CN113462629B - 一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法 - Google Patents

一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组菌株，所述重组菌株是将重组质粒pETDuet‑vgb‑manC‑B和pCDFDuet‑gmd‑fcl‑wcfB‑lacY共转化到大肠杆菌获得。本发明还公开了重组菌株的构建方法和该重组菌株在发酵生产2’‑FL中的应用。本发明通过设计RBS序列，以适中的水平表达透明颤菌血红蛋白VHB的编码基因vgb，成功抑制了重组JM109(DE3)菌株的乙酸分泌，又避免了VHB带来的细胞毒性，使得发酵获得的菌浓度OD600和2’‑FL产量大幅提高，具有很强的应用价值。

Description

一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法。
背景技术
母乳概念一直是配方奶粉的发展方向，尤其是女性产假偏少、认识不足等客观原因导致近年来我国母乳喂养率不断走低，更需要开发母乳类添加剂。尽管我国配方奶粉生产水平不断提高，但对母乳成分的添加不够重视。国外特别是欧洲国家在母乳类添加剂上的研究历史悠久，早在上世纪90年代就已经开展了生物技术合成人乳寡糖的研究，成功研发了2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose，本文简称2’-FL)和乳糖-N-新四糖的生物合成方法。
2’-岩藻糖基乳糖的结构如下：
Figure BDA0003171721850000011
其中2’-FL是母乳中重要的活性成分，它具有以下功效：(1)促进肠道益生菌的繁殖、抑制有害菌生长。人摄入2’-岩藻糖基乳糖后，由于其结构稳定不会被胃酸以及消化酶破坏，因此可以直接到达大肠部位，促进肠道中的双歧杆菌和乳酸菌生长。(2)抗病原菌粘附作用。肠道病原菌入侵人体后的第一步通常是在上皮细胞定殖，随后开始感染组织。2’-岩藻糖基乳糖的结构恰好与肠道上皮细胞上的糖蛋白、糖链部分结构相似，因此可以诱骗病原菌与其结合而不与肠道上皮细胞结合，从而阻断其定殖过程。(3)对免疫系统进行调节，降低炎症反应。研究表明，2’-岩藻糖基乳糖可以直接参与细胞因子的分泌调节来影响免疫系统，例如在婴儿体内可以降低炎症细胞因子(IL-lra、IL-1α、IL-lβ、IL-6、肿瘤坏死因子-α)浓度，这与母乳喂养结果基本一致；而普通奶粉喂养组则出现炎症细胞因子显著上升的情况。基于以上研究，商业机构预测2’-FL是未来最为重要的婴幼儿配方奶粉添加剂之一，产业规模可能超过DHA(二十二碳六烯酸)等经典产品。2’-FL项目目前已经产业化并获得了欧盟的生产许可证，雀巢等公司将其添加到自身产品中销售，这表明2’-FL的应用前景光明。2’-FL的生产主要依靠重组大肠杆菌，通过将2’-FL合成基因簇克隆到BL21(DE3)、或JM109(DE3)、或BL21star(DE3)等菌株，以葡萄糖、或甘油、或蔗糖为碳源，以乳糖为合成前体，经过高密度发酵获得大量2’-FL。如何提升2’-FL产量成为当前研发的热点问题，以JM109(DE3)菌株为例，在发酵过程中会产生大量乙酸，严重影响了菌株生长与2’-FL合成。
发明内容
发明目的：本发明的目的是通过生物工程技术，提高大肠杆菌基因工程菌的细胞密度以及2’-FL终产量，本发明所要解决的技术问题是在JM109(DE3)菌株中表达透明颤菌血红蛋白VHB，并在高密度发酵中获得更高的2’-FL产量。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株是将重组质粒pETDuet-vgb-manC-B和pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY共转化到大肠杆菌获得。
其中，所述重组质粒pETDuet-vgb-manC-B是将连接有特殊RBS序列的vgb基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-vgb，然后将基因簇manC-B克隆到pETDuet-vgb上获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B。
其中，所述重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY是将基因簇gmd-fcl克隆到pCDFDuet-1质粒上获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl，然后将wcfB基因与lacY基因通过RBS序列连接得到wcfB-lacY，再克隆到pCDFDuet-gmd-fcl上获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY。
其中，所述大肠杆菌菌株为JM109(DE3)菌株。
其中，所述特殊RBS序列为TCGATTAAGGCTATTATTATCAT。
其中，所述RBS序列为AAGAAGGAGATATACC。
本发明内容还包括所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
1)重组质粒pETDuet-vgb-manC-B的构建：将连接有特殊RBS序列“TCGATTAAGGCTATTATTATCAT”的vgb基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-vgb，然后将基因簇manC-B克隆到pETDuet-vgb上获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B；
2)重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY的构建：PCR获得的gmd-fcl基因簇克隆到pCDFDuet-1质粒，WcfB基因与lacy基因分别被PCR扩增获得并纯化后，再通过重叠PCR方法连接，两基因之间为RBS序列“AAGAAGGAGATATACC”得到wcfB-lacY，最后将wcfB-lacY克隆到pCDFDuet-gmd-fcl质粒的NdeI和XhoI位点即得到重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY；
