CN117363552B - 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents
生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。所述基因工程菌株于2023年8月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Streptomyces sp. F607‑KD，保藏编号为CCTCC NO：M 20231400，保藏地址为中国武汉。其构建方法为：将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶sgnK、C4，5环氧酶sgnD以及红霉素强启动子ermE*导入褐黄孢链霉菌，获得了褐黄孢链霉菌基因工程菌。本发明通过在褐黄孢链霉菌基因工程菌中有效表达纳他霉素生物合成过程中的调控基因，能够提高褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的效率，提高纳他霉素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
纳他霉素是由链霉菌受控发酵制得一种白色至乳白色的无臭无味的结晶粉末，是一种天然、广谱、高效的抗真菌剂。纳他霉素在低剂量时就能高效的抑制霉菌和酵母的生长，并且对哺乳动物细胞的毒性极低，能够在不影响食品口味和外观的同时增加食品保质期，而且具有安全、不致癌等优点，因此在食品领域被广泛应用；同时，纳他霉素具有口服低毒、不致敏等优良性质，故其在医药领域的应用也越来越多。据报道，纳他霉素除了在食品和医药方面的应用，还能应用于畜牧、家禽养殖及农业等领域。1982年纳他霉素被美国FDA正式批准为食品防腐剂，1997年我国正式批准纳他霉素为食品防腐剂，目前纳他霉素已经在50多个国家被广泛应用。
随着纳他霉素在医药及食品等领域的不断开发，其需求量不断增加。但目前纳他霉素发酵水平较低、生产成本较高，限制了其进一步的开发和应用。因此急需要一种生产菌株来解决此问题，对纳他霉素基因簇相关基因进行改造是获得纳他霉素生产菌株最直接的方式。
中国专利CN 114672508 A公开了一种纳他霉素生产菌株的构建方法，通过在原始菌株中引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因或者同时引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因，实现工程菌株的构建，提高纳他霉素的产量。
中国专利CN 114941006 A公开了褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用，通过克隆褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中的启动子以及来自大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A羧化酶基因，成功构建了表达载体；通过带有表达载体的大肠杆菌与褐黄孢链霉菌的结合转移实验获得了褐黄孢链霉菌工程菌株，提高纳他霉素的生物合成产量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法，通过在褐黄孢链霉菌基因工程菌中有效表达纳他霉素生物合成过程中的调控基因，提高褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的效率，从而提高纳他霉素的产量。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，该褐黄孢链霉菌基因工程菌株于2023年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Streptomyces sp. F607-KD，保藏编号为CCTCC NO：M 20231400，保藏地址为中国武汉。
所述褐黄孢链霉菌基因工程菌株是通过将纳他霉素生物合成过程中的调控基因导入褐黄孢链霉菌获得的，所述调控基因由糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD以及红霉素强启动子ermE*组成。
进一步的，所述糖基转移酶基因sgnK与C4，5环氧酶基因sgnD中间以刚性连接肽基因相连，共用一个红霉素强启动子ermE*进行共表达。
进一步的，所述糖基转移酶基因sgnK核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，C4，5环氧酶基因sgnD核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，红霉素强启动子ermE*核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的构建方法：包括如下步骤：
（1）重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的构建：将糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD中间以刚性连接肽基因相连，然后再与红霉素强启动子ermE*一起插入pSET152载体质粒的多克隆位点处，得到重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D；
（2）含重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002的制备：将步骤（1）中得到的重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D导入大肠杆菌DH5α中，对得到的转化子进行测序验证，然后将测序正确的载体质粒导入到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，得到含重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002；
（3）生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的制备：将步骤（2）中得到的含有重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，通过结合转移的方法转入到褐黄孢链霉菌中，得到生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株。
