CN1260832A - 新ppgpp合成酶及用于改善感兴趣的蛋白产生的表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自芽孢杆菌的新ppGpp合成酶以及涉及使用上述新ppGpp合成酶的用于在革兰氏阳性细菌中改善感兴趣蛋白改进的产生的表达系统。在一个优选实施方案中,表达系统表达的ppGpp合成酶的量比野生型系统中的表达量少。

Description

新ppGpp合成酶及用于改善感兴趣 的蛋白产生的表达系统

本发明领域

本发明涉及一种新ppGpp合成酶以及涉及使用上述新ppGpp合成酶的用于在革兰氏阳性细菌中改善感兴趣蛋白产生的表达系统。

本发明的背景

在革兰氏阳性细菌中，分泌的蛋白穿过细胞膜和细胞壁输出，随后释放到外部培养基中。

革兰氏阳性细菌诸如枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌等具有高含量的外蛋白质，并且事实上许多芽孢杆菌胞外酶已用于工业上。

在革兰氏阳性细胞中许多蛋白质参与分泌机制。

WO 94/19471描述了参与芽孢杆菌分泌机制的PrsA蛋白质，并进一步描述了涉及PrsA蛋白质过量表达的用于改善感兴趣的外蛋白的分泌的表达系统。

Dedhia等(生物技术与生物工程(Biotechnology andBioengineering)53：379-386(1997))描述了比野生型表达更少量的ppGpp合成酶的革兰氏阴性大肠杆菌菌株(relA)。这种革兰氏阴性大肠杆菌菌株具有氯霉素乙酰转移酶(CAT)蛋白质的改善产生。

本发明的总结

本发明要解决的问题是提供一种用于在革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌菌株中改善感兴趣蛋白产生的表达系统。

本方法基于从芽孢杆菌菌种枯草芽孢杆菌(序列1)和解淀粉芽孢杆菌(序列3)克隆的都是编码具ppGpp合成酶活性的多肽的新DNA序列。

此处公开的新DNA序列资料可用于通过例如标准PCR技术从革兰氏阳性细菌克隆类似的DNA序列。参看例如此处的工作实施例(参看下文)。

此DNA序列资料提供了构建一种表达系统的可能性，该表达系统用于在革兰氏阳性细菌中增进表达至少一种感兴趣蛋白，其中上述革兰氏阳性细菌比野生型表达更少量的具有ppGpp合成酶活性的多肽。

相应地，在一方面，本发明提供了一种选自包括(a)编码一种具有ppGpp合成酶活性的多肽的并含有序列1所示从核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸的序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有ppGpp合成酶活性的并至少70％与序列2中氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸分子；(d)与(a)，(b)或(c)互补的分子；以及(e)(a)，(b)，(c)或(d)的简并核苷酸序列的组中的分离的多核苷酸分子。

本发明第二方面提供了一种含有下面可操作连接的元件的表达载体：一个转录启动子；一个选自含有(a)编码一种具有ppGpp合成酶活性的多肽的并含有序列1所示从核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸的序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有ppGpp合成酶活性的并至少70％与序列2中从氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸分子；以及(d)(a)，(b)或(c)的简并核苷酸序列的组中的DNA片段；及一个转录终止子。

本发明第三方面提供了一种引入了上述表达载体的培养细胞，其中上述细胞表达由DNA片段编码的多肽。

本发明第四方面提供了一种具有ppGpp合成酶活性的选自包括(a)含有序列2所示从氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸残基的序列的多肽分子；(b)(a)的物种同系物的组中的分离的多肽。

本发明的另一方面提供了含有纯化的本发明多肽及其它多肽的一种组合物。

本发明的又一方面提供了生产本发明多肽的方法，包括培养引入了上述表达载体的细胞，借此上述细胞表达DNA片段编码的多肽以及回收多肽。

本发明的再一个方面涉及一种用于在革兰氏阳性细菌中改善至少一种感兴趣蛋白质产生的表达系统，该表达系统含有一种比野生型表达更少量本发明多肽的革兰氏阳性细菌。

本发明最后一个方面涉及一种用于在革兰氏阳性细菌中改善至少一种感兴趣蛋白质产生的方法，该方法包括：

i)培养依据本发明的表达系统；和

ii)从产生的培养肉汤或表达系统纯化感兴趣的上述蛋白质。定义

在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语

术语“物种同系物(species homlog)”意图包括“定向进化同源物(ortholog)”和/或“平行进化同源物(paralog)”。

术语“定向进化同源物”指从一个物种获取的一种多肽或蛋白质与来自不同物种的类似多肽或蛋白质具有同源性。

术语“平行进化同源物”指从一个给定物种获取的一种多肽或蛋白质与来自同一物种的不同多肽或蛋白质具有同源性。

术语“表达载体”指一个线性或环状DNA分子，它含有与其它片段可操作连接以使其转录的编码感兴趣多肽的片段。这种其它片段可能包括启动子和终止子序列，并可选地包括一个或更多的复制起点，一个或更多的可选择标记，一个增强子，一个聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来源自质粒或病毒DNA，或含有两种元件。本发明的表达载体可以是任何可方便的进行重组DNA流程的表达载体，载体的选择通常依赖于要引入载体的宿主细胞。因而，载体可能是自主复制载体，即以染色体外实体存在的，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒。替代的，载体可以是在引入宿主细胞后整合到宿主基因组并与它整合进的染色体共同复制。

此处与多肽或蛋白质的表达联合使用的术语“重组表达”或“重组地表达的(recombinantly expressed)”按照本技术领域标准定义来定义。一种蛋白质的重组表达通常通过使用紧邻的上面所述的表达载体来进行。