3)重组质粒pETDuet-vgb-manC-B和pCDFDuet-gmd-jcl-wcfB-lacY共转化到大肠杆菌。
其中，所述步骤3)的共转化条件为：将大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞悬液置于冰上；加入pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY质粒和pETDuet-vgb-manC-B质粒，用移液器轻柔混匀，冰上静置，42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液，加入LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1小时。
本发明内容还包括所述的重组菌株在发酵生产2’-FL中的应用。
其中，所述发酵培养基为：5～20g/L葡萄糖，5～20g/L蛋白胨，5～20g/L酵母粉，1～10g/LNH4H2PO4，1～10g/L K2HPO4，1～5g/L KOH，0.1～0.5g/L柠檬酸，1～5g/L MgSO4·7H2O，0.01～0.05g/L CaCl2·6H2O，链霉素25mg/L，氨苄青霉素50mg/L。
本发明将透明颤菌血红蛋白VHB的编码基因vgb与特定的RBS序列连接，再克隆到pETDuet-1质粒的XbaI和BamHI位点，同时将基因簇manC-B连接到pETDuet-1质粒的NdeI和XhoI位点，获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B，将该质粒转化JM109(DE3)菌株，获得JM109(DE3)-vm重组菌株。将基因簇gmd-fcl克隆到pCDFDuet-1质粒的NcoI-BamHI位点，再将wcfB基因与连接有RBS序列的lacY基因通过重叠PCR连接，然后克隆到NdeI-XhoI位点，获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY。将该质粒转化JM109(DE3)-vm菌株，获得重组菌株JM109(DE3)-vm-gfwl。该重组菌株与具有相同构建方法但不含有vgb基因的对照重组菌株JM109(DE3)-m-gfwl相比，摇瓶以及发酵罐发酵的菌浓度OD600和2’-FL产量均大幅提高，乙酸浓度显著降低。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：现有技术中重组JM109(DE3)菌株能够用于合成2’-FL，但发酵过程乙酸分泌量大，抑制细菌生长、不适合高密度发酵，导致2’-FL产量很难进一步提高。本发明通过设计RBS序列，以适中的水平表达透明颤菌血红蛋白VHB的编码基因vgb，成功抑制了重组JM109(DE3)菌株的乙酸分泌，又避免了VHB带来的细胞毒性，使得发酵获得的菌浓度OD600和2’-FL产量大幅提高，具有很强的应用价值。
附图说明
图1、vgb基因的扩增电泳图，其中泳道1为DNAmarker、泳道2和3均为PCR获得的vgb基因产物
图2、manC-B基因簇片段的扩增电泳图，其中泳道1为DNAmarker、泳道4为PCR获得的manC-B基因簇片段产物；
图3、wcfB基因的的扩增电泳图，其中泳道1为DNA marker、泳道2～5均为PCR获得的wcfB基因产物；
图4、lacY基因的的扩增电泳图，其中泳道1为DNAmarker、泳道2和3均为PCR获得的lacY基因产物；
图5、JM109(DE3)-m-gfwl菌株在7.5升发酵罐中的发酵曲线；
图6、JM109(DE3)-vm-gfwl菌株在7.5升发酵罐中的发酵曲线；
图7、用于2’-FL含量测定的标准曲线；
图8、用于乙酸含量测定的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为本发明的限制。
实施例1重组质粒pETDuet-vgb的构建
1)提取大肠杆菌E.coli K12菌株的基因组，通过PCR方法(聚合酶链式反应)扩增获得如下两个基因簇：manC-B(Genbank登录号：NP_416553.1)；gmd-fcl(Genbank登录号：NP416557.1)，扩增获得如下基因：lacy(Genbank登录号：AKK16698.1)。委托通用生物系统(安徽)有限公司，通过DNA全合成获得脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)来源岩藻糖基转移酶wcfB基因(Genbank登录号：CAH06753.1)和透明颤菌(Vitreoscilla)来源血红蛋白vgb基因(Genbank登录号：AUZ04849.1)。
2)由于vgb基因具有细胞膜结合能力，在表达后可以影响细胞膜的功能，因此具有一定细胞毒性。通过控制该基因对应的RBS序列，能够降低vgb基因的表达水平，从而降低细胞毒性。为筛选出最优的RBS序列，将vgb基因通过聚合酶链式反应(PCR)与不同RBS序列连接并引入酶切位点XbaI和BamHI(RBS序列如表1所示，所需引物如表2所示)，纯化回收DNA片段后与pETDuet-1质粒(实验室保藏)连接，该质粒提前用XbaI和BamHI双酶切来线性化，连接后得到重组质粒pETDuet-vgb。
