CN114231474B

CN114231474B - 一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

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Publication number: CN114231474B
Application number: CN202110597039.6A
Authority: CN
Inventors: 谭之磊; 唐昆鹏; 贾士儒; 侯颖; 周东浩; 董天宇; 许倍铭; 刘洋
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN114231474A

Abstract

本发明公开一种基因工程高产ε‑聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。本发明方法通过过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，经过实验证实，该基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST(CGMCC No.3145)生产ε‑聚赖氨酸的能力提高了17.96％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

Description

一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine)和γ-聚谷氨酸是目前发现两种天然多聚氨酸。自1977年日本学者发现首株生产ε-聚赖氨酸菌株白色链霉菌(S.albulus)以来，后从土壤中筛选出多株具有生产ε-聚赖氨酸的菌株，其中大部分菌株属于链霉菌属(Streptomyces)和北里孢菌属(Kitasatospora)。ε-聚赖氨酸由25-35个赖氨酸的ε-氨基和α-羧基通过酰胺键连接而成。因其抑菌图谱广、水溶性好、热稳定性强，目前被广泛应用为食品防腐剂，还可用作化妆品、基因载体、药物包被物等。如：ε-聚赖氨酸为多阳离子聚合物，可与带电质粒利用静电吸附作用而形成基因复合物，可有效避免核酸酶降解；ε-聚赖氨酸和氨甲蝶呤形成复合物，在可以有效治疗白血病和恶性肿瘤的同时，并提高靶细胞对于氨甲蝶呤的吸收。目前于食品、医药、材料等领域均有极大的发展前景。

由于ε-聚赖氨酸有着优良的品质和良好的市场前景，关于提高ε-聚赖氨酸产量研究一直在开展。早期为提高ε-聚赖氨酸产量多从发酵工艺优化和诱变育种等方面出发。如2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量；1988年日本Chisso公司以S.albulusNo.346为出发菌株，经NTG和S-AEC为抗性筛选标记，获得一株较出发菌株产量提高3.3倍；而国内研究人员如李双双，吴振强等人就曾以白色链霉菌为初始菌株进行紫外和DES复合诱变，成功获得一株突变菌产量达到0.73g/L，比初始菌株提高2.2倍。而基于构建工程菌株提高ε-聚赖氨酸产量的方法则相对较少，尤其是通过过表达TCA循环关键酶苹果酸脱氢酶(Mdh)的方法未发现相关报道。

通过检索，发现如下与本发明专利申请相关的公开文献：

1.一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373 B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，较出发菌株有着更高的ε-聚赖氨酸合成能力。虽然工程菌的ε-聚赖氨酸合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了对于氮源等菌体生长物质的利用率，并无进一步提高代谢途径强度，因此小白链霉菌ε-PL产量仍有提升空间。

2.一株小白链霉菌基因工程菌株及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用(CN111454873A)，公开了一株基因工程菌小白链霉菌(Streptomyces albulus)Q-PL2，它是将源于S.albulus Q-PL的聚赖氨酸合成酶(Pls)基因进行过表达处理，较出发菌株小白链霉菌野生菌Q-PL产量提高2-5倍，虽然ε-聚赖氨酸的生产能力有所提高，但该工程菌株主要强化单一代谢途径，而非多条代谢通路的提高，ε-PL的生产能力仍然有待提高。

3.一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法，(CN 110804572A)公布了一株小白链霉菌(Streptomyces albulus)GS-114，它是通过对其小白链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18进行3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素抗性筛选而产生基因重排。较出发菌株S.albulus GS-114的ε-聚赖氨酸摇瓶产量由1.72±0.08g/L提升到2.8±0.12g/L，ε-聚赖氨酸的生产能力有所提高，但基于基因重排手段获得高产菌株存在工作量大，盲目性强的特点。

4.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方(CN111471633 A)公布了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CATF，它是将源于S.diastatochromogenes TUST的述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(catF)进行过表达处理较出发菌株ε-聚赖氨酸生产能力提高27.91％。表明了该基因对ε-聚赖氨酸生产能力提高具有重要作用。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomycesdiastatochromogenes MDH)，过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。