当用于一种多核苷酸分子时，术语“分离的”是指将多核苷酸从其天然遗传环境取出从而不含其它外部的或不想要的编码序列，并且以适用于基因工程蛋白质产生系统的形式存在。这种分离的分子是从其天然环境分离的，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含它们通常相连的其它基因，但可能包括天然存在的5′和3′不翻译区诸如启动子和终止子。相关区域的确认对本技术领域普通技术人员是显然的(参看例如，Dynan和Tijan，自然(Nature)316：774-78，1985)。术语“一种分离的多核苷酸”可由术语“一种克隆的多核苷酸”代替。

用于蛋白质时，术语“分离的”指蛋白质处于非其天然环境的条件下。优选的形式是，分离的蛋白质事实上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参看下面))。优选地提供高纯化形式的蛋白质，即由SDS-PAGE测定的，高于80％纯度，更优选地超过95％纯度，甚至更优选地超过99％纯度。

术语“同源杂质”意思是从获取本发明多肽的同源细胞中产生的任何杂质(即本发明多肽之外的另一种多肽)。

此处与一种特定微生物来源联用的术语“获取”是指由特定来源或来自来源的基因插入的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。

当指DNA片段时，术语“可操作连接的”指片段的排列使它们为其目的一致行使功能，例如在启动子起始转录，经过编码片段至终止子。

术语“多核苷酸”指从5′到3′末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可能从天然来源分离，体外合成，或将天然和合成的分子联合来制备。

术语“多核苷酸分子的互补物”指与参考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′与5′CCCGTGCAT3′互补。

术语“简并核苷酸序列”指含一个或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)。简并密码子含有不同的三联体核苷酸，但编码同一氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码天冬氨酸)。

术语“启动子”指含有提供RNA聚合酶结合及转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常但不总是发现于基因的5′非编码区。

术语“分泌性信号序列”指编码一种多肽(一种“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为一种大多肽的组分，引导大多肽穿过它在其中合成的细胞的分泌途径。大多肽通常在穿过分泌途径中切割除去分泌肽。

用于在革兰氏阳性细菌中改善表达感兴趣蛋白质的术语“表达系统”指比野生型表达更少量依据本发明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的革兰氏阳性细菌。感兴趣的蛋白质可能是例如一种重组表达的蛋白质。

此处与紧邻的上面所述的表达系统相连使用的术语“野生型量”指依据本发明的多肽表达水平的野生型(天然的)量，即在革兰氏阳性菌株被修饰为表达更少量上述多肽之前的表达量。

术语“外蛋白(exoprotein)”指从感兴趣细胞分泌的蛋白质。一种外蛋白通常含有如上所述的分泌性信号序列。

术语“ppGpp合成酶”指依据本技术领域定义的ppGpp合成酶。

大肠杆菌中ppGpp的合成由至少两种途径控制(Dedhia等，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)53：379-386(1997))。大肠杆菌中由relA基因编码的酶ppGpp合成酶I(PSI)(EC 2.7.6.5)在对氨基酸缺失的严格反应中负责ppGpp的合成(Block，R.，Haseltine，W.A.1974。ppGpp和ppGppp的体外合成(In vitro synthe sis of ppGpp and ppGppp)，pp.747-761。见于：M，Nomura，A.Tissieres，和P.Lengyel(编者)，核糖体(Ribosomes)。冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港纽约(Cold Spring HarborN.Y.))。当细菌的生长由于主要碳源的耗尽而减慢时，由不依赖于relA基因的途径激活严格反应(Hemandez，V.J.，Bremer，H.1991。大肠杆菌ppGpp合成酶II活性需要spoT(E.coli ppGpp Synthetase II activity requires spoT.)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，266：5991-5999)。第二种酶，由spoT基因编码的ppGpp合成酶II(PSII)，负责催化ppGpp的合成(Hernandez，V.J.，Bremer，H.1991。大肠杆菌ppGpp合成酶II活性需要spoT。生物化学杂志(J.Biol，Chem.)266：5991-5999)。

本文中的“ppGpp合成酶”意图包括如上所述的具有ppGpp合成酶I活性的酶(EC 2.7.6.5)和/或具有ppGpp合成酶II活性的酶。

术语“ppGpp合成酶”可替代为“(p)ppGpp合成酶”。

术语“ppGpp合成酶基因”是指编码具有ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。

                    本发明的详细描述

怎样使用本发明的一个序列获取其它相关序列：

此处公开的涉及编码本发明ppGpp合成酶的多核苷酸序列的序列资料可用作确认其它同源ppGpp合成酶的工具。例如，可以使用聚合酶链反应(PCR)从不同的微生物来源，特别是不同的芽孢杆菌菌种扩增编码其它同源ppGpp合成酶的序列。

进一步的细节参考此处的工作实施例(参见下面)。

测定活性的检测

依据本技术领域熟知的标准测定方法，诸如通过离子对反相高效液相层析分离核苷酸后在254nm的紫外吸收，可测定本发明具有ppGpp合成酶活性的多肽的ppGpp合成酶活性。进一步的细节参考Baracchini等(Mol GenGenet(1988)213：379-387)。

使用本发明的表达系统产生的感兴趣蛋白质可通过与上述感兴趣蛋白质相关的标准活性分析方法来测定活性。特别是当感兴趣蛋白质是一种酶时，本技术领域描述了多种相关酶活性分析方法。对本技术领域熟练技术人员而言特别是对酶，确定与感兴趣蛋白质相关的有效的分析方法是常规工作。

