捷，合成过程中不用引入大量的有毒试剂，这样大大增加了产物的安全性。但是目前利用生物合成的方法合成的2′-FL培养基中的主要使用甘油或者葡萄糖为碳源转化成GDP- 岩藻糖，进而合成2′-FL的转化率普遍不高。目前微生物生产2′-岩藻糖基乳糖主要有两条代谢途径，分别是从头合成途径和补救途径(图1)。从头合成途径主要是从胞内代谢物6-磷酸果糖开始，通过manA(磷酸甘露糖异构酶)、manB(磷酸甘露糖变位酶)，manC(甘露糖-1- 磷酸鸟嘌呤基转移酶)，gmd(GDP-甘露糖-6-脱氢酶)和wcaG(GDP-岩藻糖合成酶)的顺序作用合成GDP-岩藻糖，进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。补救途径是经过岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp) 的作用，将岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。

补救途径需要以岩藻糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖，由于使用岩藻糖为碳源成本过高，基本不具备工业生产的潜力，而2′-岩藻糖基乳糖的从头合成途径，能够利用甘油或者葡萄糖为碳源合成GDP-岩藻糖进而合成2′-岩藻糖基乳糖，具备工业生产的可能，但由于2′-岩藻糖基乳糖合成途径弱，难以与糖酵解途径竞争，导致大量碳源被细胞生长或代谢消耗，用于生产2′-岩藻糖基乳糖的碳源利用率较低，使2′-岩藻糖基乳糖生产水平较低。

本申请将提供一种利用甘露糖为碳源生成GDP-岩藻糖，进而生产2′-FL的方法。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将使用基因编辑技术对大肠杆菌合成2′-岩藻糖基乳糖的代谢途径进行重构并敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA，使大肠杆菌利用葡萄糖或甘油等碳源进入EMP途径(糖酵解途径)进行生长代谢，由于缺少manA基因，使培养基中的甘油或葡萄糖不能够在大肠杆菌内进入合成2′-岩藻糖基乳糖的从头合成途径合成2′-岩藻糖基乳糖；同时，由于缺少manA基因，甘露糖进入大肠杆菌内也不能够被大肠杆菌利用进入生长代谢途径。因此，经过改造后的大肠杆菌利用葡萄糖或甘油等碳源进行生长代谢，使用进入胞内的甘露糖作为碳源进入2′-岩藻糖基乳糖从头合成途径合成GDP-岩藻糖，进而合成2′-岩藻糖基乳糖，提高大肠杆菌对培养基中的碳源利用效率。

本发明提供的技术方案之一，是一种能够利用葡萄糖或甘油等碳源进行生长代谢，利用甘露糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株，首先敲除lac操纵子序列中P_lac启动子序列以及lacI、lacZ基因，并且在lacI、lacZ基因位点上使用P_trc启动子过表达wcaG、gmd、lacy基因，之后在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA，并采用质粒表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶编码基因futC、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manC；

进一步地，敲除UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因Wcaj；

进一步地，所述出发菌株为大肠杆菌MG1655；

进一步地，所述P_lac启动子，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

进一步地，所述lacI基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

进一步地，所述lacZ基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；

进一步地，所述P_trc启动子，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；

进一步地，所述wcaG，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

进一步地，所述gmd，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

进一步地，所述lacy基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；

进一步地，所述manA，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；

进一步地，所述manB，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；

进一步地，所述futC，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；

进一步地，所述manC，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；

进一步地，所述Wcaj，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；

进一步地，采用pSB4K5质粒表达futC、manC；

进一步地，采用pTrc99a质粒表达manb。

本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌的应用，特别是在利用甘露糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖中的应用，具体地，生产2′-岩藻糖基乳糖的方法如下：

将工程菌种子液按2-10％接种量接入发酵培养基中，加入氨苄青霉和卡那霉素(终浓度 50μg/mL)，30-37℃，400-600rpm，培养36-52h；

发酵培养基组成如下：1.5-3.5g/L KH₂PO₄，1.5-3.5g/L NH₄Cl，1.7-2.5g/L柠檬酸，1.4-2g/L MgSO₄·7H₂O，5-7g/L酵母粉，10-20mL/L微量元素溶液，1-10g/L甘露糖，10-15g/L甘油， 5-10g/L乳糖，其余为水；调节pH至7.0左右；

进一步地，微量元素溶液组成如下：10g/L FeSO₄·7H₂O，2.2g/L ZnSO·7H₂O，1.0g/L CuSO₄·5H₂O，0.38g/L MnSO₄·H₂O，0.02g/L Na₂B₄O₇·10H₂O，0.1g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄，2.0g/L CaCl₂，其余为水；

经过36-52小时的发酵，收集发酵液破碎细胞后检测2′-岩藻糖基乳糖的含量，达到 0.23-4.95g/L，甘露糖的利用达到10.77％-96.2％；

优选地，发酵培养基中添加2g/L KH₂PO₄，2g/L NH₄Cl，1.7g/L柠檬酸，1.4g/LMgSO₄·7H₂O，5g/L酵母粉，10mL/L微量元素溶液，5g/L甘露糖，10g/L甘油，5g/L乳糖，其余为水；调节pH至7.0左右；经过48h发酵，2′-岩藻糖基乳糖的含量为4.19g/L，甘露糖的利用达到58.69％±1.48％效果最优。

有益效果：

本发明提供的2′-岩藻糖基乳糖从头合成途径生产2′-岩藻糖基乳糖的发酵策略，敲除 manA的菌株，由于缺少manA基因，使培养基中的甘油不能够进入大肠杆菌内合成2′-岩藻糖基乳糖的从头合成途径合成2′-岩藻糖基乳糖，同时由于缺少manA基因，甘露糖进入大肠杆菌内也不能够被利用进入生长代谢途径，所以进入胞内的甘露糖用作为碳源进入2′-岩藻糖基乳糖合成途径，合成GDP-岩藻糖，进而合成2′-岩藻糖基乳糖，实现将大肠杆菌的生长和生产2′-FL分开的技术效果，增加了甘露糖合成GDP-岩藻糖，进而生产2′-岩藻糖基乳糖的转化率，敲除Wcaj基因使大肠杆菌利用甘露糖合成GDP-岩藻糖，进而生产2′-岩藻糖基乳糖的转化率进一步提高，该策略能够大幅提高大肠杆菌发酵生产2′-岩藻糖基乳糖碳源利用率。

