CN117778439A - 一种产林可霉素的基因工程菌及构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产林可霉素的基因工程菌及构建方法与应用，构建步骤为：pIB139‑SLINC_5625载体的制备，将所述pIB139‑SLINC_5625载体转化至甲基化缺陷型大肠杆菌感受态ET12567(pUZ8002)中；通过接合转移实验，将pIB139‑SLINC_5625载体，引入产林可霉素的菌株中，获得一种产林可霉素的基因工程菌。本发明以林可链霉菌SLINC_5625基因为正调控因子，与营养感知和次级代谢密切相关。实验中通过过表达SLINC_5625基因，构建产林可霉素的基因工程菌，以提高林可霉素产量。其发酵产量中林可霉素的产量约为野生型的7.97倍。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及高产林可霉素的基因工程菌及构建方法与应用。
背景技术
林可霉素又称洁霉素，是由林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)生产的林可酰胺类重要的抗生素。林可霉素及其衍生物对于厌氧型革兰氏阳性菌，以及原生动物具有抑制作用，与大多数药用抗生素都不存在交叉抗性，在临床上常用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，如治疗呼吸道、泌尿系统、皮肤及软组织感染，慢性骨髓炎，脑膜炎，中耳炎和眼科疾病等，特别适用于对内酰胺类抗生素有抗性的细菌感染患者。过去几十年的生产实践中，林可霉素工业菌株的获取主要依靠物理或化学方法诱变，不但耗时，且随机性较大。因此，亟需一种产林可霉素的基因工程菌，通过发酵获得林可霉素，以满足工业生产的需求。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种产林可霉素的基因工程菌。
本发明的第二个目的是提供一种产林可霉素的基因工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种产林可霉素的基因工程菌发酵生产林可霉素的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种产林可霉素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)pIB139-SLINC_5625载体的制备：
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnesis NBRC_13054基因组为模板，以SEQ IDNO.2与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为上、下游引物，PCR扩增，得到载体骨架；
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnesis NBRC_13054基因组为模板，以SEQ IDNO.4与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为上、下游引物，PCR扩增，得到SLINC_5625基因的CDS区；
使用US Everbright Inc无缝克隆试剂盒，将插入片段SLINC_5625基因的CDS区连接至载体骨架NdeI和EcoRI位点之间，得到质粒1；
使用US Everbright Inc无缝克隆试剂盒，将质粒1转化至大肠杆菌宿主感受态DH5α中，通过电泳初步验证后，测序，得到pIB139-SLINC_5625载体，进行低温保藏；
2)将所述pIB139-SLINC_5625载体转化至甲基化缺陷型大肠杆菌感受态ET12567(pUZ8002)中，通过接合转移实验，将pIB139-SLINC_5625载体引入产林可霉素的菌株中，获得一种产林可霉素的基因工程菌。
上述构建方法构建的一种产林可霉素的基因工程菌。
上述一种产林可霉素的基因工程菌发酵生产林可霉素的应用。
本发明的优点是：
本发明以林可链霉菌S.lincolnesis SLINC_5625基因为正调控因子，与营养感知和次级代谢密切相关。实验中通过过表达S.lincolnesis SLINC_5625基因，构建产林可霉素的基因工程菌，以提高林可霉素产量。其发酵产量中林可霉素的产量约为野生型的7.97倍。
附图说明
图1是SLINC_5625过表达质粒pIB139-SLINC_5625的构建的示意图。
图2是pIB139-SLINC_5625载体各模块。图中1、2为pIB139；3、4为SLINC_5625。
图3是OSLINC_5625PCR与测序鉴定。其中，图(A)中，1为NBRC_13054；2为pIB139-SLINC_5625plasmid；3为OSLINC_5625。
图4是NBRC_13054与OSLINC_5625发酵的细胞干重。
图5是WT(NBRC_13054)和OSLINC_5625发酵的林可霉素产量随时间的变化情况。
具体实施方案
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
pIB139质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。
林可链霉菌S.lincolnensis NBRC_13054，购自北京百欧博伟生物技术有限公司(https://www.biobw.org/？renqun_youhua＝751092)。