多核苷酸：

在本发明优选的实施方案中，至少在介质严格条件下，本发明的分离的多核苷酸将与序列1的类似大小区域或其互补序列杂交。

特别地，至少在介质严格条件下，但优选地在下面详述的高度严格条件下，本发明的多核苷酸将与含有序列1中位置21-2225所示序列的双链DNA探针杂交。

测定培养基中或高度严格时核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的适当的实验条件包括在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等.1989)中预浸泡含有要杂交的DNA片段或RNA的滤膜10分钟，在5×SSC，5×Denhardt溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml变性超声波处理的鲑精DNA(Sambrook等.1989)溶液中预杂交滤膜，随后在大约45℃含有浓度为10ng/ml的随机引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.132：6-13)，³²P-dCTP-标记的(特异活性＞1×10⁹cpm/μg)探针的同样溶液中杂交12个小时。然后至少在60℃(培养基严格)，更优选地至少65℃(培养基/高度严格)，甚至更优选地至少70℃(高度严格)，以及甚至更优选地至少75℃(非常高度严格)下，2×SSC，0.5％SDS中30分钟洗两次。

使用X-射线底片检测到在这些条件下寡核苷酸探针杂交的分子。

如前面所述，本发明分离的多核苷酸包括DNA和RNA。本技术领域分离DNA和RNA的方法是众所周知的。

使用盐酸胍抽题随后通过氯化铯梯度离心分离制备总RNA(Chirgwin等，生物化学(Biochemistry)18：52-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69：1408-1412，1972)从总RNA中制备Poly(A)⁺RNA。使用已知方法从poly(A)^-RNA制备互补的DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR确认和分离编码本发明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的多核苷酸。

本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的对应多肽和多核苷酸(定向进化同源物或平行进化同源的)。特别兴趣的是来自革兰氏阳性菌株的ppGpp合成酶多肽，革兰氏阳性菌株包括芽孢杆菌菌种诸如枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillus clausii，或特别地是地衣芽孢杆菌。

序列1所示的本发明多核苷酸从枯草芽孢杆菌菌株168(NCIB 10106)获得。

将本发明提供的资料和组合物与常规克隆技术相结合能够克隆本发明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的物种同系物。例如，使用从表达该蛋白的细胞类型获得的mRNA能够克隆cDNA。利用从此处公开的序列设计的探针通过探测Northern印迹可以确认适当来源的mRNA。然后从阳性细胞的mRNA制备文库。然后通过多种方法，诸如用基于公开序列的完全的或部分cDNA或一组或更多组简并探针进行探测，分离到编码本发明的具有ppGpp合成酶活性多肽的cDNA。亦可使用从此处公开序列设计的引物利用聚合酶链反应或PCR(Mullis，U.S.Patent 4,683,202)克隆cDNA。其中的另一种方法是，使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，使用抗relA-bac抗体或与具有ppGpp合成酶活性的多肽相关的活性测定方法检测感兴趣cDNA的表达。亦可使用类似的技术分离基因组克隆。

多肽：

本发明亦提供了大体上与序列2多肽同源的以及它们的物种同系物(平行进化同源物或定同进化同源物)的分离的ppGpp合成酶多肽。此处使用的术语“大体上同源的”是指与序列2所示序列或它们的定向进化同源物或平行进化同源物具有70％，更优选地至少80％序列相同的多肽。这类多肽将更优选地至少90％，并最优选地95％或更多与序列2或其定向进化同源物或平行进化同源物相同。序列相同性的百分数是由常规方法测定的，通过本技术领域熟知的计算机程序诸如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手册，版本8，1994年8月，遗传计算组(Genetics Computer Group)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biolgy)，48，443-453)。利用给定的用于多肽序列比较的设置使用GAP：GAP产生惩罚(GAP Creation penalty)3.0，GAP延伸惩罚(GAPextension penalty)0.1。

多核苷酸分子的序列相同性是通过类似的方法使用GAP测定的，使用了用于DNA序列比较的下列设置：GAP产生惩罚5.0及GAP延伸惩罚0.3。

大体上同源的蛋白质和多肽表征为具有一个或多个氨基酸的取代，缺失或添加。这些变化优选地很微小，是保守的氨基酸取代(参看表2)，和没有显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的其它取代；小的缺失，典型地是1到30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，诸如一个氨基端甲硫氨酸残基，一个至大约20-25残基的接头肽，或有助于纯化的的小的延伸(一种亲合标记)，诸如聚组氨酸片段，蛋白质A(Nilsson等，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法(Methods Enzymol.)198：3，1991。一般参看Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)2：95-107，1991，以参考文献形式并于此处)。可从商业供应商获取编码亲合标记的DNA(例如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；NewEngland Biolabs，Beverly，MA)。

表2

保守性氨基酸取代

碱性的：精氨酸

        赖氨酸

        组氨酸

酸性的：谷氨酸

        天冬氨酸

极性的：谷氨酰胺

        天冬酰胺

疏水的：亮氨酸

        异亮氨酸

        缬氨酸

芳香族的：苯丙氨酸

          色氨酸

          酪氨酸

小的：甘氨酸

      丙氨酸

      丝氨酸

      苏氨酸

      甲硫氨酸

除了20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(诸如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，2-氨基异丁酸，异缬氨酸(isovaline)和α-甲基丝氨酸(a-methylserine))可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限量的非保守氨基酸，不是由遗传密码编码的氨基酸，以及非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”是在蛋白质合成后进行了修饰，和/或其侧链具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可化学化成或优选地购得商品，包括2-哌啶酸，噻唑烷羧酸，脱氢脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，以及3，3-二甲基脯氨酸。

按照本技术领域熟知的方法，诸如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine-scanning mutagenesis)(Cunningham和Wells，科学(Science)244：1081-1085，1989)能够确定本发明ppGpp合成酶多肽中关键的氨基酸。在后一种技术中，将单个丙氨酸突变引入到分子中的每一个残基，并测定产生的突变分子的生物学活性(即ppGpp合成酶活性)从而确认对分子活性关键的氨基酸残基。亦可参看Hilton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：4699-4708，1996。还可以将诸如核磁共振，晶体学，电子衍射或光亲合标记测定的结构的物理分析与假定的接触部位氨基酸的突变相结合，确定配体-受体或其它生物学相互作用的位点。参看例如，de Vos等，科学(Science)255：306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。也可以通过与本发明多肽相关多肽的同源性分析推断一致的关键氨基酸。