附图说明：

图1 2′-岩藻糖基乳糖生产的从头合成途径和补救合成途径

Gapa：3-磷酸甘油醛脱氢酶；fbaA：果糖二磷酸醛缩酶；pfkA/pfkB：6-磷酸果糖激酶； manA：甘露糖异构酶；manB：磷酸甘露糖变位酶；manC：甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶；gmd：GDP-甘露糖-4,6-脱水酶；wcaG：GDP-岩藻糖合成酶；Fkp：岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶；futC：α-(1,2)-岩藻糖基转移酶；setA：糖外排转运蛋白；lacZ：β-半乳糖苷酶；lacy：乳糖通透酶；Wcaj：UDP-葡萄糖脂质载体转移酶。

图2菌株L菌落PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株L；

验证长度3305bp；验证引物：mhpr-up/lacy-down。

图3菌株L1菌落PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株L1；

验证长度：1863bp；

验证引物：CS-YZ-F：ttggcagttcatcatagtatttcg

manA-down-R：cgtcattgaccagatccga。

图4菌株L2菌落PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株L2；

验证长度：1290bp；

验证引物：W-YZ-F：GCCGCTTTGTTAACGAAACC

W-YZ-R：GCCCGATCAGCGGAGATACC。

图5菌株L3菌落PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株L3；泳道2-菌株L3；

验证长度：3427bp(验证转化入pTrc99a-manb-mana质粒)

验证引物：99a-yz-f：gcgcaacgcaattaatgtg

99a-AB-tet-r：agcgcattgttagatttcatactcttcctttttcaatattattgaagcat

验证长度：3186bp bp(验证转换入pSB4K5-futC-manC质粒)

验证引物：PSB4K5YZ-F：cagaattggttaattggttggtgc

psb4k5-futc-R：gccgaggtgagaagggttcccatggattcttcgtctgt。

图6菌株L4菌落PCR验证图(验证转化入pTrc99a-manb质粒)

泳道M-marker；泳道1-菌株L4；

验证长度：2175bp

验证引物：99a-yz-f：gcgcaacgcaattaatgtg

99a-AB-tet-r：agcgcattgttagatttcatactcttcctttttcaatattattgaagcat

图7菌株L4菌落PCR验证图(验证转换入pSB4K5-futC-manC质粒)

泳道M-marker；泳道1-菌株L4；

验证长度：3186bp

验证引物：PSB4K5YZ-F：cagaattggttaattggttggtgc

psb4k5-futc-R：gccgaggtgagaagggttcccatggattcttcgtctgt。

图8菌株L5菌落PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株L5；泳道2-菌株L5；

验证长度：3186bp bp(验证转换入pSB4K5-futC-manC质粒)

验证引物：PSB4K5YZ-F：cagaattggttaattggttggtgc

psb4k5-futc-R：gccgaggtgagaagggttcccatggattcttcgtctgt。

验证长度：3427bp(验证转化入pTrc99a-manb-mana质粒)

验证引物：99a-yz-f：gcgcaacgcaattaatgtg

99a-AB-tet-r：agcgcattgttagatttcatactcttcctttttcaatattattgaagcat

图9菌株L6菌落PCR验证图(验证转化入pTrc99a-manb质粒)

泳道M-marker；泳道1-菌株L6；

验证长度：2175bp

验证引物：99a-yz-f：gcgcaacgcaattaatgtg

99a-AB-tet-r：agcgcattgttagatttcatactcttcctttttcaatattattgaagcat

图10菌株L6菌落PCR验证图(验证转换入pSB4K5-futC-manC质粒)

泳道M-marker；泳道1-菌株L6；

验证长度：3186bp

验证引物：PSB4K5YZ-F：cagaattggttaattggttggtgc

psb4k5-futc-R：gccgaggtgagaagggttcccatggattcttcgtctgt。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明对大肠杆菌改造后，使其能够利用不同碳源分别进行生长代谢和生产2′-岩藻糖基乳糖，在培养基中添加甘露糖提高了大肠杆菌中甘露糖转化为GDP-岩藻糖，进而生产2′-岩藻糖基乳糖的转化率。以大肠杆菌MG1655为原始菌株，敲除lac操纵子序列中P_lac启动子序列以及lacI、lacZ基因，并且在1acI、lacZ基因位点上使用P_trc启动子过表达wcaG、gmd、lacy基因作为底盘菌株，利用基因编辑技术在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶(manA)基因，使甘露糖不进入糖酵解(EMP)途径，避免甘露糖被大肠杆菌代谢利用进行生长，并在此基础上进一步敲除UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(Wcaj)基因，使甘露糖合成的GDP-岩藻糖不进入可拉酸(CA)合成途径，进而提高进入大肠杆菌内对甘露糖的利用。并分别构建质粒多拷贝过表达磷酸甘露糖变位酶(manB)、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶(futC)、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(manC)。之后利用甘油，乳糖以及不同浓度的甘露糖培养基进行发酵，结果显示敲除磷酸甘露糖异构酶(manA)的大肠杆菌对比在质粒上过表达磷酸甘露糖异构酶(manA) 的大肠杆菌利用甘露糖合成GDP-岩藻糖，进而生产2′-岩藻糖基乳糖转化率提高，进一步敲除UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(Wcaj)基因的大肠杆菌对比敲除磷酸甘露糖异构酶(manA) 的大肠杆菌利用甘露糖合成GDP-岩藻糖，进而生产2′-岩藻糖基乳糖转化率进一步提高。