该步骤具体实验方法如下：使用XbaI和BamHI酶双酶切pETDuet质粒，酶切体系为：pETDuet质粒50μL，XbaI酶(NEB公司，货号：R0145S)3μL，BamHI酶(NEB公司，货号：R0136S)3μL，10*缓冲液10μL，双蒸水34μL；37℃酶切8小时，使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收酶切后的质粒DNA。通过PCR法扩增vgb基因，扩增体系为：2*高保真Taq DNA聚合酶mix 50μL，正向引物2μL，反向引物2μL，全合成获得的vgb基因片段2μL，双蒸水44μL；PCR仪扩增程序：94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸30秒，反复进行30个循环。使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收扩增的vgb基因片段(图1，片段大小约为500bp)，使用南京诺唯赞公司的连接试剂盒(货号：C112-01)连接酶切后的pETDuet质粒和扩增的vgb基因DNA片段，具体方法见试剂盒说明书，连接后得到重组质粒pETDuet-vgb。
表1不同RBS序列对表达后重组菌株生长的影响
Figure BDA0003171721850000041
Figure BDA0003171721850000051
表2引物序列
Figure BDA0003171721850000052
实施例2重组菌株JM109(DE3)-vgb的获得以及发酵表达
将该重组质粒转化JM109(DE3)菌株，通过LB液体培养基发酵，以0.5mM IPTG为诱导剂，25℃表达24小时。
转化pETDuet-vgb重组质粒至JM109(DE3)菌株的具体方法如下：
A1、制备含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂)。
A2、取一个1.5ml离心管，加入100μL大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞悬液(北京华越洋生物，货号：NRR00980)，置于冰上；加入1μLpETDuet-vgb质粒(100ng/μL浓度)，用移液器轻柔混匀，冰上静置20min。
A3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液。
A4、加入1 mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(100rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
A5、取100μL菌液，至含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，涂布均匀。
A6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，出现单菌落后挑取单菌落到含有50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养至浑浊，吸取500μL菌液至灭过菌EP管，再加入500μL 40％(w/w)浓度甘油，混匀后-80℃保藏待用。
考察不同RBS序列对JM109(DE3)-vgb菌株表达后的最终生长情况，重组菌株JM109(DE3)-vgb在摇瓶中发酵表达的具体方法为：使用三角摇瓶发酵，摇瓶规格500mL，装液量100mL；将重组菌株JM109(DE3)-vgb以1％(v/v)接种量分别接种到摇瓶中，内有含葡萄糖的LB培养基(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L葡萄糖，氨苄青霉素50mg/L)，37℃，220rpm培养至OD＝1.0，冷却至25℃，加入终浓度0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续25℃，220rpm培养发酵24小时。
结果如实施例1表1所示。结果表明，RBS序列为3号所示序列时，菌株生长最优，因此后续实验选择3号RBS序列用于vgb基因的表达。
实施例3 pETDuet-vgb-manC-B质粒的构建与表达
将pETDuet-vgb质粒用NdeI和XhoI双酶切线性化备用，通过PCR扩增基因簇manC-B(图2)并引入酶切位点NdeI和XhoI(引物如表2所示)。将PCR产物与线性化的pETDuet-vgb质粒连接，得到pETDuet-vgb-manC-B，于-20℃保藏备用。该步骤具体实验方法如下：
使用NdeI和XhoI酶双酶切pETDuet-vgb质粒，酶切体系为：pETDuet-vgb质粒50μL，NdeI酶(NEB公司，货号：R0111S)3μL，XhoI酶(NEB公司，货号：R0146S)3μL，10*缓冲液10μL，双蒸水34μL；37℃酶切8小时，使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收酶切后的质粒DNA。通过PCR法扩增manC-B基因簇，扩增体系为：2*高保真Taq DNA聚合酶mix 50μL，正向引物2μL，反向引物2μL，大肠杆菌E.coli K12菌株基因组2μL，双蒸水44μL；PCR仪扩增程序：94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸3分钟，反复进行30个循环。使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收扩增的manC-B基因簇DNA片段。使用南京诺唯赞公司的连接试剂盒(货号：C112-01)连接酶切后的pETDuet-vgb质粒和扩增的manC-B基因DNA片段，具体方法见试剂盒说明书。使用相同方法获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY，其中将PCR获得的gmd-fcl基因簇克隆到pCDFDuet-1质粒的NcoI-BamHI位点。WcfB基因(图3)与lacy基因(图4)分别被PCR扩增获得并纯化后，再通过重叠PCR方法连接，两基因之间为RBS序列“AAGAAGGAGATATACC”，最终得到wcfB-lacy。重叠PCR扩增程序：初始反应体系为wcfB基因片段lμL，lacY基因片段1μL，双蒸水44μL；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸2分钟，重复进行5个循环。此时再向反应体系加入2*高保真Taq DNA聚合酶mix 50μL，正向引物2μL，反向引物2μL；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸2分钟，重复进行30个循环。使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收扩增的wcfB-lacY DNA片段。最后将wcfB-lacY克隆到pCDFDuet-gmd-fcl质粒的NdeI和XhoI位点即得到重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY。
