CN109306355A - 一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，属于生物基因工程技术领域，突变苹果酸脱氢酶基因以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶为模板通过引物设计，分步PCR，融合PCR，转化菌抗性筛选，核苷酸测序的基因工程的手段构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，将构建的苹果酸脱氢酶转到大肠杆菌DE3菌株中进行表达，本发明表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶活性高两倍以上的特性，为D‑苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。

Description

一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，特别是指一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用。
背景技术
在自然状态下苹果酸(2-羟基丁二酸)因为分子中有一个手性碳原子所以有3种存在形式，即D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸。L-苹果酸是生物体内柠檬酸循环代谢的成分之一，因较易被人体代谢吸收，故广泛应用在食品、制药、化工等领域。而D-苹果酸则是一种自然界中稀少的有机酸。D-苹果酸因其特殊的手性常常被用来作为药物中的手性源，主要应用在手性药物合成、手性添加剂、手性助剂等领域，例如抗生素、药物信息素、抗病毒药物、抗癌药物、抗组胺药D-和L-肉毒碱等合成，也可作为药物拆分剂和不对称合成的配体。
D-苹果酸生产方法主要有三种，化学和生物拆分法以及生物转化法(酶法)等。但是化学拆分法成本高，生物拆分法由于D-苹果酸对菌体的生长有抑制作用，无法生产得到浓度较高的D-苹果酸。在生物转化法的研究中存在马来酸水合酶活性低，稳定性差、不耐盐、转化率低等问题。而且在D-苹果酸的生产中常常会混有L-苹果酸和DL-苹果酸，导致提纯的过程中常常难以做到完全除去L-苹果酸，因此需要提出一种高效的处理方式—酶处理法。使用苹果酸脱氢酶专一性分解L-苹果酸能够有效的对外消旋物起到一个拆分和提纯的效果。
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)(EC 1.1.1.37)存在于所有生物体中，是生物糖代谢的关键酶之一，它可以实现苹果酸和草酰乙酸间的可逆转换。野生型MDH在体外表达很难具有较高的催化活性，但是经过筛选也可以寻找到具有应用潜力的MDH，例如近几年报道的来自嗜热古细菌(Pyrobaculum calidifontis)的苹果酸脱氢酶具有极高的催化活性(886U/mg)。在自然状态下筛选拥有高活性的野生型苹果酸脱氢酶耗时较长，工序繁琐，不利于获得高活性的苹果酸脱氢酶以实现D/L-苹果酸的拆分，以及其他合成方法后的D-苹果酸的提纯。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，用于克服上述现有技术中的全部或者部分不足。
基于上述目的本发明提供的一种苹果酸脱氢酶突变基因，该突变基因具有SEQ IDNO.1的碱基序列。
一种苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，包括如下步骤：引物设计，突变型重组质粒的构建，转化筛选，核苷酸测序。
可选的，所述引物设计是根据天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列和pET-28b(+)特征，借助Primer premier 5.0软件设计出突变引物，其中，突变引物包括如下引物：
1)包括一个Nde I位点的MDH A引物，
P1:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′；
Nde I
P2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGA GGCGCAGCTTGACC-3′；
2)包含一个Xho I位点的MDH B片段引物，
P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGA GCTAA-3′；
P4:5′-CGCCCCTCGAGTCAGATGAGGCCGAGACCGCGC-3′。
Xho I
可选的，所述突变型重组质粒的构建是以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列为模板，利用碱基定点突变技术，得到含突变位点的目的基因片段，目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4DNA连接酶连接，得到的突变重组表达质粒pET-28b-MDH。
可选的，转化筛选是将突变重组质粒pET-28b-MDH转化到Escherichia coli DH5α感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选后，提取质粒、测序，得苹果酸脱氢酶的突变表达质粒pET-28b-MDH。
可选的，所述碱基定点突变技术包括PCR扩增和融合扩增。
可选的，所述PCR扩增条件为：8℃预变性1.5min；98℃20s，65℃25s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。
可选的，所述融合扩增条件为：98℃预变性1.5min；98℃20s，55℃30s，72℃1.8min，30个循环；72℃延伸5min。
一种苹果酸脱氢酶突变基因的用途，所述突变基因表达的苹果酸脱氢酶应用在工业上生产D-苹果酸。
从上面所述可以看出，本发明提供的一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，本苹果酸脱氢酶突变基因以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶为模板通过引物设计，分步PCR，融合PCR，转化菌抗性筛选，核苷酸测序的基因工程的手段构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，将构建的苹果酸脱氢酶转到大肠杆菌DE3菌株中进行表达，本发明表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶活性高两倍以上的特性，为D-苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。
附图说明
图1为本发明实施例融合片段的PCR扩增结果(T1)图；
M、100bp Marker，1、融合片段A(730bp)，2、融合片段B(864bp)，3、A和B融合(1594bp)；
图2为本发明实施例融合片段的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切结果(T1)图；