使用已知的方法诱变，重组和/或改组随后是相关筛选方案，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(科学(Science)241：53-57，1988)，Bowie和Sauer(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：2152-2156，1989)，WO95/17413，或WO 95/22625所公开的，可以进行多氨基酸取代和检测。简言之，这些作者公开的方法是同时随机化多肽中的两个或多个位点，或重组/改组不同的突变(WO 95/17413，WO 95/22625)，随后选择功能性多肽，然后将诱变的多肽测定确定每个位点允许取代的图谱。其它可以使用的方法包括噬菌体展示(例如Lowman等，生物化学(Biochem.)30：10832-10837，1991；Landner等，U.S.Patent No.5,223,409；Huse，WIPOPublication WO 92/06204)和区域定位诱变(Derbyshire等，基因(Gene)46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。

可将上面公开的诱变/改组方法与高生产率，自动的筛选方法结合来检测宿主细胞中克隆的突变多肽的活性。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的突变DNA分子并使用现代化仪器快速测序。这些方法能够快速测定感兴趣多肽中单个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。

使用上面讨论的方法，本技术领域普通技术人员能够确定和/或制备多种大体上与序列2中残基1至734同源的并保持野生型蛋白质ppGpp合成酶活性的多肽。

蛋白质的生产：

依据常规技术，可在基因工程的宿主细胞中产生本发明的多肽，包括全长蛋白质，其片段和融合蛋白。合适的宿主细胞是那些可由外源DNA转化或转染的并可在培养基中生长的细胞类型，包括细菌，真菌细胞，以及培养的较高等真核细胞。优选地是细菌细胞，特别是革兰氏阳性细菌的培养细胞。来自芽孢杆菌属的革兰氏阳性细胞是特别优选的，诸如枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽胞杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillus clausii，或特别地是地衣芽孢杆菌。

操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入多种宿主细胞的技术公开于Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor，NY)，1989；Ausubel等(编者)，分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wileyand Sons，Inc.，NY，1987；以及(枯草芽孢杆菌及其它革兰氏阳性细菌(Bacillus Subtilis and other Gram-Positive Bacteria)，Sonensheim等，1993，美国微生物学会(American Society for Microbiowgy)，Washington D.C.)，以参考文献并于此处。

一般而言，编码本发明ppGpp合成酶多肽的DNA序列可操作地连接到其表达所需的其它遗传元件，通常在表达载体内包括转录启动子和终止子。载体通常也将含有一个或多个选择性标记以及一个或多个复制起始点，但本技术领域熟练人员将认识到在某些系统中选择性标记可由分离的载体提供，并且外源DNA的复制可通过整合到宿主细胞基因组来实现。启动子，终止子，选择性标记，载体和其它元件的选择是本技术领域普通技术人员的常规设计工作。许多这类元件在文献中有叙述并可通过商品供应商得到。

为了引导多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供了分泌性信号序列(亦称为前导序列，前原序列或前序列)。分泌性信号序列可以是多肽的，或从其它外蛋白衍生的，或从头合成的。分泌性信号序列在正确的阅读框中与DNA序列连接。分泌性信号序列通常在编码感兴趣多肽的DNA序列的5′位置，但某些信号序列也可位于感兴趣DNA序列的其它位置(参看例如，Welch等，U.S.Patent No.5,037,743；Holland等，U.S.Patent No.5,143,830)。

按照常规方法在含有营养物质和选择的宿主细胞生长所需的其它成分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。本技术领域熟知多种合适的培养基，包括确定成分培养基和复杂培养基并且通常包括一种碳源，一种氮源，必需氨基酸，维生素和矿物质。如果需要，培养基中也可含有诸如生长因子或血清等组分。生长培养基通常通过例如与表达载体或共转染宿主细胞携带的选择性标记互补的药物选择或某种必需营养物质的缺乏来选择含有外源附加DNA的细胞。

蛋白质分离：

可使用分级和/或常规纯化方法和材料纯化表达的重组多肽(或嵌合多肽)。可以使用硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提进行样品分级。纯化步骤举例可包括羟基磷灰石，尺寸排阻层析气相色谱(FPLC)和反相高效液相色谱。合适的阴离子交换介质包括衍生化葡聚糖，琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺，特殊硅石等等。优选地是PEI，DEAE，QAE和Q衍生物，特别优选地是DEAE快速流动琼脂糖凝胶(DEAE Fast-Flow Separose)(Pharmacia，Piscataway，NJ)。色谱介质举例包括从苯基，丁基，或辛基衍生的介质，诸如苯基-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia)，Toyopearl丁基650(Toyopearl butyl 650)(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，辛基琼脂糖凝胶(Pharmacia)及其类似物；或聚丙烯酸树脂，诸如Amberchrom CG71(Toso Haas)及其类似物。合适的固相载体包括在它们使用的条件下是不溶的玻璃珠，硅石为基础的树脂，纤维素树脂，琼脂糖珠，交联琼脂糖珠，聚苯乙烯珠，交联聚丙烯酰胺树脂及其类似物。可使用反应基团修饰载体使其通过氨基，羧基，巯基，羟基和/或糖组分粘附蛋白质。偶联化学的例子包括溴化氰活化，N-羟基琥珀酰亚胺活化，环氧化物活化，巯基活化，酰肼活化，以及用于碳二亚胺偶联化学的羧基或氨基衍生物。这些及其它固相介质为本技术领域熟知和广泛应用，并可从商品供应商得到。特定方法的选择是常规的设计工作并且部分由选择的载体的性质来确定。参看例如亲合层析：原理和方法(AftinityChromatography：Principles & Methods)，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988。