实施例4JM109(DE3)-vm-gfwl菌株和JM109(DE3)-m-gfwl菌株的获得
通过质粒转化方法将pETDuet-vgb-manC-B、pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY两个质粒共转化到JM109(DE3)菌株(北京华越洋生物，货号：NRR00980)，获得JM109(DE3)-vm-gfwl菌株。使用同样方法将pETDuet-manC-B、pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY两个质粒共转化到JM109(DE3)菌株，则获得JM109(DE3)-m-gfwl菌株。
该步骤具体实验方法举例如下：
A1、制备含有25mg/L链霉素，50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂)。
A2、取一个1.5ml离心管，加入100μL大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞悬液(北京华越洋生物，货号：NRR00980)，置于冰上；加入1μL pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY质粒(100ng/μL浓度)、1μL pETDuet-vgb-manC-B质粒(100ng/μL浓度)，用移液器轻柔混匀，冰上静置20min。
A3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液。
A4、加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(100rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
A5、取100μL菌液，至含有25mg/L链霉素，50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，涂布均匀。
A6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，出现单菌落后挑取单菌落到含有25mg/L链霉素，50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养至浑浊，吸取500μL菌液至灭过菌EP管，再加入500μL40％(w/w)浓度甘油，混匀后-80℃保藏待用。
实施例5 JMl09(DE3)-m-gfwl和JM109(DE3)-vm-gfwl重组菌株摇瓶合成2’-FL
JM109(DE3)-m-gfwl和JM109(DE3)-vm-gfwl重组菌株都能够在含有葡萄糖和乳糖的LB培养基中合成2’-FL。该步骤具体方法为：使用三角摇瓶发酵，摇瓶规格500mL，装液量100mE；将重组菌株以1％(v/v)接种量分别接种到摇瓶中，内有含葡萄糖的LB培养基(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L葡萄糖，链霉素25mg/L，氨苄青霉素50mg/L)，37℃，220rpm培养至OD＝1.0，冷却至25℃，加入终浓度0.2mM IPTG和5g/L乳糖，继续25℃，220rpm培养发酵60小时；对比标品标准曲线，最终测得JM109(DE3)-m-gfwl菌株发酵液中2’-FL含量为1.2g/L，菌浓度OD600为5.5，发酵液pH为4.4；而JM109(DE3)-vm-gfwl菌株发酵液中2’-FL含量为2.3g/L，菌浓度OD600为10.7，发酵液pH为5.5。该结果表明vgb基因的表达在摇瓶发酵中能够提高2’-FL合成浓度1.92倍，并且避免pH显著降低，菌浓度OD600值是不含vgb基因重组菌1.95倍。
实施例6 JM109(DE3)-m-gfw1菌株发酵罐发酵获得2’-FL
将600g/L浓度葡萄糖溶液装入补料瓶，并加入MgSO4·7H2O至终浓度10g/L，115℃高温湿热灭菌25分钟备用。在10L发酵罐中装入5L培养基(配方为5g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，7g/LNH4H2PO4，7g/L K2HPO4，2g/L KOH，0.3g/L柠檬酸，2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L CaCl2·6H2O，20g/L葡萄糖，链霉素25mg/L，氨苄青霉素50mg/L)，121℃高温湿热灭菌20分钟(其中葡萄糖115℃单独高温湿热灭菌25分钟，抗生素通过0.22μm滤膜过滤后加入)。
将实施例4所得JM109(DE3)-m-gfwl和JM109(DE3)-vm-gfwl菌株分别以10％(v/v)接种量接入7.5升发酵罐，37℃培养，期间控制搅拌转速rpm＝400，通气1vvm，pH通过流加氨水控制为7.0；至OD600＝20时降温至25℃，调节搅拌转速rpm＝600，通气2vvm，流加入终浓度25g/L的乳糖(115℃高温湿热灭菌25分钟)和终浓度0.2mM的IPTG(经过0.22微米滤膜过滤)，期间若发现pH逐步上升则表示葡萄糖耗尽，应立即流加葡萄糖至终浓度10g/L并继续发酵；维持整个发酵周期为80小时。期间用薄层层析TLC法鉴定发酵液中各糖组份含量变化，具体方法为：展开剂：2％苯胺-丙酮溶液：2％二苯胺-丙酮溶液：85％磷酸＝5∶5∶1(v/v)；显色剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水＝7∶20：12∶7∶6(v/v)；检测时用毛细管将糖液样品点于硅胶板，吹风机吹干后置于层析缸，通过展开剂展开至距离硅胶板上沿约2厘米处，取出吹风机吹干后用喷雾瓶均匀喷撒显色剂，置于烘箱中100℃烘烤15-20分钟应可见各样品斑点；从板上方到下方依次是葡萄糖、乳糖、2’-FL，每次点样可同时点上这几种物质的标准品进行对比。若点样斑点过大、拖尾变形等，则应减少点样量再次试验。