M、100bp Marker，1、融合片段双酶切；
图3为本发明实施例突变型和野生型ScMDH的SDS-PAGE分析图；
M、蛋白质分子量标准，1～2、WT和T1经0.5mM IPTG诱导后的细胞粗提物，5～6、纯化的WT和T1蛋白质；
图4为本发明实施例突变型ScMDH重组质粒的突变构建流程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，实施例中WT：野生型；T1表示根据突变位点数量命名的突变体。
1、突变位点的选择
通过比对结构域相似性选择关键位点进行碱基突变。T1中将ScMDH中第46位的氨基酸残基P46替换为R(P46→R)。如表1所示：
表1 ScMDH的突变位点选择
2、根据GenBank中天蓝色链霉菌[Streptomyces coelicolor A3(2)]MDH的基因序列(NC_003888)，用Primer Premier 5.0软件设计两对mdh突变引物(P1/P2，P3/P4)。突变流程见图4。
以天蓝色链霉菌基因组DNA为模板分别扩增A(P1/P2)、B(P3/P4)两个片段：
1)包括一个Nde I位点的MDH A引物，
P1:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′；
Nde I
P2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGA GGCGCAGCTTGACC-3′；
2)包含一个Xho I位点的MDH B片段引物，
P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGA GCTAA-3′；
P4:5′-CGCCCCTCGAGTCAGATGAGGCCGAGACCGCGC-3′。
Xho I
两个片段的重叠部分为引物P2、P3所在的位置，在P2、P3的5'端引入需要突变位点及序列。A、B两个片段的PCR产物经凝胶回收后，将二者等量混合后作为模板，以P1/P4为引物，扩增含有突变位点的全长ScMDH基因，凝胶检测结果如图1，图中M泳道是100bp Marker，泳道1是融合片段A(730bp)，泳道2是融合片段B(864bp)，泳道3是A和B融合(1594bp)，三条泳道的亮带与Mark对比，均符合预期长度，证明AB片段融合成功。两次PCR扩增均使用高保真PrimeHS DNA聚合酶，反应体系参照酶说明书。
PCR扩增条件：
(1)第一步扩增反应条件：98℃预变性1.5min；98℃20sec，65℃25sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min；
(2)融合扩增反应条件：98℃预变性1.5min；98℃20sec，55℃30sec，72℃1.8min，30个循环；72℃延伸5min。
将上述融合的含突变型ScMDH基因的扩增片段用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后重组入pET-28b(+)表达载体，双酶切结果如图2，图中M泳道是100bp Marker，泳道1是AB融合片段双酶切，通过双酶消化切去两端多余的片段得到与原始基因相同长度的片段，经过与Mark对比，图中亮带与预期结果相符，得到突变后的基因片段。重组质粒通过测序验证突变位点准确。
3、突变型蛋白的表达和纯化
(1)诱导表达含野生型和突变型pScMDH重组质粒E.coli Rosetta(DE3)；将转化成功的E.coli Rosetta菌液接种到含卡那霉素(30g/mL)和氯霉素(30g/mL)的5mL LB液体培养基中，在转速225rpm、37℃下过夜培养，吸取1mL培养菌液加入至200mL LB培养基中，转速225rpm、37℃下培养至菌浓度OD600达到0.5时加入0.5-0.7mM IPTG诱导，在转速180rpm，20℃下低温诱导18-20h，离心分离得到菌体，向菌体中加入pH值为8.0的磷酸盐缓冲液；
(2)用Clontech公司的细胞破碎液x Tractor Buffer破碎细胞；
(3)破碎液于15000g在4℃下离心20min，将上清转移到树脂中；
(4)使用Clontech公司的金属离子亲和柱(purification Kit)纯化收集突变型His6-tag ScMDH融合蛋白；
(5)使用SDS-PAGE对纯化出的蛋白进行电泳检测，结果如图3。泳道M是蛋白质分子量标准，泳道中是WT和T1分别经0.5mM IPTG诱导后的细胞粗提物和纯化的蛋白质，通过泳道对比可以看出，图中在蛋白质分子量标准条带35KDa左右，细胞粗提物异源表达的蛋白量有明显增加，证明诱导表达成功并且异源表达的蛋白质被纯化完全。
4、MDH的酶动力学参数研究
动力学参数可以衡量酶的催化效率和天然特性。
Km值可以判断酶的专一性和天然底物:有的酶可作用于几种底物，Km值随底物不同而异，由此可帮助判断酶的专一性，1/Km可近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km越大，表明亲和力越大；Km最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。
Kcat表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子(或是每个活性部位)转换底物的分子数，这个常数又叫转换数(简称TN)，通称为催化常数，单位为s-1，Kcat越大，表示酶的催化效率越高。
而Kcat/Km比值的大小，可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。比值越大，效率越高。通过测定酶的动力学参数可以反映一个酶的催化性质。
酶活力测试原理：苹果酸脱氢酶在催化草酰乙酸与苹果酸之间的可逆转换的同时，也催化NAD(P)H和NAD(P)+之间的转化。鉴于NAD(P)H在340nm处有各自的最大吸收峰，因此通过监测反应在340nm下的光吸收值变化即可测定酶的活力。
反应体系：Tris-HCL(PH 8.5)、草酰乙酸、NADH、L-苹果酸、NAD+。
按上述反应体系(1mL)，990μL反应液加入10μL纯化后的酶液，颠倒混匀；用Cary300Bio UV-Visible分光光度计，340nm下测定。每个实验独立重复3～4次；1个酶活单位(U)定义为：每分钟生成1μM NAD(P)H所需的酶量。酶活力计算公式如下：
其中，Vt：反应总体积(1mL)；Vs：样品体积；ε：摩尔消光系数6.22×103(L/M-1cm-1)；b：光程(1.0cm)；df：稀释因子；c：酶的浓度。
在30℃、100mM Tris-HCl(pH 8.5)、0.75m OAA下，变换NADH的浓度，检测A340的变化，每个NADH的浓度平行独立检测3～4次取平均值，分析突变型和野生型重组ScMDH的催化效率；同时，根据Lineweaver-Burk双倒数方程计算NADH的Km和kcat值。测试具体数据见表2。
表2野生型和突变型ScMDH的酶动力学参数
本实验构建的T1突变体中，突变后T1虽然对NADPH的亲和性(KmNADPH)增加到WT的约27倍，突变后T1对NADH的亲和性((KmNADH)也增强为WT的4倍，且对NADH的偏爱性(kcat/Km)增加到原来的12.4倍，催化活力增长为WT的3倍多。催化效率与WT型相比变得更高。