实施例菌株构建过程中涉及敲除和表达的上述基因的序列见序列表SEQ IDNO.1-15。

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1底盘菌菌株L的构建

菌株E.coli K12 MG1655ΔlacIZ::P_trc-wcaG-gmd-lacy的构建

以大肠杆菌MG1655为原始菌株，敲除lac操纵子序列中P_lac启动子序列以及lacI、lacZ 基因，并且在lacI、lacZ基因位点上使用P_trc启动子过表达wcaG、gmd、lacy基因。P_trc启动子是P_trp启动子和P_lac启动子的拼合启动子，具有比P_lac启动子更高的转录效率。

构建此菌株使用方法为λRed重组。主要是构建两步同源重组片段，以 pKD46(GenBank:MF287367)作为同源重组质粒，进行基因的敲除及整合。第一步同源重组片段包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因和sacB基因。第二步同源重组片段包含上下游同源臂以及待整合基因。以下详细描述具体方法:

1、第一步同源重组片段mhpr-cat-sacB的构建。构建cat-sacB基因片段，其中cat为氯霉素抗性基因(SEQ ID NO.13)，sacB(SEQ ID NO.14)来源于pEX18Gm质粒；以大肠杆菌MG1655 为模板，分别以mhpr-up，mhpr-2，lacy-1/lacy-down为引物，PCR得到P_lac启动子片段以及 1acIZ基因上、下游同源臂。以三个片段，包括cat-sacB，以及上、下游同源臂为模板，通过重叠PCR得到第一次重组片段mhpr-cat-sacB(lacI与2-FL的表达无关)。

2、制备大肠杆菌MG1655化学转化感受态细胞并将质粒pKD46化转其中。

3、第一步同源重组。将构建好的第一次重组片段mhpr-cat-sacB电转入含pKD46质粒的感受态细胞中，菌液涂于含氨苄青霉素和氯霉素的双抗LB平板，30℃下培养进行筛选，倒置培养24h，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，以出发菌株MG1655做对照。

4、第二步同源重组片段mhpr-P_trc-wcaG-gmd-lacy的构建。以大肠杆菌MG1655为模板，设计引物mhpr-up/mhpr-2，lacy-1-up/lacy-down，PCR得到P_lac启动子片段以及1acIZ基因上、下游同源臂。以pTrc99a-wcaG-gmd质粒为模板(以下会详细描述pTrc99a-wcaG-gmd质粒构建过程)，mhpr-trc-up/wcaG-1-down为引物，PCR获得由P_trc启动子和wcaG，gmd基因组成的待整合基因片段P_trc-wcaG-gmd。以三个片段，通过重叠PCR得到第二次重组片段 mhpr-P_trc-wcaG-gmd-lacy。(第二步同源重组片段中的lacy基因来自将lacy基因设计成第二次重组片段中的下游同源臂)

5、第二步同源重组。

(1)第一次同源重组鉴定正确的重组子制备成电转化感受态细胞。

(2)将第二步同源重组片段mhpr-P_trc-wcaG-gmd-lacy转入第一次同源重组子感受态细胞中， LB培养基中30℃培养3-4h后，转入含有10％蔗糖的LB液体培养基中，37℃继续培养24h，用接种环在含有10％蔗糖的LB固体平板上划线，37℃培养12h后，单菌落分别在LB平板和含有氯霉素的LB平板上培养。

(3)转化子验证，从LB平板上挑取对应不能在含有氯霉素的LB平板上生长的菌落，进行菌落PCR验证，进一步测序验证，获得发生第二次重组的目标菌株，命名为菌株L(验证图见图2)。

第二步同源重组中所需质粒pTrc99a-wcaG-gmd的构建方法为:以pTrc99a质粒(GenBank:U13872)为模板，使用引物pTrc99a-GW-F/pTrc99a-BA-R，PCR扩增得到含有Ptrc启动子的线性pTrc99a载体片段。以大肠杆菌MG1655为模板，分别使用引物gmd-F/gmd-R、wcaG-F/wcaG-R，PCR扩增得到wcaG、gmd基因片段。使用无缝克隆酶pEASY-UniSeamlessCloning and Assembly Kit(全式金)将wcaG、gmd与线性载体pTrc99a片段连接。连接产物经热激转化进入大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-wcaG-gmd。

表1:构建实施例1重组菌株L所用引物

实施例2:菌株L1的构建(敲除manA基因)

菌株L1构建，使用实施例1构建的菌株L作为底盘菌株，敲除基因组上的manA(磷酸甘露糖异构酶)基因。

构建此菌株使用方法为λRed重组技术。主要是构建两步同源重组片段,以 pKD46(GenBank:MF287367)作为同源重组质粒，进行基因的敲除及整合。第一步同源重组片段包含上、下游同源臂、氯霉素抗性基因和sacB基因。第二步同源重组片段包含上、下游同源臂。

以下详细描述具体方法:

1、第一步同源重组片段up-cat-sacB-down的构建。构建cat-sacB基因片段，其中cat为氯霉素抗性基因，sacB来源于pEX18Gm质粒；以菌株L为模板，分别以 manA-up-F/manA-up-R，manA-down-F/manA-down-R为引物，PCR得到manA基因上、下游同源臂。分别以cat-sacB(N)-F/cat-sacB-R为引物，以构建菌株L第一次重组成功的大肠杆菌为模板，PCR得到cat-sacB片段，以三个片段，包括cat-sacB，以及manA基因上、下游同源臂为模板，通过重叠PCR得到第一次重组片段up-cat-sacB-down。

2、制备菌株L化学转化感受态细胞并将质粒pKD46化转其中。

3、第一步同源重组。将构建好的第一次重组片段up-cat-sacB-down电转入含pKD46质粒的菌株L感受态细胞中，菌液涂于含氨苄青霉素和氯霉素的双抗LB平板，30℃下培养进行筛选，倒置培养24h，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，以出发菌株L对照。