一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-MDH，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25μg/mL卡那霉素、50μg/mL安普霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆，得到基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH。

进一步地，所述步骤⑵中淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

进一步地，所述步骤⑵中每1LM3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄10 g/L，KH₂PO₄1.36 g/L，K₂HPO₄0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；

或者，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH7.7；

或者，所述步骤⑶中每1L SFM培养基的组成为：

黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4；

其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：

加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。

进一步地，所述步骤⑴中重组质粒pIMEP-MDH为苹果酸脱氢酶Mdh，重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

目的片段基因的获得：根据Mdh基因设计引物序列MDH-F/MDH-R，采用单酶切同源重组的策略构建重组载体；在基因Mdh两端均加入BamHΙ的酶切位点，其中在Mdh基因核苷酸序列的上游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamHΙ上游相同核苷酸，形成上游同源臂，在MDH核苷酸序列的下游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamHΙ下游相同核苷酸，形成下游同源臂，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的Mdh基因；

所述引物MDH-F/MDH-R的序列为：

MDH-F：SEQ No.2；

MDH-R：SEQ No.3；

所述Mdh的序列为SEQ No.1；

重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

用BamHΙ单酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的带有同源臂Mdh基因片段与BamHΙ单酶切的线性质粒pIMEP质粒利用同源重组酶进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-MDH，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，即得重组质粒pIMEP-MDH。

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh重组质粒pIMEP-MDH，并将重组质粒pIMEP-MDH转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平。

进一步地，所述淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

进一步地，所述发酵的生产方法如下：

采用的菌株为过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生灰色分生孢子；

然后，将孢子接种至含葡萄糖的M3G培养基摇瓶中，在30℃，180rpm，培养30h，将培养好的种子培养液转接到含葡萄糖的M3G培养基中进行发酵96h即获得含ε-聚赖氨酸发酵液。

进一步地，每1L含葡萄糖的M3G培养基的组成为：(NH₄)₂SO₄10 g/L，KH₂PO41.36 g/L，K₂HPO₄0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL，并加入100mL10×葡萄糖母液；

10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL 20g/LZnSO₄·7H₂O和2ml 10g/LMgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。

本发明取得的优点和积极效果为：

1.本发明方法通过过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，经过实验证实，该基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST(CGMCC No.3145)生产ε-聚赖氨酸的能力提高了17.96％，为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

2.本发明方法通过构建过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)提供了一种提高ε-聚赖氨酸发酵水平的策略。

3.本发明通过过表达表达苹果酸脱氢酶基因Mdh构建基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)发现TCA循环中关键酶和二氨基庚二酸途径前底物对链霉菌生产ε-聚赖氨酸有重要影响。

附图说明

图1为本发明中以pIMEP为基础构建pIMEP-MDH重组质粒的构建示意图；

图2为本发明中从出发菌株淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)基因组中扩增带有同源臂的苹果酸脱氢酶Mdh基因PCR验证图；其中，泳道M：5kb marker；泳道1：带同源臂Mdh基因全长验证；

图3为本发明中构建pIMEP-MDH重组质粒阳性转化子菌落PCR的结果验证图；其中，泳道M：5kb marker；泳道12：阴性转化子菌落PCR验证；泳道13，15，16：阳性转化子菌落PCR验证，阳性转化子与阴性转化子相比多Mdh基因全长990bp；

图4为本发明中构建pIMEP-MDH重组质粒阳性转化子质粒提取的酶切验证图；其中，泳道M：10kb marker；泳道1：pIMEP-MDH重组质粒的酶切结果；

图5为本发明中初步筛选获得基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌MDH阳性转化子提基因组，用质粒pIMEP-MDH上引物验证结合转移是否成功的验证图；其中，泳道M：2kbmarker；泳道1：验证MDH基因工程菌株中整合的Mdh基因；泳道2:对照TUST中无相应基因；

