CN118240897A - 增强膜转运蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强膜转运蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过在游动放线菌SE50/110中分析在不同麦芽糖添加量的培养情况下的比较蛋白组数据，获得随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调的膜转运蛋白ACPL_174，并利用强启动子KasOp*强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，得到阿卡波糖高产突变菌株。增强膜转运蛋白基因的表达，可以提高游动放线菌SE50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中的耐受能力，最终明显提高阿卡波糖产量。与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株发酵产量分别提高了15％，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.15g/L。
Description
技术领域
本发明涉及的是生物工程领域，具体说是涉及一种增强膜转运蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法；基于不同麦芽糖添加情况下游动放线菌SE50/110的比较蛋白组数据，筛选获得随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调的膜转运蛋白ACPL_174，并在游动放线菌SE50/110中强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，可以提高游动放线菌SE50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而可提高阿卡波糖产量。
背景技术
糖尿病是一种代谢性疾病，其突出特点就是高血糖。目前，2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病患者总数的90％以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。
阿卡波糖被列为治疗2型糖尿病的一线用药，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓多糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。单独服用本类药物通常不会发生低血糖等副作用，同时由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。
阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌SE50及其基因工程改造后的高产菌株SE50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌SE50的基因组上成簇分布，组成acb基因簇。在阿卡波糖的发酵生产中，在培养基中麦芽糖添加量低于10g/L时，阿卡波糖无法合成；随着麦芽糖添加量的不断提高，阿卡波糖产量也逐渐提高，当麦芽糖添加量到达50g/L时，阿卡波糖产量达到峰值。在本研究中，通过分析比较蛋白组数据挖掘到膜转运蛋白ACPL_174，强化表达其编码基因，可以提升游动放线菌SE50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而提高阿卡波糖的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强膜转运蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过分析游动放线菌SE50/110在不同浓度麦芽糖添加时的比较蛋白组数据，获得随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调的膜转运蛋白ACPL_174，并在游动放线菌SE50/110中强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，提升了游动放线菌SE50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而提高阿卡波糖的产量。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中强化表达膜转运蛋白的编码基因，获得阿卡波糖高产菌株；所述膜转运蛋白随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调，且与维持菌体渗透压稳态相关。该菌株发酵得阿卡波糖。
作为本发明的一个实施方案，所述膜转运蛋白是基于不同麦芽糖添加情况下游动放线菌的比较蛋白组数据，筛选获得随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调的膜转运蛋白，该膜转运蛋白与维持菌体渗透压稳态相关。
作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌选自游动放线菌SE50、游动放线菌SE50/110。本发明在游动放线菌中强化表达游动放线菌SE50/110膜转运蛋白基因，获得阿卡波糖高产菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述膜转运蛋白为膜转运蛋白ACPL_174。
作为本发明的一个实施方案，所述膜转运蛋白的编码基因为膜转运蛋白基因ACPL_174，其序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌SE50/110中强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，包括如下步骤：
S1，设计并构建用于强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174的整合型质粒I；
S2，通过接合转移将整合型质粒I导入受体菌株中，然后对突变株进行壮观霉素抗性验证，并提取基因组DNA通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因强化表达突变株。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从游动放线菌SE50/110基因组DNA中获取(1053bp的)ACPL_174基因片段，从pLQ648质粒中获取(126bp的)强启动子kasOp*基因片段；在质粒pLR4的BamHI/EcoRI位点插入所述kasOp*基因片段和ACPL_174基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_174-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_174基因。