纳他霉素作为链霉菌代谢途径中的次级代谢产物，在生长发酵的过程中涉及到大量的基因，sgnK、sgnD是纳他霉素合成基因簇中的重要调控基因，sgnK基因编码的糖基转移酶负责海藻氨基糖与内酯环骨架结构的缩合，sgnD基因编码的C4，5环氧酶将纳他霉素骨架上C4、C5上的双键催化形成环氧。本发明通过在褐黄孢链霉菌中有效表达纳他霉素生物合成过程的调控基因糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD，可以增加生物合成过程中调控基因的拷贝数，提高纳他霉素产量。
本发明另提供一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株在制备纳他霉素中的应用：包括如下步骤：
（1）种子液培养：将褐黄孢链霉菌基因工程菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm恒温摇床培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液；
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中褐黄孢链霉菌基因工程菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。
进一步的，所述种子培养基中葡萄糖含量为0.6-1.4%，蛋白胨含量为0.2-1%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。
进一步的，所述发酵培养基中葡萄糖含量为5-9%，蛋白胨含量为0.5-3.5%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过在褐黄孢链霉菌中有效表达纳他霉素生物合成过程的调控基因糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD，可以增加生物合成过程中调控基因的拷贝数，提高纳他霉素产量。同时使用红霉素启动子ermE*作为强启动子，可以进行调控基因的表达，并且不会影响纳他霉素的生成。
2、通过基因工程、代谢工程的技术手段对出发菌进行改造，提高了菌株的生产能力，而且无需改变原有的发酵生产工艺。
3、通过增加调控基因糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD的拷贝数，使得褐黄孢链霉菌基因工程菌的纳他霉素产量提高了40%以上。从而在生产过程中，消耗同等营养物质的同时产生更多的纳他霉素，能够降低生产成本。
4、调控基因糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD中间以刚性连接肽基因相连，共用一个红霉素强启动子ermE*进行共表达，保持了不同酶的生物活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株
一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，该褐黄孢链霉菌基因工程菌株于2023年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Streptomyces sp. F607-KD，保藏编号为CCTCC NO：M 20231400 ，保藏地址为中国武汉。
所述基因工程菌株是将纳他霉素生物合成过程中的调控基因导入褐黄孢链霉菌获得的，所述调控基因由糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD以及红霉素强启动子ermE*组成。
所述糖基转移酶基因sgnK核苷酸序列为SEQ ID NO.1，如下所示：
atggaatccgcccgacggccgatcctcttcgtcagccttccggagagcggcctgctcaatccgctgctcgtgctggcgggtgaactctcccgccagggcgtggaggacctctggttcgccaccgacgagccgcgccgcaacgatgtgaaacggatcgcggagggctcccctgtggagttcgcctcgctgggcgaagtcgactccgaaatgtcggccgtgacgtggagcgacgaggtctaccgcgaggtcacgcagccttcgcgcttcaaggcgcaccgcgcggtcgtcaggcacacctaccggcccggcctccaggcggagaagttccgccgtctccaagccgtcatcgacgaggtccaaccggcgctgatggtcatcgactgcatcagcggcttcgcggtcgacgcggccatcgcccggaacatcccgtacgtactgagcgtgccgttcctgccgagcaatgtgctgacggcgcatacgcacttcgcgaaaagctacaccccgcggggcttcccggtcccgcacacgggtctgtcgcggcggatgacgctcgcgcagcgcgtcgccaacgagctgttcaagctgcggaccttcgcgatgttcctcaaccctcggctgggcaaggtcctcgcggaggacaaccggcgacgcaatgaactcgggctgccgaaggccagtttcatggccaggatcgagcacgccgatctggtgctgtgcaactccctcgccgagctggactaccccttcgacatcccggaaaagatgcggctggtgggtgccatggtgccgccgctgcccgaggcgccggacgaccaggatctctcgcggtggctggacgcccagtcctccgtggtctacgtggggctcgggacgatcacccgcctgacgcgggagcaggtcggctccatggtggaggtggcccgtcggctggaggaccggcaccaggtgctgtggaagctgccctcggaacagcagcacctgctgccgccccgggagtcgctgccgggcaacctccgtgtcgagagctgggttccctcgcagatggacgtgctggcccatccgcatgtgaaggtgttcttcacccacggcggcggcaacggcttcaacgagggcatgtacttcggcaagccgctcgtggtgcgaccgctgtgggtggactgctacgaccaggccgtccgcggccaggacttcggcctcagcctgaccctcgaccggccgcagaccatcgacgtcaacgacgtcgtcgacaagctcacgagggttctcggcaccccgtccttctatgagaaggcggagcggcgggccgccctgatgcgctcggcgggcgggcgggagaccgccgccggcctggttctctcgctcccggccctggcgtaa