图6为本发明中菌株在96h的摇瓶发酵聚赖氨酸产量图；其中，TUST为出发菌株Streptomyces diastatochromogenes TUST，MDH为基因工程菌株Streptomycesdiastatochromogenes MDH菌株。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

较优地，所述步骤⑵中淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

较优地，所述步骤⑵中每1LM3G培养基组成为：

或者，每1L贝纳特培养基的组成为：

或者，所述步骤⑶中每1L SFM培养基的组成为：

其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：

加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。

较优地，所述步骤⑴中重组质粒pIMEP-MDH为苹果酸脱氢酶Mdh，重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

所述引物MDH-F/MDH-R的序列为：

MDH-F：SEQ No.2；

MDH-R：SEQ No.3；

所述Mdh的序列为SEQ No.1；

重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

较优地，所述淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

较优地，所述发酵的生产方法如下：

较优地，每1L含葡萄糖的M3G培养基的组成为：(NH₄)₂SO₄10 g/L，KH₂PO41.36g/L，K₂HPO₄0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL，并加入100mL10×葡萄糖母液；

更为具体地，通过相关实施例来具体说明：

实施例1

目的Mdh基因的获得：根据Mdh基因设计引物序列MDH-F/MDH-R，采用单酶切的策略构建重组载体在基因Mdh两端均加入BamHΙ的酶切位点，其中在Mdh基因核苷酸序列的上游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamHΙ上游相同核苷酸，形成上游同源臂，在Mdh基因核苷酸序列的下游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamHΙ下游相同核苷酸，形成下游同源臂，分别以序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3为上下游引物，进行PCR反应，扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的Mdh基因，全长990bp，见序列表SEQID No.1。

PCR反应体系：2×phanta max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phanta max×Super-FidelityDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸1min20 s，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应，得到目的基因Mdh。如图2所示。

实施例2

含有Mdh基因的重组质粒pIMEP-MDH的构建：

将PCR扩增的带有同源臂的Mdh基因片段与经过BamHΙ单酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的线性质粒pIMEP，利用同源重组酶进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-MDH，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。pIMEP-MDH重组质粒的构建示意图可以如图1所示。

其中，同源重组体系为：线性化载体132.7ng，插入片段39.6ng，5×CEⅡBuffer4μL，ExnaseⅡ2μL，补充超纯水至20μL。同源重组条件：37℃反应30min，降至4℃。

实施例3

重组质粒pIMEP-MDH的转化：

取连接产物重组质粒pIMEP-MDH加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL安普霉素抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，同时对筛选获得转化子并以序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为上下游引物进行菌落PCR和提取质粒并进行BamHⅠ单酶切验证，并对验证转化子进行保存。结果如图3，图4所示：重组质粒pIMEP-MDH已成功转化到转化子中。

实施例4

基因工程菌株的获得：

利用质粒接合转移的方法将质粒pIMEP-MDH整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。

首先提取大肠杆菌JM109转化子中的pIMEP-MDH重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素25μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD₆₀₀0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集菌液，用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB液体培养基中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向Streptomycesdiastatochromogenes TUST孢子生长良好的贝纳特培养基平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mL M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子，用TES缓冲液重悬得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子。

将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，对转化子进行观察。

实施例5

将筛选获得Mdh基因过表达菌株进行聚赖氨酸发酵培养基摇瓶发酵30h后，提取基因组，在pIMEP-MDH质粒上Mdh基因的上游顶头和Mdh基因下游150bp左右处设计一对验证引物：具体序列分别为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，经过PCR验证，Mdh基因已成功结合到TUST的基因组中，而对照TUST基因组中并未获得相应条带，结果如图5所示。

PCR反应体系：2×phanta max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phanta max×Super-FidelityDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，50-65℃退火15s，72℃延伸1min20 s，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应。

实施例6

利用如上所述的淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenesMDH)基因工程菌株发酵生产聚赖氨酸的方法，具体步骤如下：