本发明实施例提供的一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，突变苹果酸脱氢酶基因以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶为模板通过引物设计，分步PCR，融合PCR，转化菌抗性筛选，核苷酸测序的基因工程的手段构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，将构建的苹果酸脱氢酶转到大肠杆菌DE3菌株中进行表达，本发明表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶活性高两倍以上的特性，为D-苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用
<130> 2018.11.13
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400> 1
atgactcgca ctcccgtgaa cgtcaccgtc accggcgcgg ccggccagat cggttacgcc 60
ctgctcttcc gcatcgcctc cggccagctg ctcggcgcgg acgtgccggt caagctgcgc 120
ctcctggaga tcacccgggc gctcaaggcc gccgagggca ccgcgatgga gctggacgac 180
tgcgcgttcc cgctgctcca gggcatcgag atcaccgacg acccgaacgt ggccttcgac 240
ggcgccaacg tcgccctcct cgtcggcgcc cgcccccgca ccaagggcat ggagcgcggc 300
gacctcctgg aggccaacgg cggcatcttc aagccgcagg gcaaggccat caacgaccac 360
gccgcggacg acatcaaggt cctcgtcgtc ggcaacccgg ccaacaccaa cgccctgatc 420
gcccaggccg ccgctccgga cgtaccggcc gagcgcttca ccgcgatgac ccgcctagac 480
cacaaccgcg ccctgaccca gctcgcgaag aagaccggct cgacggtcgc cgacatcaag 540
cgcctgacca tctggggcaa ccactcggcc acccagtacc cggacatctt ccacgccacc 600
gtcgcgggca agaacgccgc cgagaccgtc aacgacgaga agtggctggc cgacgagttc 660
atcccgaccg tcgccaagcg cggtgccgcc atcatcgagg cccgcggcgc ctcctcggcc 720
gcctccgccg ccaacgccgc catcgaccac gtgtacacct gggtcaacgg cactgccgag 780
ggcgactgga cctccatggg catcccgtcg gacggctcct acggcgtccc cgagggcatc 840
atctcctcct tcccggtcac cacgaaggac ggctcgtacg agatcgtcca gggcctggac 900
atcaacgagt tctcccgcgc ccgcatcgac gcctccgtca aggagctgtc ggaggagcgc 960
gaggcggtgc gcggtctcgg cctcatctga 990

Claims (9)

1.一种苹果酸脱氢酶突变基因，其特征在于，该突变基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
2.一种苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：引物设计，突变型重组质粒的构建，转化筛选，核苷酸测序。
3.根据权利要求2所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述引物设计是根据天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列和pET-28b(+)特征，借助Primer premier5.0软件设计出突变引物，其中，突变引物包括如下引物：
1)包括一个Nde I位点的MDH A引物，
P2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGA GGCGCAGCTTGACC-3′；
2)包含一个Xho I位点的MDH B片段引物，
P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGAGCTAA-3′；
4.根据权利要求2所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述突变型重组质粒的构建是以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列为模板，利用碱基定点突变技术，得到含突变位点的目的基因片段，目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4DNA连接酶连接，得到的突变重组表达质粒pET-28b-MDH。
5.根据权利要求2所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，转化筛选是将突变重组质粒pET-28b-MDH转化到Escherichia coli DH5α感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选后，提取质粒、测序，得苹果酸脱氢酶的突变表达质粒pET-28b-MDH。
6.根据权利要求4所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述碱基定点突变技术包括PCR扩增和融合扩增。
7.根据权利要求6所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：8℃预变性1.5min；98℃20s，65℃25s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。
8.根据权利要求6所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述融合扩增条件为：98℃预变性1.5min；98℃20s，55℃30s，72℃1.8min，30个循环；72℃延伸5min。
9.一种苹果酸脱氢酶突变基因的用途，其特征在于，所述突变基因表达的苹果酸脱氢酶应用在工业上生产D-苹果酸。
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