4、第二步同源重组片段up-down的构建。以大肠杆菌MG1655为模板，分别以manA-up-F/ manA-up-qcs-R，manA-down-qcs-F/manA-down-R为引物，PCR得到manA基因上、下游同源臂，并以上述同源臂为模板通过重叠PCR得到第二次重组片段up-down。

5、第二步同源重组。

(2)将第二步同源重组片段up-down转入第一次同源重组感受态细胞中，于LB培养基中 30℃培养3-4h后，转入含有10％蔗糖的LB液体培养基中，37℃继续培养24h，用接种环在含有10％蔗糖的LB固体平板上划线，37℃培养12h后，单菌落分别在LB平板和含有氯霉素的LB平板上培养。

(3)转化子验证，从LB平板上挑取对应不能在含有氯霉素的LB平板上生长的菌落，进行菌落PCR验证，进一步测序验证，获得发生第二次重组的目标菌株，命名为菌株L1(验证图见图3)。

表2：构建基因组敲除manA基因所用引物

引物名称	序列
		manA-up-F	gtttcctgatagagatacgtcttg
manA-up-R	aatgtggaaattaatcccactattaaagca
		cat-sacB(N)-F	Gggattaatttccacattatgtcgagtaagttagtactggtt
cat-sacB-R	aattttttcagtaagctctggtgttaccggtgttcaga
		manA-down-F	gagcttactgaaaaaattaacatctctt
manA-down-R	cgtcattgaccagatccga
		manA-down-qcs-F	gagcttactgaaaaaattaacatctcttg
manA-up-qcs-R	caagagatgttaattttttcagtaagctcaatgtggaaattaatcccactattaaagca

实施例3：菌株L2的构建(敲除wcaj基因)

构建菌株L2，使用菌株L1作为底盘菌株，敲除基因组上的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因(Wcaj)，构建此菌株使用方法为cas9。主要是构建第一步同源重组片段包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因和N20基因(SEQ ID NO.15)，之后电转进入需要进行敲除的底盘菌株中，待大肠杆菌在不同抗性的筛选培养基长出后，将第一步重组成功的大肠杆菌诱导 Pcago质粒表达产生cas9蛋白筛选重组成功的片段。以下详细描述具体方法:

1、第一步同源重组片段up-cat-N20-down的构建。构建cat-N20基因片段，其中cat为氯霉素抗性基因，N20来源于Pcago质粒，使用引物Wcm-1/Wcm20-2进行重叠PCR得到cat-N20 片段。以菌株L为模板，分别以up-1/up-2，down-1/down-2为引物，PCR得到Wcaj基因上、下游同源臂。以三个片段，包括cat-N20，以及Wcaj上、下游同源臂为模板，通过重叠PCR 得到第一次重组片段up-cat-N20-down。

2、制备大肠杆菌L1化学转化感受态细胞并将质粒pCAGO质粒化转其中(pCAGO质粒为现有技术，其制备方法详见：Zhao,D.,et al.CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequence limitations and improved targetingefficiency.Scientific Reports. DOI:10.1038/s41598-017-16998-8)。

3、第一步同源重组。将构建好的第一次重组片段up-cat-N20-down电转入含有pCAGO 质粒的L1感受态细胞中，菌液涂于含氨苄青霉素和氯霉素的双抗LB平板含(1％葡萄糖)，30℃下培养进行筛选，倒置培养24h，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，以出发菌株大肠杆菌L1 做对照。

4、第二步重组。

将第一次重组菌进行菌落PCR验证正确的菌转接到含有5微升AMP抗性、5微升IPTG(终浓度0.1M)和100微升阿拉伯糖(终浓度2g/L，配母液1g/10ml)的5ml LB试管中，诱导表达CRISPR/Cas9系统和λ-red蛋白，在30℃培养6h以上，分离单菌落，针对分离出来的单菌落进行对点板，筛选出氯霉素培养基上大肠杆菌不长，氨苄培养基上大肠杆菌培养基上长的单菌落，进行菌落PCR鉴定，以出发菌株大肠杆菌L1做对照，之后将鉴定完成的大肠杆菌于37℃LB培养基中传代培养(传4代)，丢掉Pcago质粒，命名为菌株L2(验证图见图4)。

表3：构建基因组敲除Wcaj基因所用引物

引物名称	序列
		up-1:	TCACCACTTTGTCGTTCTCCATCACTTTC
up-2	AACGATGACAAATCTAAAAAAGCGCG
		wcm-1	TTTTTAGATTTGTCATCGTTATTAATTAATCTCGAGTGTGACG
wcm20-2	GCGCCATAAGGTGAAACCGGCCTTACTTCGGTTCGATGGACTATTACGCCCCGCCCTGCCAC
		down-1	CCGGTTTCACCTTATGGCGCAGCATGTAGCCTTCAATGAGGTTCCTGTTATTAGCCCCTTACCC
down-2	AACGCGGTCGCTATCAGCAAATCAACCTG

实施例4:质粒pSB4K5-futC-manC构建

为低拷贝过表达futC、manC基因，需构建质粒pSB4K5-futC-manC。其中使用biobrick108 启动子过表达futC基因，manC基因。

pSB4K5-futC-manC质粒的构建：以pSB4K5质粒为模板，使用引物psb4k5-2/j23100-R， PCR扩增得到线性pSB4K5载体片段。选择来自幽门螺杆菌的α-(1,2)-岩藻糖基转移酶基因 futC(SEQ ID NO.10所示),使用引物j23108-F/PSB-FUTC-C(G)-R，以携带全基因合成的futC 的pUC57质粒为模板，PCR扩增得到futC基因片段，其中futC基因部分密码子优化。使用引物PSB4K5-FUtc-manC-F/psb4k5-futc-R，以菌株L为模板，PCR扩增得到manC基因片段，使用无缝克隆酶将futC与线性载体pSB4K5片段和manC基因片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证，得到构建成功的质粒pSB4K5-futC-manC。