作为本发明的一个实施方案，使用kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因。
作为本发明的一个实施方案，受体菌株为游动放线菌SE50/110，所述基因强化表达突变株记为基因强化表达突变株QSH-2。
作为本发明的一个实施方案，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养90～96小时后收取发酵液。作为具体示例，将空载体整合菌株与基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养32小时；按照10％的接种量转接至二级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养24小时；按照15％的接种量转接至发酵培养基中于30℃、220rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为3％～5％的蔗糖、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.5％～1％的酪蛋白水解物、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化钾和0.005％～0.01％的硫酸亚铁。作为具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁。
作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％～2％的葡萄糖、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的麦芽提取物、1％～2％的甘油、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.1％～0.2％的磷酸氢二钾和0.1％～0.2％的酪蛋白水解物。作为具体示例，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物。
作为本发明的一个实施方案，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％～5％的黄豆饼粉、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的葡萄糖、1％～2％的甘油、1％～2％的可溶性淀粉和0.25％～0.5％的碳酸钙。作为具体示例，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％的黄豆饼粉、1.5％的麦芽糖、1％的葡萄糖、1％的甘油、1％的可溶性淀粉和0.25％的碳酸钙。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基含有质量体积比为5％～10％的麦芽糖、1％～5％的葡萄糖、0.1％～0.5％的谷氨酸、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化铁、1％～5％的黄豆饼粉和0.1％～0.5％的碳酸钙。作为具体示例，所述发酵培养基含有质量体积比为5％的麦芽糖、3％的葡萄糖、0.3％的谷氨酸、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化铁、1％的黄豆饼粉和0.25％的碳酸钙。
本发明还涉及一株阿卡波糖高产菌株，是在游动放线菌中强化表达序列如SEQIDNO.1所示的膜转运蛋白基因ACPL_174，获得所述阿卡波糖高产菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌选自游动放线菌SE50、游动放线菌SE50/110。
本发明具有如下有益效果：
1)通过在游动放线菌SE50/110中强化表达该基因，提升了游动放线菌SE50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而提高阿卡波糖的产量；
2)本发明中通过在游动放线菌SE50/110中强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，得到阿卡波糖高产菌株；与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株(QSH-2)，发酵产量提高了15％，实验室摇瓶发酵水平达到3.15g/L。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为强化表达基因ACPL_174的质粒构建示意图；
图2为膜转运蛋白基因强化表达突变株与空载体整合菌株阿卡波糖发酵产量示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pLR4已经在SCI数据库文献《Koksharov MI,UgarovaNN.Thermostabilization of firefly luciferase by in vivo directedevolution.Protein Eng Des Sel.,24,835-44.》中公开。
本发明所涉及的质粒pLQ648已经在SCI数据库文献《Huang,Q.,Zhang,X.,Guo,Z.,Fu,X.,Zhao,Y.,Kang,Q.,and Bai,L.Biosynthesis of ansamitocin P-3incurs stresson the producing strain Actinosynnema pretiosum at multipletargets.Communications Biology,2023,6》中公开。
本发明所涉及菌株游动放线菌SE50/110已经在SCI数据库文献《Zhao QQ,Xie HX,Peng Y,Wang XR,Bai LQ.Improving acarbose production and eliminating the by-product component C with an efficient genetic manipulation system ofActinoplanes sp.SE50/110.Synthetic and Systems Biotechnology,2017,2(4):302-309》中公开。
实施例
本实施例为获取膜转运蛋白基因ACPL_174强化表达突变株QSH-2的具体过程。具体操作步骤如下：
步骤一：质粒pLQ2353的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA(Genome assembly:ASM23714v1；NCBIRefSeq assembly:GCF_000237145.1；GenBank assembly：GCA_000237145.1)为模板，使用引物GBACPL_174-F/R，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取1053bp的ACPL_174基因片段以及pLQ648质粒中获取126bp的强启动子kasOp*基因片段，在质粒pLR4的BamHI/EcoRI位点插入126bp的kasOp*基因片段和1053bp的ACPL_174基因片段。在37℃水浴条件下，采用BamHI和EcoRI两种限制性内切酶进行酶切处理，可以观察到1179bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