优选地将蛋白纯化到＞80％纯度，更优选地到＞90％纯度，甚至更优选地＞95％，以及特别优选地接近完全纯化状态，即对污染的大分子特别是其它蛋白质和核酸而言超过99.9％纯度，并且不含感染性和热原性试剂。优选地，纯化的蛋白质大体上不含其它蛋白质，特别是细菌来源特别是革兰氏阳性细菌来源的其它蛋白质。纯度是由SDS-PAGE测定的。

也可以通过化学合成制备本发明的多肽或其片段。本发明的多肽可能是单体或多体；糖基化的或非糖基化的；pegylated or nonpegylated；并且可能含或不含起始甲硫氨酸残基。

多核苷酸/多肽的使用

如下面详述，此处公开的与本发明具ppGpp合成酶活性的多肽有关的资料对于构建用于在革兰氏阳性细菌中增进生产感兴趣蛋白的表达系统是必需的。

用于在革兰氏阳性细菌中增强外蛋白的分泌的表达系统：

本发明一方面涉及一种用于在革兰氏阳性细菌中改善至少一种感兴趣蛋白产生的表达系统，该表达系统含有与野生型相比表达更少量本发明的多肽的革兰氏阳性细菌。

优选地感兴趣蛋白是一种外蛋白。

优选地，术语“用于改善至少一种感兴趣蛋白产生的表达系统”是一种具有一种或多种紧邻的下面所述的改进特征的表达系统。

本发明表达系统的改进特征包括的特征是诸如改进利用生长培养基的能力，生长到更高细胞密度的能力，在基本培养基中生长的能力，生产宿主的芽孢形成缺陷，增加感兴趣的蛋白的表达，测定为发酵肉汤中积累的感兴趣蛋白的量或每个时间单位每细胞质量产生的感兴趣蛋白量，减少发酵肉汤形成泡沫的倾向，发酵肉汤降低粘度，降低生产宿主产生的蛋白产物的降解，生产者生物体降低裂解的倾向(减少自溶)，在生产培养基中更高含量的高产细胞，发酵中减少色素或有色物质的形成，以及改进的发酵肉汤能够更容易和有效的进行回收步骤从而导致改进的回收产率。

如上所述本发明的relA-Bac多肽是一种具有ppGpp合成酶活性的多肽。

在生产微生物中有比野生型更少量的ppGpp的好处：

ppGpp是一种真正的警戒因子(alarmone)，即它的浓度在正常生长条件下很低(P.Neubauer等(J.of Biotechnology(1995)43：195-204)并且当生物体暴露于饥饿或其它肋迫因子时，ppGpp的胞内浓度迅速增高。当胞内ppGpp浓度改善时核糖体RNA(rRNA)浓度降低，这样又可能造成：

·翻译的降低从而减少所需蛋白的产生。

·因为装载mRNA的核糖体数量的减少导致mRNA的保护减少，使核

  酸酶活性升高，所以给定mRNA有更高的不稳定性。

·信使RNA链延长速率的降低(生物化学杂志(J.of Biological

  Chemistry)(1997)272：12265-12271))。

相应地，为了获得改善感兴趣蛋白产生的表达系统，在用于表达上述感兴趣蛋白质的生产细胞中比野生型表达更少量ppGpp合成酶是有利的。

一系列能够在革兰氏阳性细菌中表达更少量感兴趣多肽的技术在本技术领域是已知的，特别是优选的芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌，Sonen sheim等，1993，美国微生物学会(American Society for Microbiology)，Washington D.C.)。

表达更少量本发明具ppGpp合成酶活性的多肽的合适技术包括诸如删除或用其它方法破坏(例如破坏正确的阅读框)本发明的ppGpp合成酶基因(其某些或所有拷贝)(例如在革兰氏阳性细菌染色体上)，截短ppGpp合成酶基因(例如引入终止密码子)，使用与ppGpp合成酶基因转录的mRNA反义的mRNA，和/或改变改善表达的调节元件，例如使用弱启动子，等等技术。进一步的细节参照(Sarnbrook等，(1989)分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：Alaboratory manual)，Cold Spring Harbor Lab.，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel，F.M.等(编者)“分子生物学现代技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)”。John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编者)“芽孢杆菌分子生物学方法(Molecular BiologicalMethods for Bacillus)”。John Wiley and Sons，1990)。

基于此处提供的DNA和/或氨基酸序列资料，选择特定的策略在革兰氏阳性细菌中表达比野生型更少量的本发明具ppGpp合成酶活性的多肽对于本技术领域熟练技术人员是常规工作。

为了确定本发明具ppGpp合成酶活性的多肽减少表达的程度，可使用任何与ppGpp合成酶活性相关的检测方法/测定方法(此处描述了合适的检测方法(参看上文))。测定了在革兰氏阳性细胞修饰前后产生的本发明具ppGpp合成酶活性的多肽的量，表达降低的程度可相对于未修饰的野生型(对照)细胞来测定。

依据本发明的具有ppGpp合成酶活性的多肽减少表达的程度优选地是二倍降低表达，更优选地四倍降低表达，甚至更优选地十倍降低表达，最优选地本发明具有ppGpp合成酶活性的多肽的表达完全受到破坏。

优选地本发明具有ppGpp合成酶活性的多肽是从芽孢杆菌菌种获得的多肽，诸如来自迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，Bacillus clausii，或特别地来自枯草芽孢杆菌。

本发明表达系统中革兰氏阳性细菌可通过“蛋白质生产”部分(参看上文)描述的对宿主细胞的常规方法来培养。

优选地革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌菌种，诸如枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillusclausii，或地衣芽孢杆菌。