结果表明JM109(DE3)-m-gfwl菌株7.5升发酵罐发酵获得的2’-FL产量为17.5g/L，菌浓度OD600为47.5，乙酸浓度8.2g/L(发酵曲线如图5所示)；而JM109(DE3)-vm-gfw1菌株发酵罐发酵获得的2’-FL产量为31.5g/L，菌浓度OD600为74.2，乙酸浓度2.5g/L(发酵曲线如图6所示)。即表达vgb基因可以提高发酵罐中2’-FL产量1.8倍，提高菌浓度OD600值1.6倍，乙酸浓度仅为不含vgb基因菌株的30％。而相比于JM109(DE3)-m-gfwl菌株的摇瓶发酵水平，JM109(DE3)-vm-gfwl菌株的发酵罐2’-FL产量是它的26.3倍，菌浓度是它的13.5倍，均获得了显著提高。
该步骤中通过高效液相色谱法(HPLC)测定反应液中2’-FL和乙酸的浓度，方法如下：液相设备：Agilent 1260 Infinity II；示差检测器检测，型号：G7162A-1260 RId；液相柱型号：Sepax HP-Amino，4.6*250mm、5微米粒径(或同等规格氨基柱)；流速：0.8ml/min，流动相：80％纯乙腈：20％水(v/v)，系统温度：35℃，进样量10～20微升。
其中2’-FL含量标准曲线的制作方法如下：取2’-FL标准品粉末(上海阿拉丁生化科技公司，货号：F130960)溶解制成不同浓度的糖液(1、2、5、10、15、20g/L)。在高效液相色谱设备中分别进样并积分计算产物峰的峰面积S，以各峰面积S和2’-FL浓度(g/L)分别为纵/横坐标作散点图，拟合产生直线即为标品的标准曲线，要求拟合方程的R2值大于0.99属于合格，标准曲线图参见图7。
其中乙酸含量标准曲线的制作方法如下：取分析纯乙酸(上海阿拉丁生化科技公司，货号：A116166)稀释制成不同浓度(1、2、5、10、15g/L)。在高效液相色谱设备中分别进样并积分计算产物峰的峰面积S，以各峰面积S和乙酸浓度(g/L)分别为纵/横坐标作散点图，拟合产生直线即为标品的标准曲线，要求拟合方程的R2值大于0.99属于合格，标准曲线图参见图8。
序列表
<110> 南通励成生物工程有限公司
<120> 一种提高大肠杆菌基因工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> RBS序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgattaagg cattcat 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> RBS序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgattaagg ctattatcat 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> RBS序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgattaagg ctattattat cat 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> RBS序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgattaagg cattattatt atcat 25
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> manC-B-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 5
taagaaggag atatacatat ggcgcagtcg aaactctatc ca 42
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> manC-B-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtttcttta ccagactcga gttactcgtt cagcaacgtc agc 43
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> gmd-fcl-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 7
taataaggag atataccatg gcttcaaaag tcgctctcat cacc 44
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> gmd-fcl-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 8
gccgagctcg aattcggatc cttacccccg aaagcggtc 39
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> wcfB-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 9
taagaaggag atatacatat gttatatgta attttacgtg gacgattagg 50
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> wcfB-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtatatctc cttcttttac atattcttct ttcttttcca 40