图1示意了在pLR4中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_174的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ2353转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567(pUZ8002,pLQ2353)于含有30μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株SE50/110的新鲜菌丝体(吸取1mL在一级种子培养基中经28℃～30℃、180～220rpm转速培养30～36小时的新鲜菌丝体，本实施例中具体条件为28℃、220rpm转速培养30小时)，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567(pUZ8002,pLQ2353)分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取30mg/mL壮观霉素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中继续培养。一般5～7天后可见平板上有单菌落接合子长出。将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GB-ACPL_174-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株QSH-2。
上述步骤一中所用到的引物序列如表1所示：
表1
步骤二：膜转运蛋白基因ACPL_174强化表达突变株QSH-2的发酵
将扩大培养并验证后的突变株QSH-2菌丝体转化至新鲜固体培养基中，30℃培养箱中培养72小时后，用菌种环划取满环的菌丝体(直径为10cm的平板，划取约为其面积1/4)，接种在一级种子培养基中于30℃，220rpm培养32小时。随后按10％的接种量，取4mL经一级种子培养后的菌丝体转接至二级种子培养基中于30℃，220rpm的转速下培养24小时。按照15％的接种量取7.5mL经二级种子培养后的菌丝体转接至发酵培养基中于30℃，220rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。取1mL摇匀后发酵液至EP管中，12,000rpm离心10min，吸取上清至新的EP管中。取100μL上清，用三氯甲烷稀释5倍后剧烈混匀，随后12,000rpm离心10min，将离心所得的上清通过0.22μm有机相滤膜过滤，进行HPLC检测。
其中，固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁。
一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物。
二级种子培养基含有质量体积比为4％的黄豆饼粉、1.5％的麦芽糖、1％的葡萄糖、1％的甘油、1％的可溶性淀粉和0.25％的碳酸钙。
发酵培养基含有质量体积比为5％的麦芽糖、3％的葡萄糖、0.3％的谷氨酸、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化铁、1％的黄豆饼粉和0.25％的碳酸钙。
步骤三，利用HPLC检测阿卡波糖的发酵产量
使用Agilent公司的ZORBAX NH2柱进行色谱分析，采用DAD紫外检测器测定210nm下的色谱吸收峰，流动相流速为1mL/min；流动相A：35％磷酸盐，流动相B：65％乙腈。柱温：室温。
图2为强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174阿卡波糖发酵水平检测结果。结果表明强化表达这些基因之后，阿卡波糖的发酵水平有明显的提高，和空载体整合菌株相比，阿卡波糖的发酵产量提高约15％，实验室摇瓶发酵水平达到3.15g/L。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中强化表达膜转运蛋白的编码基因，获得阿卡波糖高产菌株；所述膜转运蛋白随着麦芽糖浓度提升而表达水平上调，且与维持菌体渗透压稳态相关。
2.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述游动放线菌选自游动放线菌SE50、游动放线菌SE50/110。
3.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述膜转运蛋白为膜转运蛋白ACPL_174；所述基因为序列如SEQ ID NO.1所示的膜转运蛋白基因ACPL_174。
4.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌SE50/110中强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174，包括如下步骤：
S1，设计并构建用于强化表达膜转运蛋白基因ACPL_174的整合型质粒I；
S2，通过接合转移将整合型质粒I导入受体菌株中，然后对突变株进行壮观霉素抗性验证，并提取基因组DNA通过PCR扩增产物片段大小的差异，筛选得到基因强化表达突变株。
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从游动放线菌SE50/110基因组DNA中获取ACPL_174基因片段，从pLQ648质粒中获取强启动子kasOp*基因片段；在质粒pLR4的BamHI/EcoRI位点插入所述kasOp*基因片段和ACPL_174基因片段。
6.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，使用序列如SEQID NO.2、3所示的引物GBACPL_174-F/R，PCR扩增得到ACPL_174基因。
7.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，使用序列如SEQID NO.4、5所示的引物kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因。
8.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：将基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养90～96小时后收取发酵液。
9.一株阿卡波糖高产菌株，其特征在于，在游动放线菌中强化表达序列如SEQ IDNO.1所示的膜转运蛋白基因ACPL_174，获得所述阿卡波糖高产菌株。
10.根据权利要求9所述的阿卡波糖高产菌株，其特征在于，所述游动放线菌选自游动放线菌SE50、游动放线菌SE50/110。
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