表4:构建质粒pTrc99a-futC-manC所用引物

实施例5:质粒pTrc99a-manB-manA构建

质粒构建过程如下:以pTrc99a质粒为模板，使用引物pTrc99a-1/pTrc99a-2，PCR扩增得到线性pTrc99a载体。以野生型E.coli MG1655基因组DNA为模板，分别以manB-F/manB-R， manA-F/manA-R为引物进行PCR扩增，得到manB基因以及manA基因，使用无缝克隆酶将 manB、manA与pTrc99a线性载体片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄霉素的LB平板上筛选转化子，进行测序验证，得到构建成功的质粒pTrc99a-manB-manA。

表5:构建质粒pTrc99a-manB-manA所用引物

引物	序列
		manB-F	tttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaaaattaacctgctttaaagc
manB-R	tctccttcttaaagttaaacaaattactcgttcagcaacgtca
		manA-F	gtttaactttaagaaggagatatacatatgcaaaaactcattaactcagtg
manA-R	tctagaggatccccgggtacttacagcttgttgtaaacacgc
		pTrc99a-2	gtgtttacaacaagctgtaagtacccggggatcctctaga
pTrc99a-1	tctccttcttaaagttaaacaaacacaattccacacattatacgagc

实施例6:质粒pTrc99a-manB构建

质粒构建过程如下：以pTrc99a质粒为模板，使用引物99a-sim-f/载体-3，PCR扩增得到线性pTrc99a载体。以野生型E.coli MG1655基因组DNA为模板，分别以TmanB-F/99a-sim-r 为引物进行PCR扩增，得到manB基因，使用无缝克隆酶将manB、pTrc99a线性载体片段连接，连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄霉素的LB平板上筛选转化子，进行质粒提取和测序验证,得到构建成功的质粒pTrc99a-manB。

表6:构建质粒pTrc99a-manB所用引物

引物	序列
		99a-sim-f	agatataccgaattcgagctcg
载体-3	aagttaaacaaaggtctgtttcctgtgtgagattgttatccgctc
		TmanB-F	aacagacctttgtttaactttaagaaggagatataccatgaaaaaattaacctgctt
99a-sim-r	agctcgaattcggtatatctttactcgttcagcaacgtca

实施例7:2′-岩藻糖基乳糖生产菌株构建

为实现2′-岩藻糖基乳糖的生产，需构建以下基因工程菌株：

菌株L3：利用菌株L1为底盘菌株化转入pSB4K5-futC-manC和pTrc99a-manb-mana质粒；

菌株L4：利用菌株L1作为底盘菌株化转进质粒pSB4K5-futC-manC和pTrc99a-manb质粒；

菌株L5(为了进一步验证敲除Wcaj对大肠杆菌利用甘露糖合成GDP-岩藻糖进而合成2′- 岩藻糖基乳糖的影响)：利用构建的菌株L2为底盘菌株化转进pSB4K5-futC-manC和pTrc99a-manb-mana质粒；

菌株L6：利用菌株L2为底盘菌株化转进质粒pSB4K5-futC-manC和pTrc99a-manb质粒。

成功构建的菌株L3、L4、L5、L6的验证图见图5-10。

实施例8:2′-岩藻糖基乳糖生产菌株发酵验证

分别以实施例7构建的菌株L3、L4、L5、L6为实验菌株，对其进行发酵培养，使用HPLC 进行2′-岩藻糖基乳糖的检测分析。发酵及检测过程如下：

LB培养基(1L)：Tryptone(胰蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母提取物)5g，NaC1(氯化钠)5g，其余为水。

发酵培养基：2g/L KH₂PO₄，2g/L NH₄C1，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L MgSO₄.7H₂O，5g/L酵母粉，10mL/L微量元素溶液，不同浓度甘露糖(分别为0g/L，1g/L，5g/L，10g/L),10g/L甘油，5g/L乳糖，其余为水；调节pH至7.0左右；

微量元素溶液：10g/L FeSO₄·7H₂O，2.2g/L ZnSO·7H₂O，1.0g/L CuSO₄·5H₂O，0.38g/L MnSO₄·H₂O，0.02g/L Na₂B₄O₇·10H₂O，0.1g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄，2.0g/L CaCl₂，其余为水；

重组大肠杆菌L3、L4、L5、L6发酵法生产2′-岩藻糖基乳糖的方法如下:

(1)分别挑取获得的基因工程菌株L3、L4、L5、L6单菌落转接到5mL LB液体培养基中，加入氨苄青霉素和卡那霉素(终浓度50μg/mL)，37℃、220r/min培养过夜；

(2)将菌液转接到1mL发酵培养基中(24孔板)，接种量为2％，加入氨苄青霉和卡那霉素(终浓度50μg/mL)。37℃，600rpm，培养48h后取样1mL，检测2′-岩藻糖基乳糖产量，以及培养基中甘露糖利用情况。

(3)收集大肠杆菌发酵液后，利用超声破碎细胞仪破碎发酵后的发酵液，煮沸十分钟，离心10分钟，制备样品进行HPLC检测分析检测2′-岩藻糖基乳糖的产量，发酵液中甘露糖剩余量，结果为三次平行取平均值。

表6 2′-岩藻糖基乳糖产量(g/L)

表7发酵后培养基中甘露糖的剩余量(g/L)

表8培养基中甘露糖产2′-岩藻糖基乳糖转化率

初始甘露糖浓度	L3	L4	L5	L6
					1g/L	63.55％±2％	89.1％±1.6％	88％±0.8％	96.2％±1.5％
5g/L	20.20％±0.2％	42.61％±3.29％	21.34％±0.62％	58.69％±1.48％
					10g/L	10.77％±0.1％	51.63％±1.67％	12.68％±0.34％	53.80％±1.13％

注：L3，L5，L4，L6甘露糖产2′-岩藻糖基乳糖转化率＝(2′-岩藻糖基乳糖实际产量-培养基中甘露糖为 0g时发酵后2′-岩藻糖基乳糖的产量g)/[(2′-岩藻糖基乳糖相对分子质量/甘露糖相对分子质量)×甘露糖的利用量g]；