大肠杆菌(Escherichia coli)宿主感受态DH5α，用于质粒保藏；甲基化缺陷型大肠杆菌宿主感受态ET12567(pUZ8002)，用于链霉菌接合转移。二者均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司(http://www.zomanbio.com/)。
1.SLINC_5625基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(资料来源：NCBI官网)。
在本发明的实施例中，所用到的培养基配方如下：
接合转移固体培养基(MS培养基)：甘露醇20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0，使用前加入终浓度为10mM的氯化镁。
产孢子固体培养基：可溶性淀粉15g/L，黄豆饼粉5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，琼脂粉18g/L，pH 7.0。
SMA培养基：黄豆饼粉20g/L，甘露醇20g/L，琼脂20g/L。
无蔗糖YEME培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，麦芽提取物3g/L，葡萄糖10g/L，pH 7.0，使用前加入终浓度为5mM的氯化镁。
含蔗糖YEME培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，麦芽提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖340g/L，pH 7.0，使用前加入终浓度为5mM的氯化镁。
发酵一级培养基的配方为：酵母浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，酸水解酪蛋白5g/L，pH7.0。
发酵二级培养基的配方为：乳糖20g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆10g/L，酸水解酪蛋白5g/L，碳酸钙4g/L，pH 7.0。
实验中，使用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取林可链霉菌基因组，对其进行培养与发酵。
实施例1过表达质粒pIB139-SLINC_5625的构建
采用含有能在链霉菌中组成型表达的强启动子PermE*的质粒pIB139构建SLINC_5625基因过表达质粒。
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnensis NBRC_13054基因组为模板设计引物(表1)，以SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增得到载体骨架；
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnensis NBRC_13054基因组为模板，以SEQID NO.4与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增得到SLINC_5625基因的CDS区；
使用US Everbright Inc无缝克隆试剂盒，将插入片段SLINC_5625基因的CDS区连接至载体骨架NdeI和EcoRI位点之间，得到质粒1；
按照Super Fusion Cloning Mix(2×)5μL，插入片段200ng，载体骨架200ng，ddH2O补齐至10μL的体系配制。
体系配制完成后轻轻吹吸混匀，并置于50℃PCR仪中反应25min。50℃反应结束后瞬时离心将反应液收集至管底，可直接进行转化或者于-20℃冰箱冻存。
表1pIB139-SLINC_5625载体构建与验证引物
使用US Everbright Inc无缝克隆试剂盒，将质粒1转化至大肠杆菌宿主感受态DH5α中。采用琼脂糖凝胶电泳进行PCR后的初步验证2个接口都正确后，以SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9为引物进行PCR扩增，使用北京索莱宝科技有限公司的纯化回收试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物(图2)。选择菌落PCR条带正确且清晰的菌提取质粒进行测序，最终将测序正确的质粒和含有pIB139-SLINC_5625载体的DH5α大肠杆菌，进行低温保藏，pIB139-SLINC_5625载体构建完成，质粒图谱如图1所示。
实施例2重组质粒的转化
1)将pIB139-SLINC_5625载体转化至甲基化缺陷型大肠杆菌感受态ET12567(pUZ8002)中；
2)对野生型林可链霉菌NBRC_13054进行种子培养，用无菌牙签挑取一小块长有林可链霉菌的培养基，接种到25mL的无蔗糖YEME培养基中，于28℃，190rpm培养4d，再以2mL的接种量接于25mL含蔗糖YEME培养基中，28℃，190rpm培养3d，待链霉菌的菌丝体长至较细腻时，5000rpm，4℃离心5min，去上清。用30mL 10％的蔗糖水溶液洗涤菌丝体两次，5000rpm，4℃离心5min，去上清；用30mL 2×YT(pH为7.2)培养基洗涤菌丝体两次，5000rpm，4℃离心5min，去上清；用5mL的2×YT(pH为7.2)重悬菌丝体，之后充分打散菌丝体，备用。