相对于革兰氏阳性细菌，感兴趣的蛋白可以是同源蛋白或异源蛋白。

优选地，感兴趣的蛋白是重组表达的。

感兴趣蛋白质可能是任何感兴趣的蛋白质。然而优选地感兴趣的蛋白质是一种外蛋白质，特别地是蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支链淀粉酶(pullanase)，纤维素酶，葡糖异构酶，蛋白质二硫键异构酶，CGT酶(环化糊精葡糖酸转移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，木聚糖酶，细菌蛋白质毒素，微生物表面蛋白质，病毒蛋白质，或药物蛋白质。

为了测定感兴趣蛋白质优选地是感兴趣外蛋白质改善产生的程度，可以使用对应该蛋白(例如外蛋白)的任何相关活性分析方法/测定方法。

感兴趣蛋白质改善产生的程度可以相对于在革兰氏阳性菌株未改变以表达少量本发明多肽之前的蛋白产生水平来确定。

使用本发明的表达系统导致至少一种感兴趣蛋白至少改善产出2倍，更优选地至少一种感兴趣蛋白至少改善产出4倍，甚至更优选地至少一种感兴趣蛋白至少改善产出10倍。

感兴趣蛋白可以通过例如“蛋白质分离”部分(参看上文)所述的标准方法来分离。

本发明进一步涉及一种在革兰氏阳性细菌中改善产生至少一种感兴趣蛋白的方法，该方法包括：

i)培养本发明的表达系统；和

ii)从产生的培养肉汤或表达系统纯化上述感兴趣的蛋白质。

在一个优选实施方案中上述培养是通过补料分批发酵进行的。

补料分批发酵是一种标准发酵方法，特别是对大规模工业生产感兴趣的蛋白质。

补料分批发酵在基本生化工程(Bungary，Henry R.BASIC BiochemicalEngineening(2nded.).Troy：BiLine Associates，1993)中一般描述为这种类型的系统，“当其浓度降低至设定点时加入营养物质”。为了准确，营养物质的添加通常由计算机控制。一种优选的控制补料的方法是监测发酵罐或反应器中该营养物质的浓度。

以不同的剂量添加营养物质，以保证在任何时间发酵罐中都不会存在太多的营养物质。如果存在太多的营养物质，可能会抑制细胞的生长。通过控制方式的补加营养物质，反应可在高产率运行而不会过载。

Neubauer，P.等(1995，生物技术杂志(Jouncal of Biotechnology)43 P.197-198)描述了一个合适的补料分批发酵的例子。

这个优选实施方案的原理是许多直接参与蛋白质合成的诸如RNA聚合酶，延伸因子和起始因子等细胞内含物会由于营养和能量的缺乏而减少以及由relA基因编码的(p)ppGpp合成酶而介导，Dedhia，N.等，(1997)生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)53(4)p379-386。

因而，使用具有降低表达的本发明的具有ppGpp合成酶活性多肽的革兰氏阳性细菌，在这种补料分批发酵中可改善感兴趣蛋白质的产生。

替代地，上述培养可使用例如下面所述的标准发酵技术中的一个来完成：

分批发酵：在分批发酵中，接种后细胞生长，直到某种底物组分耗尽或某种抑制剂积累；或通过下面标准技术的一种进行连续发酵；

以恒定速率进行恒化器营养物质补料；利用控制泵速率的反馈保持培养物固定浊度的恒浊器。当细胞浓度低于设置点时恒浊器的控制器减缓补料使生长能够重建浊度。如果超过设置点，泵加速来稀释细胞浓度；或

恒营养(nustat，nutritstat，或auxostat(同义词))补料培养基来保持某因子恒定。

由下列非限定实施例进一步描述本发明。材料和方法通用分子生物学方法：除非特别说明，DNA的操作和转化使用分子生物学的标准方法进行(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：Alaboratorymanual)，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M，等(编者)“分子生物学现代方法(Current protocols in MolecularBiology)”.John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编者)“芽孢杆菌分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)”.John Wiley and Sons，1990)。

按照供应商的说明使用DNA操作的酶。DNA操作的酶

除非特别说明，DNA操作使用的所有酶诸如限制性核酸内切酶，连接酶等来自New England Biolabs，Inc.实施例实施例1：鉴定从不同芽孢杆菌获取的其它ppGpp合成酶PCR反应。对菌落：

将重新分离的在含有10μg/ml卡那霉素，10mM磷酸钾pH7.0及0.4％葡萄糖的LB琼脂平板上培养18小时的菌落悬浮于10μl1×PCR缓冲液(Super Taq^TM DNA聚合酶)中加热至96℃5分钟，20000×g离心2分钟。从上清中取5μl用作PCR反应(30循环)的模板，使用下面的不同引物和Super Taq^TM DNA聚合酶并遵循制造商的说明(Enzyme technologies Ltd.)。

PCR反应的引物。使用了含有与序列1中所示枯草芽孢杆菌relA-Bac序列(下面划线)相同的寡聚核苷酸组分的DNA引物(引物：#104775至#104780)扩增来自枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的DNA片段。

与序列1所示DNA序列相关的位置。下面未划线的引物序列是用于克隆目的的接头序列，含有限制性酶消化的适当位点。

用于来自枯草芽孢杆菌的relA-Bac基因5′末端的引物(有义引物)#104775：5′-CCG AAT TCA AAG GTG ATT CCA TGG CGA ACG-3′(位置：9至30)#104776：5′-CCG AAT TCG GTG ATT CCA TGG CGA ACG-3′(位置12至30)

用于枯草芽孢杆菌relA-Bac基因内部部分3′-末端的引物(反义引物)#104777：5′-GCG GAT CCG CTT TAG GCC C-3′(位置：987至969)。#104778：5′-CAT GCA TTT CAA AGG TGC GG-3′(位置：1020至1001)

