CN114806992B - 一种rsh过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法 - Google Patents

一种rsh过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法，通过过量表达淀粉酶产色链霉菌的RSH基因，获得丰加霉素高产菌株，用所获得的菌株发酵生产丰加霉素产量至少提高到3459.74mg/L，是原始菌株产量的21.43倍，为目前已报到的最高产量，为工业生产提高丰加霉素产量提供新的技术支持。

Description

一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素 发酵产量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其涉及一种通过改造淀粉酶产色链霉菌，过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因提高丰加霉素产量的生产方法及应用。
背景技术
丰加霉素是一种核苷类抗生素，分子式为C12H13N5O4，核糖C1连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结果为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转运而影响菌体的生长，可以广泛用于医疗、制药、农业等领域。近年来发现，丰加霉素可以用作农用抗生素，抑制多种植物病原真菌的生长，如黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌等。此外，丰加霉素由于是链霉菌的天然代谢产物，对环境污染小，对植物生长也有一定的调节作用，是一种理想的生物农药。相对于化学合成，生物法合成效率更高，反应条件温和，对环境污染小，生产成本低，是目前合成丰加霉素的主要技术手段。
丰加霉素是链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到微生物内多种调控因子的调控，单一途径基因的调节无法大幅度提高产物的产量。目前丰加霉素的产量较低，还无法进行工业化生产。采用紫外诱变等方式可以提高次级代谢产物的产量，但是由于次级代谢产物筛选困难，需要大规模的筛选才能获得高产菌株。
通过过量表达淀粉酶产色链霉菌的RSH基因，该基因可以调节链霉菌严谨反应的发生，进而激活次级代谢途径，激活途径特异性转录调控因子的转录。研究表明，通过在营养匮乏条件下激活严谨反应，能够提高S.coelicolor A3(2)和棒状链霉菌的次级代谢产物产量。因此，过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因可以提高次级代谢产物产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法，其是通过过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因，显著提高淀粉酶产色链霉菌胞内ppGpp合成，从而提高淀粉酶产色链霉菌的丰加霉素产量。
本发明首先提供了一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌，其为通过基因工程方法由质粒pIB139和RSH基因构建重组质粒，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes 1628)中构建得到，所述RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌过量表达RSH基因，所述RSH基因序列如SEQ ID No.1所示。所述的RSH基因来自于淀粉酶产色链霉菌。所述的RSH基因能够激活淀粉酶产色链霉菌的严谨反应，进而正向调控丰加霉素合成。
所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)在CN201410128610.X、CN201410128645.3中已经公开，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No.2060.
本发明还提供了一种上述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其包括如下步骤：
1)以淀粉酶产色链霉菌为模板，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RSH基因；
2)用NdeI和XbaI双酶切质粒pIB139，将扩增的目的基因片段用NdeI和XbaI双酶切后，与双酶切质粒pIB139进行连接；得到重组穿梭载体pIB139-RSH；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子保存；所述质粒pIB139是在pSET152质粒上，在多克隆位点添加红霉素启动子PermE*或者其他链霉菌内可用启动子构建获得；重组穿梭载体pIB139-RSH为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒；
3)重组穿梭载体pIB139-RSH整合到淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes 1628)染色体基因组，获得RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌。
作为本发明的优选方案，步骤1)中，PCR扩增的引物为RSH-F/RSH-D，RSH-F的序列如SEQ ID No.2所示，RSH-D的序列如SEQ ID No.3所示；具体序列如下：
RSH-F:GGTAAGGAGGTGGGCCATATGCCAGACGAGGCTCAGCCG；
RSH-D:CGCGGCCGCGGATCCTCTAGACGGGTCCTCGGTCTCCTTC。
本发明还提供了一种上述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌在生产丰加霉素中的应用。
本发明还提供了一种淀粉酶产色链霉菌高产丰加霉素的方法，其包括如下步骤：
1)将上述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌接种在GYM培养基中，在25-37℃培养到产生分生孢子；
2)将孢子接种到GYM培养基培养基中，在25-37℃，150-200rpm，培养24-30小时，将培养好的种子转接到GYM培养基中发酵直到96h，即可获得丰加霉素母液。
作为本发明的优选方案，所述GYM培养基的组成为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽糖提取物4g/L，酪蛋白提取物1g/L，NaCl 2g/L。
本发明的优点是：
本发明研究中根据淀粉酶产色链霉菌RSH基因序列，通过基因工程途径在淀粉酶产色链霉菌过量表达RSH基因拷贝，能够激活链霉菌的严谨反应，获得丰加霉素高产菌株，为工业生产提高丰加霉素发酵产量提供技术支持。
在淀粉酶产色链霉菌中过量表达RSH基因时，丰加霉素产量提高到3459.74mg/L，表明RSH基因过量表达可以提高丰加霉素产量。
附图说明
图1为RSH基因过量表达载体构建示意图。
图2为RSH基因过量表达载体酶切验证。
图3为野生菌RSH基因过量表达菌株的丰加霉素产量。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：
实施例中使用的引物序列见表1，大肠杆菌在37℃的液体LB培养基(或者加入1.5％琼脂的固体培养基)中培养，丰加霉素生产菌株淀粉酶产色链霉菌及其工程菌株在28℃的GYM培养基中培养。
实施例使用的材料中
实施例1
RSH过表达基因工程菌株的构建：
(1)以淀粉酶产色链霉菌基因组为模板，以引物RSH-F和RSH-D为引物，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RSH基因，与pMD19质粒连接，构建pMD19-RSH载体，将载体导入至E.coli JM109感受态中，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，经过酶切鉴定后送公司进行测序分析。
所述的引物RSH-F和RSH-D的序列为(下划线为酶切位点)：
RSH-F:GGTAAGGAGGTGGGCcatatgCCAGACGAGGCTCAGCCG；