C4，5环氧酶基因sgnD核苷酸序列为SEQ ID NO.2，如下所示：
Atgaccgccgcctcccacgacctgccctgcctcaacctcgaaccgcccaaaatgctgaaactgagcccgctgctgcgcgccttgcaggaccgggggccgatccaccgggtgcgcacacccgccggggacgaggcgtggctggtgacccgccacgccgagctcaagcagctgctgcacgacgagcgcatcggccgcacgcaccccgacccgccctccgccgcccagtacgtacgcagccccttcctggacctgctgatcagcgacgccgacgccgagtccgggcgtcggcagcacgccgagacccgccgcctgctcactccgttgttctcggcccggcgcgttctggaaatgcagccgaaggtggaggaggccgcggacaccctgctggacgcgttcatcgcccaggggcctcccggcgacctgcacggcgagctcaccgtgccgttcgccctcacggtcctctgcgaggtcatcggcgtgccgccgcagcgccgcgcggagctgaccacactgctggccggtatcgccaagctggacgaccgcgagggcgccgtacgggcacaggacgacctgttcgggtacgtggcagggctggtcgagcacaagcgggccgagcccggcccagacatcatctcccggctgaacgacggcgagctgaccgaggaccgcgtggcacacctggccatgggcctgctgttcgccgggctggacagcgtcgcgagcatcatggacaacggggtggtgctgctggccgcccaccccgatcagcgcgcggcggcgctggccgaccccgacgtgatggcgcgtgccgtggaggaggtgctgcggaccgcccgggccggcgggtcggtcctgccgccgcgctacgccagcgaggacatggaattcggcggggtgacgatacgggccggagacctggtcctgttcgacctcggcctgcccaacttcgacgagcgggcgttcacagggccggaggaattcgacgccgccaggacccccaatccccatctgaccttcggccacggcatctggcactgcatcggcgcccccctcgcgcgcctggaactcaggacgatgttcaccaagctgttcacccgcctgccggaactgcgcccggaacttccggtggagcaactgcgcctgaaggagggccagctgtcgggcggcttcgccgagctccgggtggtctggtag
红霉素强启动子ermE*核苷酸序列为SEQ ID NO.3，如下所示：
ttaaaggctccttttggagcctttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaactcctttagttgttcctttctattctcactccgctgaaactgttgaaagttgtttagcaaaacctcatacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgacaaaactttagaactagaagcccgacccgagcacgcgccggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaaggggacgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggta
实施例2生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的构建
1.重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D构建
（1）从NCBI 上找到褐黄孢链霉菌的全基因组序列，以褐黄孢链霉菌的全基因组序列为模板，设计并合成针对纳他霉素生物合成基因簇中两个调控基因sgnK和sgnD的上下游引物，从模板中扩增出sgnK的片段大小1377bp左右，sgnD的片段大小1194bp左右，经测序分析正确，与目的片段相符，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，胶回收纯化后备用。
（2）以红霉素强启动子ermE*为模板，设计并合成其上下游引物，从模板中扩增出ermE*的片段大小450bp左右，经测序分析正确，与目的片段相符，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，胶回收纯化后备用。
（3）经过对载体pSET152序列和插入片段序列的分析，选择同源重组的方式将插入片段与载体进行连接。为了提高载体的浓度，选择PCR扩增线性化的方式对载体质粒进行反向PCR扩增。根据克隆位点上游载体序列、克隆位点下游载体序列以及插入片段完整序列设计并合成引物。扩增出线性化载体pSET152的片段大小5691bp左右，胶回收纯化后备用。
（4）用同源重组试剂盒对插入片段与载体质粒进行连接，根据说明书计算线性化载体质粒pSET152与插入片段的摩尔比，吹打混匀后，37℃反应30min，得到重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D。
2. 含重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002的制备
（1）取一支大肠杆菌DH5α感受态细胞放于培养基中，冰上解冻，加入5ul浓度为200ng/ul的重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入500ul的无抗LB液体培养液，37℃、180rpm培养1h。涂布于含有50ng/ul安普霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养16h，至长出含有重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌DH5α的单菌落。挑取生长良好的单菌落进行扩大培养，用M13的通用引物进行菌液PCR验证，送第三方测序公司进行测序并进行序列比对，提取验证正确的重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D。