3)将步骤1)获得的大肠杆菌接种到30mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；按1％接种量，接种到30mL LB液体培养基中，37℃，190rpm培养4h，至OD600为0.4-0.6。以8000rpm，离心5min，待离心好后将上清弃掉，收集大肠杆菌菌体，加入30mL LB液体培养基，洗涤两次，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清，加入500μL LB液体培养基，得大肠杆菌悬浮液；
4)将步骤2)获得的林可链霉菌菌丝体悬浮液与步骤3)获得的大肠杆菌悬浮液等体积混合，涂于已吹干的不加抗生素的MS固体平板上，倒置于28℃培养箱中，待20h后，在涂有安普霉素和萘啶酮酸的MS固体平板上，筛选获得转化子，扩增于SMA无抗性板上。
实施例3SLINC_5625过表达菌株的获得
从接合转移成功的平板上中挑取若干长孢子的单菌落提取基因组，设计特异性引物SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.11进行PCR验证(图3)，构建过表达SLINC_5625基因成功的菌和pIB139-SLINC_5625质粒能扩增出相同的长度为1371bp的片段，而野生型(S.lincolnensis NBRC_13054)则不能在相应位置扩增出正确的条带。琼脂糖凝胶电泳验证后将条带正确的片段回收送测序并与质粒pIB139-SLINC_5625比对，以保证菌株构建正确，构建完成的菌命名为OSLINC_5625。
实施例4产林可霉素的基因工程菌(突变菌株)的发酵过程和代谢物的提取与测定
(1)突变菌株和野生菌株的发酵过程与代谢物提取
用无菌细胞刮刀铲取固体培养基上约1-2cm2的新鲜林可链霉菌(突变菌株、野生菌株)菌苔，移入25mL发酵一级培养基中(250mL摇瓶)28℃，220rpm培养2天。按照10％的接种量吸取发酵一级培养基中的菌液转接至25mL发酵二级培养基中(250mL摇瓶)28℃，220rpm培养7天。
(2)代谢产物的HPLC-MS测定
取1mL发酵结束后的发酵液，12000rpm离心10min，上清经0.22μm水系微孔滤膜过滤后，进行HPLC检测。其中，检测条件：色谱柱：C18(SinoChrom ODS-BP，4.6×250mm,5μm，大连依利特分析仪器有限公司)；流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝4：6；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；检测波长：210nm。
(3)干重检测
林可链霉菌发酵过程中呈菌丝状态，且培养基成分中含有不溶性固体，难以使用紫外分光光度计检测菌体生长情况，故以干重作为生物量检测指标，具体步骤为：
1.用精密天平称量干净的4mL EP管质量；
2.摇匀发酵液后取4mL于EP管中，12000rpm离心5min后尽弃上清；
3.用无菌水重悬清洗离心后的菌沉淀，12000rpm离心5min后尽弃上清；
4.将收集菌体沉淀的EP管开盖于电热鼓风干燥箱烘干至质量不再变化时记录数据；
5.用第4步得到的管+菌质量减去第1步得到的空管质量即为4mL林可链霉菌的干重。
(4)测定结果
实验结果表明，SLINC_5625不会影响孢子的产生，OSLINC_5625在发酵的第一天干重最大，而后降低到低于野生菌株WT的水平，见图4。比较林可霉素的产量变化可以直观地发现，无论是发酵过程中还是发酵结束后，过表达SLINC_5625基因则显著增加林可霉素产量。在发酵的最后一天，野生菌株WT(NBRC_13054)产林可霉素为46.63mg/L，OSLINC_5625产林可霉素则可至371.69mg/L，约为野生型的7.97倍，见图5。
Claims (3)
1.一种产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
1)pIB139-SLINC_5625载体的制备：
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnesis NBRC_13054基因组为模板，以SEQ IDNO.2与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为上、下游引物，PCR扩增，得到载体骨架；
以pIB139质粒和林可链霉菌S.lincolnesis NBRC_13054基因组为模板，以SEQ IDNO.4与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为上、下游引物，PCR扩增，得到SLINC_5625基因的CDS区；
使用无缝克隆试剂盒，将插入片段SLINC_5625基因的CDS区连接至载体骨架NdeI和EcoRI位点之间，得到质粒1；
使用无缝克隆试剂盒，将质粒1转化至大肠杆菌宿主感受态DH5α中，通过电泳初步验证后，测序，得到pIB139-SLINC_5625载体，进行低温保藏；
2)将所述pIB139-SLINC_5625载体转化至甲基化缺陷型大肠杆菌感受态ET12567(pUZ8002)中；通过接合转移实验，将pIB139-SLINC_5625载体引入产林可霉素的菌株中，获得一种产林可霉素的基因工程菌。
2.权利要求1的构建方法构建的一种产林可霉素的基因工程菌。
3.权利要求2的一种产林可霉素的基因工程菌发酵生产林可霉素的应用。
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