将基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌MDH接种在贝纳特培养平板上，在30℃培养7天左右直至产生孢子；然后，将孢子接种至含有100mL含葡萄糖M3G培养基的500mL容量摇瓶中，在30℃，180r/min发酵30h。以6％的接种量转移到新的100mL含葡萄糖的M3G培养基中发酵直至产量最高(96h左右)，即得ε-聚赖氨酸，产量可较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST提高17.96％；

其中，所述贝纳特培养基1L的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。

M3G培养基组分为：(NH4)₂SO₄10 g，KH₂PO₄1.36 g，K₂HPO₄0.8 g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到1L。

10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL 20g/L ZnSO₄·7H₂O和2mL10g/LMgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。

结果如图6所示，经过96小时的摇瓶发酵，发现原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST和基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)的ε-聚赖氨酸产量都随着时间进行不断增加，但是可以明显看出，在ε-聚赖氨酸产量最高96h时，基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)的ε-聚赖氨酸产量比原始菌株产量显著提高，提高了17.96％。

本发明中使用到的相关基因序列可以如下：

1.Seq ID No.1

苹果酸脱氢酶基因Mdh

2.SEQ No.2

MDH-F：即：5’-GGATCTAGAGATATCGGATCCATGACCCGCACTCCCGTG-3’

39其中下划线为BamHΙ酶切位点；黑体为上游同源臂

3.SEQ No.3；

MDH-R：即：

5’-GATGAATTCGGTACCGGATCCTCAGATCAGGCCGAGGCC-3’39其中下划线为BamHΙ酶切位点；黑体为下游同源臂

4.SEQ No.4

p-F：即：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ 18

5.SEQ No.5

P-R：即：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 17

6.SEQ No.6

vMDH-F：即：5’-ATGACCCGCACTCCCGTGAAC-3’ 21

7.SEQ No.7

vMDH-R：即：5’-CTGCGGAGACGGCGATGAAG-3’ 20

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 990

<212> DNA/RNA

<213> 苹果酸脱氢酶Mdh基因(Unknown)

<400> 1

atgacccgca ctcccgtgaa cgtcaccgtc accggcgcgg ccggacagat cggttacgca 60

ctcctcttcc gcatcgcctc cggccagctg ctcggcgcgg atgtgccggt caagctgcgc 120

ctgctggaga tcacccccgc gctcaaggcc gccgagggca ccgccatgga gctggacgac 180

ggcgccttcc cgctgctgca gtccatcgag atcagcgacg acccgaacgt cgccttcgac 240

ggcaccaacg tcgccctcct ggtgggcgcc cgcccgcgcg cgaagggcat ggagcgcggt 300

gacctcctgg aggccaacgg cgggatcttc aagccgcagg gcaaggccat caacgaccac 360

gccgcggacg acgtcaaggt cctcgtggtg ggcaacccgg ccaacaccaa cgccctgatc 420

gcccaggccg ccgccccgga cgtaccggcc gagcgcttca ccgcgatgac gcgcctcgac 480

cacaaccgcg ccatcagcca gctggccaag aagaccggtg ccgcggtctc cgacatccgc 540

cgggtgacga tctggggcaa ccactcggcc acccagtacc cggacatctt ccacgccgag 600

gtcgcgggca agaacgccgc cgagaccgtc aacgacgaga agtggctcgc cgaggacttc 660

atcccgacgg tcgccaagcg cggcgccgcc atcatcgagg cccgcggcgc ctcctcggcc 720

gcctccgccg cctccgcggc catcgaccac gtgtacacct gggtcaacgg caccgccgag 780

ggcgactgga cctccatggg catcccctcg gacggctcct acggcgtccc ggagggcctg 840

atctcctcct tcccggtcac cacgaaggac ggcgcctacg agatcgtcca gggcctggac 900

atcaacgagt tctcccgcgc ccgcatcgac gcctcggtga aggagctcgc ggaggagcgc 960

gaggcggtgc gcggcctcgg cctgatctga 990

<210> 2

<211> 39

<212> DNA/RNA

<213> MDH-F(Unknown)