RSH-D:CGCGGCCGCGGATCCtctagaCGGGTCCTCGGTCTCCTTC；
所述RSH基因序列为SEQ No.1。
(2)以pMD19-RSH重组质粒为模板，以引物RSH-F和RSH-D为引物，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RSH基因，使用NdeI和XbaI酶切获得RSH基因片段，与双酶切的pIB139载体连接，如图1所示。得到重组穿梭载体pIB139-RSH，经过酶切验证后(如图2)，得到连接产物的重组质粒pIB139-RSH。
(3)将重组穿梭载体pIB139-RSH加入E.coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min，此过程不要移动。在无菌条件下，像离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃，200rpm震荡培养45min，将转化产物吸取200μL涂布到含有卡那抗性、氯霉素抗性和安普霉素抗性的LB平板上，将LB平板37℃倒置培养过夜，直到单菌落清晰可见，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，筛选获得E.coliET12567(pUZ8002,pIB139-RSH)。
(4)重组链霉菌1628-RSH菌株的构建。将构建好的E.coli ET12567(pUZ8002,pIB139-RSH)培养到OD600为0.4到0.6之间。40mL菌体8000rpm离心收集菌体后，用新鲜的LB洗涤2-3次除去残留的抗生素，重悬到1mL LB中备用。向生长状态良好的Streptomycesdiastatochromogenes 1628菌株平板上加入10mL pH 8.0的PBS缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃180rpm震荡2h，随后用无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液。50℃热激10min，冷却至室温，加入等体积的GYM培养基，37℃，180rpm摇床培养3h，9000rpm离心收集孢子，并悬浮于TES溶液中备用。分别取100μL 108供体菌和108受体菌置于离心管中，静置2min，然后涂布在MS平板上，28℃倒置培养16h-18h，用1mL终浓度为100μg/mL的安普霉素和50μg/mL的萘啶酮酸覆盖于之前涂布的MS平板上，培养3-5天后，若菌落生长，则测定为结合子。随后挑取单菌落在安普霉素抗性平板上验证抗性。随后提取转化子的基因组，并通过PCR扩增安普霉素抗性基因，确定将pIB139-RSH整合到淀粉酶产色链霉菌S.diastatochromogenes 1628染色体基因组，获得重组菌株淀粉酶产色链霉菌1628-RSH。
实施例2:
淀粉酶产色链霉菌原始菌株和重组菌株的发酵性能验证
将基因工程菌株和野生型S.diastatochromogenes1628菌株接种在GYM平板上，在25-37℃培养4天，直到产生孢子。然后将孢子接种在60mL新鲜的GYM培养基中，在25-37℃，200rpm的摇床上培养2天，做成种子液。转接到60mL新鲜的GYM培养基中(所述GYM培养基的组成为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽糖提取物4g/L，酪蛋白提取物1g/L，NaCl 2g/L。)，在25-37℃，150-250rpm的摇床上培养4天，得到丰加霉素母液，采用HPLC法测定丰加霉素产量。如表1所示，重组菌的丰加霉素产量高于原始菌株，重组菌的丰加霉素最终产量达到3459.74mg/L，较原始菌提高了2143％，且重复性良好。是目前已报道的最高产量。说明在野生型S.diastatochromogenes1628菌株中过量表达RSH基因，有助于提高丰加霉素产量。
表1野生菌和基因工程菌的丰加霉素产量
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> 淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)
<400> 1
ccagacgagg ctcagccgct ctcccccgga ccgcgtccgg cggaaacccc cgccgcacgc 60
ccggacgagc cgaagccgca gcccgcggct tcctccgacg cgccgcagcc cgagcgaccg 120
gacgcggccg acggcaccgc cgcgcccgcc gcgccccagg cccccaccgg ccggtcccga 180
ccggcccccg cgccgcagcc gccgagcaga tcgctgtcga ccacctcggc cggccgctcc 240
ggctcgccca accgcgtccg ggcccgcctc gcccggctgg gagtgcagcg ctccagcccg 300
tacaacccgg tcctcgagcc gctgttgcgg gccgtccgca gcaacgaccc caagatcgag 360
accgccacgc tgcgccaggt cgagcgggcc taccaggtcg ccgagcgctg gcaccgcggc 420
cagaagcgca agagcggcga cccgtacatc acccacccgc tcgcggtcac caccatcctc 480
gccgagttgg ggatggaccc ggcgacgctg atggcgggac tgctgcacga cacggtcgag 540
gacaccgagt acgggctcga caccctgcgc cgggacttcg gcgaccaggt cgcgctgctc 600
gtcgacggcg tgaccaagct ggacagggtc aagttcggcg aggccgcgca ggccgagacg 660
gtccgcaaga tggtcgtggc gatggccaag gacccgcggg tgctcgtcat caagctcgcc 720
gaccggctcc acaacatgcg caccatgcgc tacctcaagc gggagaagca ggagaagaag 780
gcccgcgaga cgctggagat ctacgccccg ctggcgcacc ggctgggcat gaacaccatc 840
aagtgggagc tggaggacct cgcgttcgcg atcctctacc ccaagatgta cgacgagatc 900
gtccggctgg tcgccgagcg cgcccccaag cgcgacgagt acctggcggt ggtcaccgac 960
gaggtgcagg ccgacctgcg ctccgcgcgc atcaaggcca ccgtcaccgg ccggcccaag 1020
cactactaca gcgtctacca gaagatgatc gtgcgcggcc gcgacttcgc cgagatctac 1080
gacctggtgg gcatccgcgt cctcgtcgac acggtccggg actgctacgc ggccctgggc 1140
accatccacg cgcggtggaa cccggtcccc ggccggttca aggactacat cgcgatgccc 1200
aagttcaaca tgtaccagtc gctgcacacg acggtgatcg gtcccagcgg caagcccgtc 1260
gaactccaga tccgcacctt cgacatgcac cggcgcgccg agtacggcat cgccgcgcac 1320
tggaagtaca agcaggaggc ggtcgccggc gcctccaagg tgcgcaccga cgcgcccaag 1380
agcagcggca agggcgtcgg ccaggacacc gtcaacgaca tggcctggct gcggcagttg 1440
ctggactggc agaaggagac cgaggacccg 1470
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaaggagg tgggccatat gccagacgag gctcagccg 39
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggccgcg gatcctctag acgggtcctc ggtctccttc 40