（2）取一支大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞放于培养基中，冰上解冻，加入5ul浓度为200ng/ul的验证正确的重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入500ul的无抗LB液体培养液，37℃、180rpm培养1h。涂布于含有25ng/ul卡那霉素、25ng/ul氯霉素、50ng/ul安普霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养16h，至长出含有重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002的单菌落。挑取生长良好的单菌落进行扩大培养，用M13的通用引物进行菌液PCR验证。
（3）将已导入重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002接种于含有25ng/ul卡那霉素、25ng/ul氯霉素、50ng/ul安普霉素的5ml的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养16h。转至新鲜的含有25ng/ul卡那霉素、25ng/ul氯霉素、50ng/ul安普霉素的20 ml的LB液体培养基中，37℃、180 rpm培养至OD600=0.4-0.6。转移到无菌的50 ml离心管中，4000rpm、4℃，离心5min，弃上清。用10ml的无抗LB液体培养基洗涤2次，洗去抗生素，重悬于250ul的LB液体培养基中备用。
3.生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的制备
（1）将出发菌株褐黄孢链霉菌接种到NT液体培养基中，29℃、220rpm培养至OD600=2.0。稀释5倍，涂100ul到无抗NT固体培养基，29℃培养60-72h。刮取孢子于装有10ml 20%甘油的250ml无菌摇瓶中，29℃、220rpm用玻璃珠打散孢子。取含大约108个孢子的孢子悬液，4000rpm离心5min，吸去上清，用5ml的0.05M、pH 8.0的TES溶液重悬，并转移到一支无菌的50ml离心管中。将离心管放入50℃水浴中热击10min，然后用流动的自来水冷却至室温。向管中加入5ml的 2×孢子预萌发培养基，然后将离心管放入29℃摇床中，200rpm培养3h。培养好后4000rpm离心10min，去上清，然后向管中加入250ul无抗生素的LB培养基悬浮孢子备用。
（2）取250ul大肠杆菌ET12567/PUZ8002菌悬液和250ul孢子悬液混合，29℃放置2min，涂布于MS平板上，在超净台中吹干至无水渍，然后将平板倒置于29℃培养箱中培养20h。取1ml无菌水，加入适量萘啶酮酸和安普霉素混合，然后均匀覆盖于平板表面，在超净台中吹干至无水渍，将平板倒置于29℃培养箱中培养，3-4d可见白色接合子单菌落。待接合子长出后继续培养2d挑取单菌落扩大培养，提取基因组用M13的通用引物进行PCR验证，送第三方测序公司进行测序并进行序列比对，与预期结果吻合的即为正确的阳性转化子。
实施例3生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株在制备纳他霉素中的应用
实验组1
（1）种子液培养：将生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为0.6%，蛋白胨含量为0.2%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为5%，蛋白胨含量为0.5%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
实验组2
（1）种子液培养：将生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为1%，蛋白胨含量为0.6%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为7%，蛋白胨含量为2%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
实验组3
（1）种子液培养：将生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为1.4%，蛋白胨含量为1%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为9%，蛋白胨含量为3.5%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
对照组1
（1）种子液培养：将普通的褐黄孢链霉菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为0.6%，蛋白胨含量为0.2%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中褐黄孢链霉菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为5%，蛋白胨含量为0.5%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
对照组2
（1）种子液培养：将普通的褐黄孢链霉菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为1%，蛋白胨含量为0.6%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中褐黄孢链霉菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为7%，蛋白胨含量为2%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
对照组3
（1）种子液培养：将普通的褐黄孢链霉菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液。所述种子培养基中葡萄糖含量为1.4%，蛋白胨含量为1%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中褐黄孢链霉菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。所述发酵培养基中葡萄糖含量为9%，蛋白胨含量为3.5%，pH为7.1，115 ℃灭菌30 min。得到的纳他霉素产量见表1。