构建菌株L3，L5的目的是为了对比L4，L6探究有无manA基因甘露糖利用情况的影响，表8结果显示没有manA基因的L4，L6甘露糖生产2′-岩藻糖基乳糖转化率均有提高；由表7可知，含有manA基因的L3，L5培养基中甘露糖基本被消耗完全，而L4，L6培养基中的甘露糖仍然有大量剩余，结合表6的2′-岩藻糖基乳糖数据，可以说明在有manA基因的大肠杆菌内培养基中的甘露糖大部分被用来进行大肠杆菌的生长代谢，而没有用来合成GDP- 岩藻糖，进而合成2′-岩藻糖基乳糖，而敲除manA的大肠杆菌培养基中剩余大量甘露糖，说明甘露糖没有被大肠杆菌利用进行自身的生长代谢即达到利用甘露糖发酵将大肠杆菌的生长与生产2′-岩藻糖基乳糖的分开的目的。

本发明的核心思想是提供一种改造大肠杆菌，使其生长和生产代谢分开，利用甘油等常规碳源进行生长，利用甘露糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖的方法。通过在培养基中添加不同浓度甘露糖验证了菌株利用甘露糖发酵生产2′-岩藻糖基乳糖的能力。结果显示改造后菌株提高了甘露糖转化为2′-岩藻糖基乳糖的转化率，并且2′-岩藻糖基乳糖的产量随着甘露糖含量的增加而得到提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

山东合成远景生物科技有限公司

<120> 一种利用甘露糖合成2'-岩藻糖基乳糖重组大肠杆菌及其应用

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 94

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 1

taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc 60

cataccgcga aaggttttgc gccattcgat ggtg 94

<210> 2

<211> 1082

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 2

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg 120

cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt 180

cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg 240

cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac 300

gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg 360

ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca 420

ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt 480

tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc 540

aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct 600

ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga 660

gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg 720

cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg 780

ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat 840

gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg 900

tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg 960

tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 1020

cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 1080

ga 1082

<210> 3

<211> 3075

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 3

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 60

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180

tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240

gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300

tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360

acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420

cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480

ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540

ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600

caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660

acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720

ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780

ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840

gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa 900

ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac 960

ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat 1020

ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat 1080

catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg 1140

aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac 1200

acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc 1260

atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc 1320

gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg 1380

aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat 1440

ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt 1500

tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc 1560

atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc 1620

cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat 1680

ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat 1740

gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg gcgatacgcc gaacgatcgc 1800

cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa 1860

gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc 1920

agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat 1980

ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagttg 2040

attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc 2100

gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag 2160

tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat 2220

ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac 2280

cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg 2340

ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc 2400

cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa 2460

gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccgct 2520

cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat 2580

ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg 2640

gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga 2700

ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat 2760

ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc 2820

gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc 2880

agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa 2940

gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg 3000

agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc 3060

tggtgtcaaa aataa 3075

<210> 4

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgaattgat ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 60

tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 120

tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 180

ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 240

aattgtgagc ggataacaat ctcacacagg aaacagacc 279

<210> 5

<211> 966

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 5

ttacccccga aagcggtctt gattctcaag gaaccactgg taagtgctgg caagccccgc 60

ttccagtgag atttcgtgat accagccaag ctgatgcagg cgcgtcacat ccagcagttt 120

gcgcggcgtg ccatccggtt tgctggcatc aaaaaccacc cggcctttgt aacccaccac 180

tttggcgatg gtttgcgcca gctcgcggat agtgcagtca acgcccgtgc cgacgttaat 240

gtgcgacaac atcggctggg tgttctccag ccagacttca tgcgccagct ccatgacatg 300

aatgctcgcc gccgccatat catcgacgtg cagaaattcg cgcatcggtg taccgctgcc 360

ccataccacc acgtccggcg cattctgtgc cgtcgcctcg tggaagcgac gcagcaatgc 420

tgggatcaca tgcgaattac tcgggtggaa gttgtcgtgt ggcccgtaca ggttggtcgg 480

catgactgag cggtaatcgc gtccgtactg gcggttgtat gattcgcaca gtttgatccc 540

ggcgattttg gcaatagcat aaggctcgtt agtcggctcc agcgtgccct gcaacaactc 600

gctttctgcc atcggctgtt ttgccagttt cgggtagatg caggacgatc cgagaaacag 660

cagtttgttc acgtcgttct gatgcgcggc gtgaatgatg ttgctctcaa tcatcatgtt 720

ctggtagatg aaatccgccg gataggtgtt gttggcaaca atgccgccca ctttcgccgc 780

cgccagatag acctggtcaa tacgttcgct ggcaaagaaa tcatgcacgg cgcggctgtc 840

cagcaggttc agctcgtcgc gggtgcgtaa taccagttcc acatcaccgc gctgttcgag 900

ctgccgcctg atggcggaac cgaccatccc gcgatgacca gcaataaaaa ctcgttgttt 960

actcat 966

<210> 6

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 6

ttatgactcc agcgcgatcg ccacgtcgta gccgtgagat ttcagcagag agtgtttttt 60

cgccgcttcg aggtcattag ccaccatttc agacaccatc tctctgaggg tgatttccgg 120

tttccagccc agtttttcgt gcgctttggt cgggtcgccg agcagcgttt caacttcagc 180

cggacggaag taacgcgggt caacagcgat aatcacatca cccggtttaa cgcccggcgc 240

gtcatgcccg gtgacggaaa ccacaatgcc cttctcttca acgcccgtgc cttcaaagcg 300

cagtttgatg cccagctgtg ctgccgccat ttccacgaac tgacgcacgg agtactgaac 360

gccggtcgcg ataacgaaat cttccggctg ttcctgctgc agcatcatcc actgcatttt 420

tacgtagtct ttggcgtggc cccagtcacg cagggaatcc atattgccga ggtacaggca 480

cgactccagc ccctgggcga tgttggcgat tgcgcgggtg attttgcggg taacgaaggt 540

ttcgccgcgg cgcggggatt catggttgaa gagaattccg ttacaggcgt acatgccgta 600

ggattcacgg tagttaacgg tgatccagta ggcgtacagt ttggcgaccg catacggaga 660

tcgcgggtag aacggcgtgg tctctttctg cggaatttcc tgcaccagac catacagttc 720

agaggtggaa gcctgataga aacgagtttt cttttccaga ccgaggaagc ggatcgcctc 780

cagcaggcgc agcgtaccca tcgcgtcgac gtcagcggta tattctggtg actcaaaaga 840

gaccgcaacg tggctcattg cgcccaggtt gtacacttca tccggctgta cttcacgcaa 900

aatgcgcgtc aggttagagg tatcactcag gtcgccataa tgcagatgga atttcgggtt 960

gcaggtgtgc ggatcctgat aaatgtgatc cacgcgctcg gtgttgaatg acgatgcgcg 1020

acgcttaata ccatgcacct cgtaaccttt ttccagcaga aactctgcca ggtaagaacc 1080

gtcttgtccg gttacaccgg tgatgagagc gacttttgac at 1122

<210> 7

<211> 1254

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 7

ttaagcgact tcattcacct gacgacgcag cagggaaagc gggccggggc cgctaagcgt 60

gaacacggaa attaaggtga agcccagcgc caccagaccc agcaccagat aagcgccctg 120

gaaaccgatg ctttcataca tattgcccgc cagtacagac ataaaaatca tcgccagttg 180

cttaaagaag cagaaacaga ccagataaat cgtcgctgaa aaacgcactt caaactggct 240

ggtaatatat ttaaagcagc ccaccagcag gaacggtact tcaaacatat gcagcgtttt 300

cagaataacc acttccagcg ctgaggtggc gaacgatgag ccaataatac gtacagacat 360

aatagtgcca gccagcagca gggcgttttt cccaccgatg cgattaatga tcagtggcgc 420

aaagaacata atcgaggcgt taagtaattc gcccattgtc gttacgtagc caaatacccg 480

cgtaccctgt tcaccggtag caaagaacga agtaaagaaa ttagcaaact gttggtcaaa 540

aacatcgtag gtgcaggaaa cgccaataac atacagtgac aaaaaccaca gttttggctg 600

tctgaacagt tccagtgcca gcttaaggct aaatgccgaa tggttggcac ctaccgcatt 660

ggcaaccgtg gcagaagagg gcgcatccgt tttggcgaaa aagagtaaaa cggcgaggat 720

gagtgcacag ccagagccca gccagaaaac aaactgatta ttgatggtga acatgatgcc 780

gacaatcgag gcacacagcg cccagccaac acagccaaac atccgcgcgc gaccaaattc 840

gaaattactg cgacggctga ctttctcaat aaatgcctct actgctggcg caccggcgtt 900

aaaacaaaag cctagataaa taccaccaac aatcgatcct actaaaatgt tgtattgtaa 960

cagtggcccg aagataaaaa taaagaacgg cgcaaacatc actaacatgc cggtaataat 1020

ccacagcagg tatttgcgca gcccgagttt gtcagaaagc agaccaaaca gcggttggaa 1080

taatagcgag aacagagaaa tagcggcaaa aataataccc gtatcacttt tgctgatatg 1140

gttgatgtca tgtagccaaa tcgggaaaaa cgggaagtag gctcccatga taaaaaagta 1200

aaagaaaaag aataaaccga acatccaaaa gtttgtgttt tttaaatagt acat 1254

<210> 8

<211> 1176

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 8

atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120

catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180

gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240

ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300

aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360

gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420

cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480

gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540

agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600

attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660

tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720

ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780

gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840

tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900

ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960

tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020

gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080

cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140

cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 9

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 9

atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60

aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120

attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371

<210> 10

<211> 906

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌

<400> 10

atggctttta aagtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat tacttctttt 120

gattggagca ataggaaaat gcaattagag cttttcccta ttgatttacc ctatgcgaat 180

gcaaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agatacgctc 240

aaatacatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgtgt ttgaatacga gcctaaattg 300