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> lacY-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 11
aagaaggaga tataccatgt actatttaaa aaacacaaac ttttgg 46
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> lacY-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtttcttta ccagactcga gttaagcgac ttcattcacc tgacg 45
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> vgb-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 13
ggataacaat tcccctctag atcgattaag gctattatta tcatatgtta gaccagcaaa 60
ccattaaca 69
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> vgb-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 14
gccgagctcg aattcggatc cttattcaac cgcttgagcg tac 43

Claims (5)

1.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将重组质粒pETDuet-vgb-manC-B和pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY共转化到大肠杆菌获得，所述重组质粒pETDuet-vgb-manC-B是将连接有特殊RBS序列的vgb基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-vgb，然后将基因簇manC-B克隆到pETDuet-vgb上获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B，所述重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY是将基因簇gmd-fcl克隆到pCDFDuet-1质粒上获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl，然后将wcfB基因与lacY基因通过RBS序列连接得到wcfB-lacY，再克隆到pCDFDuet-gmd-fcl上获得重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY，所述大肠杆菌菌株为JM109(DE3)菌株，所述特殊RBS序列为TCGATTAAGGCTATTATTATCAT，所述RBS序列为AAGAAGGAGATATACC。
2.权利要求1所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）重组质粒pETDuet-vgb-manC-B的构建：将连接有特殊RBS序列“TCGATTAAGGCTATTATTATCAT”的vgb基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-vgb，然后将基因簇manC-B克隆到pETDuet-vgb上获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B；
2）重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY的构建：PCR获得的gmd-fcl基因簇克隆到pCDFDuet-1质粒，WcfB基因与lacY基因分别被PCR扩增获得并纯化后，再通过重叠PCR方法连接，两基因之间为RBS序列“AAGAAGGAGATATACC”得到wcfB-lacY，最后将wcfB-lacY克隆到pCDFDuet-gmd-fcl质粒的NdeI和XhoI位点即得到重组质粒pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY；
3）重组质粒pETDuet-vgb-manC-B和pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY共转化到大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3）的共转化条件为：将大肠杆菌JM109(DE3) 感受态细胞悬液置于冰上；加入pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY质粒和pETDuet-vgb-manC-B质粒，用移液器轻柔混匀，冰上静置，42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5 min，整个过程不要振荡菌液，加入LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1小时。
4.权利要求1所述的重组菌株在发酵生产2’-FL中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组菌株的发酵培养基为：5~20 g/L葡萄糖，5~20 g/L 蛋白胨，5~20 g/L 酵母粉，1~10 g/L NH4H2PO4，1~10 g/L K2HPO4，1~5 g/L KOH，0.1~0.5 g/L 柠檬酸，1~5 g/L MgSO4·7H2O，0.01~0.05 g/L CaCl2·6H2O，链霉素25~50 mg/L，氨苄青霉素50~100 mg/L。
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