表1. 纳他霉素产量对照表
从表1可知，实验组1、实验组2、实验组3的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌经培养后纳他霉素的产量分别为12g/L、14g/L、15g/L，对照组1、对照组2、对照组3的普通褐黄孢链霉菌经相同条件培养后纳他霉素的产量分别为8.5g/L、10g/L、10.6g/L。与普通的褐黄孢链霉菌相比，生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌的纳他霉素产量提高，提高了40%左右。说明本发明通过将纳他霉素生物合成过程中的调控基因导入褐黄孢链霉菌，可以使褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的效率更高，提高纳他霉素的产量，从而在生产过程中，消耗等同营养物质的同时产生更多的纳他霉素，降低了生产成本。
上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，其特征在于：该褐黄孢链霉菌基因工程菌株于2023年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Streptomycessp. F607-KD，保藏编号为CCTCC NO：M 20231400 ，保藏地址为中国武汉。
2.根据权利要求1所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株是将纳他霉素生物合成过程中的调控基因导入褐黄孢链霉菌获得的，所述调控基因由糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD以及红霉素强启动子ermE*组成。
3.根据权利要求2所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，其特征在于：所述糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD中间以刚性连接肽基因相连，共用一个红霉素强启动子ermE*。
4.根据权利要求2或3所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株，其特征在于：所述糖基转移酶基因sgnK核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，C4，5环氧酶基因sgnD核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，红霉素强启动子ermE*核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
5.一种权利要求1所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的构建：将糖基转移酶基因sgnK、C4，5环氧酶基因sgnD中间以刚性连接肽基因相连，与红霉素强启动子ermE*插入pSET152载体质粒的多克隆位点处，得到重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D；
（2）含重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002的制备：将步骤（1）中得到的重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D导入大肠杆菌DH5α，对得到的转化子进行测序验证，然后将测序正确的重组质粒导入到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，得到含有重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002；
（3）生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株的制备：将步骤（2）中得到的含有重组质粒pSET152-ermE*-sgnK-D的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，通过结合转移的方法转入到褐黄孢链霉菌中，得到生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株。
6.一种权利要求1所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株在制备纳他霉素中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
（1）种子液培养：将生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株接种至种子培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm恒温摇床培养16-24h，生长至OD600=1.5-2.0，获得种子液；
（2）发酵培养基培养：将步骤（1）中生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株种子液以体积浓度2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度为29℃、转速为220rpm发酵培养110-120h，获得含有纳他霉素的发酵液，将发酵液分离纯化，获得纳他霉素。
7.根据权利要求6所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株在制备纳他霉素中的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述种子培养基中葡萄糖含量为0.6-1.4%，蛋白胨含量为0.2-1%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
8.根据权利要求6所述的生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株在制备纳他霉素中的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养基中葡萄糖含量为5-9%，蛋白胨含量为0.5-3.5%，pH为7.1，115℃灭菌30 min。
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