ttaaagccaa gccgcttgac ttatttttat ggctattttc aagatccacg atattttgat 360

gctatatccc ctttaatcaa gcaaactttc accctacccc accccccccc ccccgaaaat 420

ggaaataata aaaaaaaaga ggaagaatac caccgcaaac ttgctttgat tttagccgct 480

caaaacagcg tgtttgtgca tataagaaga ggggattatg tggggattgg ctgtcagctt 540

ggcattgact atcaaaaaaa ggcgcttgag tatatggcaa aacgcgtgcc aaacatggaa 600

cttttcgtgt tttgcgaaga cttagaattc acgcaaaatc ttgatcttgg ctaccctttt 660

atggacatga ccactaggga tagagaagaa gaggcgtatt gggatatgct gctcatgcaa 720

tcctgtcagc atggcattat cgctaatagc acttatagct ggtgggcggc ttatttgata 780

gaaaatccag aaaaaatcat tattggcccc aaacactggc tttttgggca tgagaatatc 840

ctttgtgagg aatgggtgaa aatagaatcc cattttgagg taaaatccca aaagtataac 900

gcttaa 906

<210> 11

<211> 1437

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 11

atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60

ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120

ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180

aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240

aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300

gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360

gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420

gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480

attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540

tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600

tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660

cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720

tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780

gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840

ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900

ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960

accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020

gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080

catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140

gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200

cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260

attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320

acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380

tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437

<210> 12

<211> 1395

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655

<400> 12

tcaatatgcc gctttgttaa cgaaaccttt gaacaccgtc aggaaaacga ttttgatatc 60

gaaccagacg ctccattcgc ggatgtactc aaggtcgaac tcgacgcgtt tttccatttt 120

ctccagcgtg tcggtttcgc cgcgccagcc gttaatctgc gcccagccgg taatgcccgg 180

tttcacctta tggcgcagca tgtagccttc aatgagctgt cgatactgtt cgttatgcgc 240

tactgcgtgc ggacgtggac cgacaatcga catccccccg gtcagcacat tgataaactg 300

cggcaattca tccagcgagg tacggcgcag aaagttcccc actttggtga cgcgcggatc 360

gttctgcgtc gcctgggtca ccactttgtc gttctccatc actttcatgg aacggaactt 420

ccacactttg atcggcttgc catccatgcc gtagcgagtc tggcggaaaa taaccggccc 480

tggtgaactg agtttcaccg ccagcgcaat acagcacagc accggggaga tcagcagcag 540

aataagcgtc gccagcacaa tgtcttccgc acgtttgagc aggcggttaa ccccggaaag 600

cggcgtgtcg taaagcggca ccaccggtac gccgttcatc tcttcgaggc gtgaatggag 660

aatgttgaag gtaaagacgt cggggatcag cagcaccgaa caggtggtgt ccgccagttg 720

atggaccagt tttttcactc gcgcgccgtc gcacatttgc atcgcgatat agacgttatg 780

aatcttgccc gctttcgcgt cctcgaccag ctgttgcagg ttacccgccc agtcgttaga 840

aacgccgccc ggtttcgggt cgtggtaaac gcccaccact tcaaacccta accacggctg 900

gttacggaag ctctccatca gcatttgccc ggcggctaaa tcccccgcca ccgcgaccat 960

gcgcttgtta tagccatgat tacgcagcca gcccgcccca atgcgaatac acgaacggca 1020

aaccaccagt ccgatgctgg tcagcgcata ccacgccagc cagattttca gttgcgtgtc 1080

gaaatcattg ttgaacgcca ccagtccggc gctgaaaatc acgcttaagg tccagttttg 1140

tagcaacagg gcaaattctg tcgctgcccg aacaccgcgc catgagcgat aaaaatcggt 1200

gatgccgccc agcatctgga acaccaccag cgtaatcagc gccaccaaca ggtgcatgta 1260

gaggaatgac agtccgctga cttcgcaaac cagccatagt ccggcaaaca tgatggtgat 1320

atctgaaaag cgttgcacca tagagattaa cgatgcattg gttttcgctc gctcgcgctt 1380

ttttagattt gtcat 1395

<210> 13

<211> 660

<212> DNA

<213> pEX18Gm质粒

<400> 13

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180

cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240

gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300

acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360

tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540

gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600

gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660

<210> 14

<211> 1422

<212> DNA

<213> pEX18Gm质粒

<400> 14

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgaaa gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca 120

tacggcattt cccatattac acgccatgat atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat 180

gaaaaatatc aagttcctga attcgattcg tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa 240

ggcctggacg tttgggacag ctggccatta caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat 300

cacggctacc acatcgtctt tgcattagcc ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg 360

atttacatgt tctatcaaaa agtcggcgaa acttctattg acagctggaa aaacgctggc 420

cgcgtcttta aagacagcga caaattcgat gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaaca 480

caagaatggt caggttcagc cacatttaca tctgacggaa aaatccgttt attctacact 540

gatttctccg gtaaacatta cggcaaacaa acactgacaa ctgcacaagt taacgtatca 600

gcatcagaca gctctttgaa catcaacggt gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt 660

gacggaaaaa cgtatcaaaa tgtacagcag ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc 720

gacaaccata cgctgagaga tcctcactac gtagaagata aaggccacaa atacttagta 780

tttgaagcaa acactggaac tgaagatggc taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa 840

gcatactatg gcaaaagcac atcattcttc cgtcaagaaa gtcaaaaact tctgcaaagc 900

gataaaaaac gcacggctga gttagcaaac ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat 960

gattacacac tgaaaaaagt gatgaaaccg ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa 1020

attgaacgcg cgaacgtctt taaaatgaac ggcaaatggt acctgttcac tgactcccgc 1080

ggatcaaaaa tgacgattga cggcattacg tctaacgata tttacatgct tggttatgtt 1140

tctaattctt taactggccc atacaagccg ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg 1200

gatcttgatc ctaacgatgt aacctttact tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa 1260

ggaaacaatg tcgtgattac aagctatatg acaaacagag gattctacgc agacaaacaa 1320

tcaacgtttg cgccaagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa 1380

gacagcatcc ttgaacaagg acaattaaca gttaacaaat aa 1422

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> pCAGO质粒

<400> 15

tagtccatcg aaccgaagta 20

Claims

1.一种以甘露糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为出发菌株，在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA所得。

2.如权利要求1所述的生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除lacI、lacZ基因，并且过表达wcaG、gmd、lacy基因，之后在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA，过表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶基因futC、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manC所得。

3.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，使用P_trc启动子过表达wcaG、gmd、lacy基因。

4.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，采用pSB4K5质粒表达futC、manC。

5.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，采用pTrc99a质粒表达manb。

6.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，还敲除UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因Wcaj。

7.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌MG1655为出发菌株。

8.如权利要求1所述的一株生产2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，

所述P_lac启动子，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

所述lacI基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

所述lacZ基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；

所述P_trc启动子，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；

所述wcaG基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

所述gmd基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

所述lacy基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；

所述manA基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；

所述manB基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；

所述futC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；

所述manC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；

所述Wcaj基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示。

9.权利要求1-8任意一项所述工程菌在生产2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵制备2′-岩藻糖基乳糖的方法如下：将工程菌种子液按2-10％接种量发酵培养基中，30-37℃，400-600rpm，培养36-52h；

发酵培养基组成如下：1.5-3.5g/L KH₂PO₄，1.5-3.5g/L NH₄Cl，1.7-2.5g/L柠檬酸，1.4-2g/L MgSO₄·7H₂O，5-7g/L酵母粉，10-20mL/L微量元素溶液，1-10g/L甘露糖，10-15g/L甘油，5-10g/L乳糖，其余为水。