<400> 2

ggatctagag atatcggatc catgacccgc actcccgtg 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA/RNA

<213> MDH-R(Unknown)

<400> 3

gatgaattcg gtaccggatc ctcagatcag gccgaggcc 39

<210> 4

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> p-F(Unknown)

<400> 4

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> P-R(Unknown)

<400> 5

caggaaacag ctatgac 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> vMDH-F(Unknown)

<400> 6

atgacccgca ctcccgtgaa c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> vMDH-R(Unknown)

<400> 7

ctgcggagac ggcgatgaag 20

Claims

1.一种基因工程产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH（Streptomyces diastatochromogenes MDH），其特征在于：过表达MDH的基因序列为SEQ No.1；

出发菌株为保藏编号为CGMCC No.3145的淀粉酶产色链霉菌。

2.一种基因工程产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：其构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-MDH，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25 μg /mL卡那霉素、50 μg /mL安普霉素和25 μg /mL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37 ℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD₆₀₀=0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST（Streptomyces diastatochromogenes TUST）菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30 ℃，180 r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50 ℃水浴热激10 min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37 ℃条件下振荡培养2-3 h使孢子萌发，5000 r/min 离心5 min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5 mM MgCl₂的SFM培养基上，30 ℃倒置培养14-18 h后，用含25μL浓度为25 mg/mL萘啶酮酸及25 μL浓度为25 mg/mL安普霉素的1 ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆，得到基因工程产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH；

过表达的基因序列为SEQ No.1；

所述步骤⑵中淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

3.根据权利要求2所述的基因工程产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤⑵中每1L M3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，KH₂PO₄ 1.36 g/L，K₂HPO₄ 0.8 g/L，酵母提取物5 g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；

或者，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖 10 g，蛋白胨 2 g，酵母粉1 g，牛肉膏1 g，琼脂15-20 g，加水补充至1L，NaOH调pH 7.7；

或者，所述步骤⑶中每1L SFM培养基的组成为：

黄豆饼粉30 g，甘露醇20 g、琼脂粉20 g，加水补充至1 L，用NaOH调节pH 7.2~7.4；

其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：

加入900 mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。

4.根据权利要求2所述的基因工程产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤⑴中重组质粒pIMEP-MDH为苹果酸脱氢酶Mdh，重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

目的片段基因的获得：根据Mdh基因设计引物序列MDH-F/MDH-R，采用单酶切同源重组的策略构建重组载体；在基因Mdh两端均加入BamH Ι的酶切位点，其中在Mdh基因核苷酸序列的上游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamH Ι上游相同核苷酸，形成上游同源臂，在MDH核苷酸序列的下游5’端添加BamHΙ的酶切位点和15个与出发载体pIMEP的BamH Ι下游相同核苷酸，形成下游同源臂，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的Mdh基因；

所述引物MDH-F/MDH-R的序列为：

MDH-F：SEQ No.2；

MDH-R：SEQ No.3；

所述Mdh的序列为SEQ No.1；

重组质粒pIMEP-MDH的构建步骤如下：

用BamHΙ单酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的带有同源臂Mdh基因片段与BamHΙ单酶切的线性质粒pIMEP质粒利用同源重组酶进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-MDH，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，即得重组质粒pIMEP-MDH。

5.一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述方法通过构建过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh重组质粒pIMEP-MDH，并将重组质粒pIMEP-MDH转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程产菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

过表达的基因序列为SEQ No.1；

所述淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

6.根据权利要求5所述的提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述发酵的生产方法如下：

采用的菌株为过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生灰色分生孢子；

7.根据权利要求6所述的提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：每1L含葡萄糖的M3G培养基的组成为：(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，KH₂PO4 1.36 g/L，K₂HPO₄ 0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL，并加入100mL10×葡萄糖母液；

10×葡萄糖母液：称取100 g葡萄糖，加入2 mL 20 g/L ZnSO₄·7H₂O和2 ml 10 g/LMgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至200 ml后115°C单独灭菌30 min。