Claims (6)

1. 一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌，其特征在于，其为通过基因工程方法由质粒pIB139和RSH基因构建重组质粒，并转入淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes 1628中构建得到，所述RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌过量表达RSH基因，所述RSH基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种如权利要求1所述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以淀粉酶产色链霉菌为模板，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RSH基因；所述RSH基因序列为SEQ No.1；
2) 用NdeI和XbaI双酶切质粒pIB139，将扩增的目的基因片段用NdeI和XbaI双酶切后，与双酶切质粒pIB139进行连接；得到重组穿梭载体pIB139-RSH；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子保存；所述质粒pIB139是在pSET152质粒上，在多克隆位点添加红霉素启动子PermE*或者其他链霉菌内可用启动子构建获得；重组穿梭载体pIB139-RSH为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒；
3) 重组穿梭载体pIB139-RSH整合到淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes 1628染色体基因组，获得RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR扩增的引物为RSH-F/RSH-D，RSH-F的序列如SEQ ID No.2所示，RSH-D的序列如SEQ ID No.3所示。
4.一种权利要求1所述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌在生产丰加霉素中的应用。
5.一种淀粉酶产色链霉菌高产丰加霉素的方法，其包括如下步骤：
1)将权利要求1所述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌接种在GYM培养基中，在25-37℃培养到产生分生孢子；
2)将孢子接种到GYM培养基培养基中，在25-37℃，150-200rpm，培养24-30小时，将培养好的种子转接到GYM培养基中发酵直到96h，即可获得丰加霉素母液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述GYM培养基的组成为：葡萄糖 4g/L，酵母提取物 4g/L，麦芽糖提取物 4g/L，酪蛋白提取物 1g/L，NaCl 2g/L。
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