用于枯草芽孢杆菌relA-Bac基因3′-末端的引物(反义引物)#104779：5′-CCT TTA GTT CAT GAC GCG GCG C-3′(位置：2228至2207)#104780：5′-GTG TTT AGC GGC CGC TGA ACA ACT AAT CTC-3′(位置：2227至2256)#113554：5′-ATA AGC ATG CGC TGA ACA ACT AAT CTC-3′(位置：2256至2239)。PCR产物的检测。在含有溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶上检测了来自枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌的PCR产物以确定是否有DNA存在并且如果存在，估计DNA的大小。获得的PCR产物的预期大小。

解淀粉芽孢杆菌：使用引物104775，104777，PCR片段大小约为980碱基对(bp)。

迟缓芽孢杆菌：使用引物104775，104777，PCR片段大小大约为980bp和680bp。两种PCR片段均可用于进一步克隆迟缓芽孢杆菌的ppGpp合成酶。

地衣芽孢杆菌：使用引物104776，104778，PCR片段大小大约为800bp；使用引物104776，104779，PCR片段大小大约1900bp。

将PCR扩增的DNA片段测序并使用此序列资料克隆依据本发明的解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌的ppGpp合成酶。按照本技术领域标准方法进行克隆。解淀粉芽孢杆菌全长ppGpp合成酶的克隆：

使用由引物104775，104777(参看上面)以及PCR(反义)引物#113554扩增的大小约980bp的解淀粉芽孢杆菌PCR片段，从解淀粉芽孢杆菌菌株获得了一段PCR片段并按照制造商的方法在自动DNA测序仪上进行DNA测序。

此DNA序列及相应的成熟蛋白质序列显示于序列3和4中。实施例2：同源性/预测的基础：

本发明部分基于从枯草芽孢杆菌菌株获得的编码具ppGpp合成酶活性并与其它微生物ppGpp合成酶同源的多肽的新多核苷酸序列的发现。该多肽命名为relA-Bac。

定义本发明具有ppGpp合成酶活性的新多肽的标准最初是通过查询众所周知的数据库Genebank(EMBL，Heidelberg)中与本发明的新relA-Bac序列同源的序列来鉴定的。

使用此处进一步详细描述(参看下文)的常规百分数序列相同程序，relA-Bac(序列1)与本领域已知的ppGpp合成酶的DNA序列相同性显示于下面的表1，并且相应的氨基酸序列相同性显示于表II。表II。DNA序列间的同源性。用于相似性的序列是来自EMBL的Genebank记录的编码DNA序列(CDS)，其基因座列于表中。GB_BA：  SEDEXB！X72832 S.equisimilisGB_BA：  VSU13769！U13769 Vibrio sp.GB_BA：  ECOSPOT ！M24503 E.coliGB_BA：  ECORELA ！J04039 E.coli

GB_BA：	bsrela.orf	ecorela.orf	ecospot.orf	sedexb.orf	vsu13769.orf
						relA-Bac	100	50	51	59	50
ecorela.orf	50	100	48	49	62
						ecospot.orf	51	48	100	51	45
sedexb.orf	59	49	51	100	49
						vsu13769.orf	50	62	45	49	100

上面的DNA序列编码的肽序列间的同源性。

	Bsrela.pep	ecorela.pep	ecospot.pep	sedexb.pep	vsu13769.pep
						relA-Bac	100	38	41	53	37
ecorela.pep	38	100	32	36	65
						ecospot.pep	41	32	100	42	32
sedexb.pep	53	36	42	100	34
						vsu13769.pep	37	65	32	34	100

从以上可以知道，虽然此处为了说明的目的描述了本发明的特定实施方案，但在不偏离本发明精神和范围情况下可以进行多种改变。相应地，本发明不受除了所附的权利要求书之外的限制。

此外，要求作为此申请优先权的丹麦专利申请DK 0726/97，以及随同此申请的摘要中的公开内容，以参考文献并于本发明。

序列表

序列1显示分离的本发明多核苷酸序列，含有编码表现ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。多肽命名为relA-Bac，来自枯草芽孢杆菌菌株。

(2)序列资料1

  (i)序列特征

    (A)长度：2278碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (vi)最初来源

    (A)生物体：relA-bac

    (B)菌株：枯草芽孢杆菌

  (ix)特征：

    (A)名字/关键词：CDS

    (B)位置：21..2222

  (xi)序列描述：序列1ATTTTAAAAA AGGTGATTCC ATG GCG AAC GAA CAA GTA TTG ACT GCC GAG          50

                  Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu

                    1               5                  10CAA GTT ATA GAT AAA GCA CGC AGC TAT CTA TCT GAT GAG CAT ATC GCA        98Gln Val Ile Asp Lys Ala Arg Ser Tyr Leu Ser Asp Glu His Ile Ala

             15                  20                  25TTT GTC GAA AAA GCA TAT CTG TAC GCT GAA GAT GCT CAT CGC GAG CAA       146Phe Val Glu Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Glu Asp Ala His Arg Glu Gln

         30                  35                  40TAC CGC AAA TCG GGC GAG CCA TAT ATT ATT CAT CCG ATT CAG GTT GCG       194Tyr Arg Lys Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala

     45                  50                  55GGG ATA CTC GTT GAT CTT GAA ATG GAC CCT TCC ACA ATC GCG GGC GGA       242Gly Ile Leu Val Asp Leu Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly

 60                  65                  70TTT TTG CAC GAT GTC GTG GAA GAT ACA GAT GTG ACG CTC GAT GAC CTG       290Phe Leu His Asp Val Val Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu75                  80                  85                  90AAA GAA GCA TTT TCC GAA GAA GTG GCA ATG CTT GTA GAC GGC GTA ACG       338Lys Glu Ala Phe Ser Glu Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr

             95                 100                 105AAA CTC GGC AAA ATT AAA TAT AAA TCT CAA GAG GAA CAG CAG GCG GAA       386Lys Leu Gly Lys Ile Lys Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu

        110                 115                 120AAT CAT CGC AAA ATG TTT GTC GCT ATG GCT CAA GAT ATC AGG GTC ATA       434Asn His Arg Lys Met Phe Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile

    125                 130                 135TTG ATC AAG CTG GCG GAT CGT CTT CAC AAT ATG CGG ACA CTG AAA CAT       482Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His

140                 145                 150CTG CCT CAG GAA AAA CAG CGG AGA ATC TCC AAT GAA ACG CTG GAA ATT       530Leu Pro Gln Glu Lys Gln Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile155                 160                 165                 170TTT GCT CCT TTG GCG CAT CGT CTC GGG ATT TCA AAA ATT AAG TGG GAA       578Phe Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu

            175                 180                 185TTG GAA GAT ACG GCG CTC CGT TAT TTG AAC CCT CAG CAA TAT TAC AGA       626Leu Glu Asp Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg

        190                 195                 200ATT GTC AAC CTC ATG AAG AAG AAA CGT GCA GAA CGA GAG CTT TAT GTC       674Ile Val Asn Leu Met Lys Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val

    205                 210                 215GAT GAG GTT GTC AAT GAA GTG AAG AAA CGT GTC GAA GAA GTA AAT ATC       722Asp Glu Val Val Asn Glu Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile

220                 225                 230AAG GCT GAC TTC TCG GGA CGC CCG AAA CAT ATT TAC AGC ATT TAT CGA       770Lys Ala Asp Phe Ser Gly Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg235                 240                 245                 250AAA ATG GTG CTG CAA AAT AAG CAA TTC AAT GAA ATT TAC GAT TTG TTG       818Lys Met Val Leu Gln Asn Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu

            255                 260                 265GCT GTC CGT ATT CTT GTG AAT AGC ATA AAG GAC TGC TAC GCG GTG CTT       866Ala Val Arg Ile Leu Val Asn Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu

        270                 275                 280GGC ATC ATT CAC ACA TGC TGG AAA CCG ATG CCA GGC AGA TTC AAA GAT       914Gly Ile Ile His Thr Cys Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp

    285                 290                 295TAT ATC GCA ATG CCG AAG CCG AAT ATG TAT CAA TCG CTT CAT ACA ACG       962Tyr Ile Ala Met Pro Lys Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr

300                 305                 310GTT ATT GGG CCT AAA GCG GAT CCG CTT GAA GTG CAG ATC CGC ACC TTT      1010Val Ile Gly Pro Lys Ala Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe315                 320                 325                 330GAA ATG CAT GAA ATA GCG GAA TAC GGG GTT GCG GCT CAC TGG GCT TAT      1058Glu Met His Glu Ile Ala Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr

            335                 340                 345AAA GAA GGG AAA GCA GCC AAT GAA GGT GCA ACC TTT GAG AAA AAG CTT      1106Lys Glu Gly Lys Ala Ala Asn Glu Gly Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu

        350                 355                 360TCT TGG TTC CGT GAA ATT TTA GAA TTT CAA AAT GAA TCG ACA GAT GCA      1154Ser Trp Phe Arg Glu Ile Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala

    365                 370                 375GAA GAA TTT ATG GAA TCG CTC AAA ATT GAT TTG TTC TCT GAC ATG GTG      1202Glu Glu Phe Met Glu Ser Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val

380                 385                 390TAT GTC TTT ACG CCA AAA GGA GAT GTA ATC GAG CTT CCG TCC GGT TCT      1250Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser395                 400                 405                 410GTT CCG ATT GAC TTT TCT TAC CGG ATT CAC TCT GAA ATC GGC AAT AAA      1298Val Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys

            415                 420                 425ACA ATC GGT GCC AAA GTA AAC GGA AAA ATG GTT ACG CTT GAC CAT AAG      1346Thr Ile Gly Ala Lys Val Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys

        430                 435                 440CTT CGG ACA GGT GAT ATC GTT GAA ATT CTC ACC TCT AAG CAT TCC TAC      1394Leu Arg Thr Gly Asp Ile Val Glu Ile Leu Thr Ser Lys His Ser Tyr

    445                 450                 455GGT CCG AGC CAG GAT TGG GTG AAG CTT GCC CAA ACA TCC CAA GCG AAG      1442Gly Pro Ser Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys

460                 465                 470CAT AAA ATC CGT CAA TTC TTT AAG AAA CAG CGG CGT GAA GAA AAT GTC      1490His Lys Ile Arg Gln Phe Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val475                 480                 485                 490GAA AAA GGC CGT GAG CTG GTC GAA AAA GAA ATT AAA AAC TTG GAT TTT      1538Glu Lys Gly Arg Glu Leu Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe

            495                 500                 505GAA TTG AAG GAT GTT TTA ACG CCG GAG AAT ATT CAA AAG GTT GCT GAC      1586Glu Leu Lys Asp Val Leu Thr Pro Glu Asn Ile Gln Lys Val Ala Asp

        510                 515                 520AAA TTT AAT TTC TCA AAT GAA GAG GAT ATG TAC GCG GCG GTC GGT TAC      1634Lys Phe Asn Phe Ser Asn Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr

    525                 530                 535AAC GGC ATC ACA GCT CTG CAG GTG GCG AAC CGC CTA ACA GAA AAA GAG      1682Asn Gly Ile Thr Ala Leu Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu

540                 545                 550AGA AAG CAG CGC GAC CAG GAA GAA CAG GAA AAG ATC GTT CAG GAA GTC      1730Arg Lys Gln Arg Asp Gln Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val555                 560                 565                 570ACT GGG GAA CCT AAG CCA TAC CCG CAA GGA AGA AAA CGG GAA GCT GGC      1778Thr Gly Glu Pro Lys Pro Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly

            575                 580                 585GTT CGT GTC AAG GGC ATT GAC AAC CTC CTT GTC CGT TTA TCA AAA TGC      1826Val Arg Val Lys Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys

        590                 595                 600TGC AAT CCT GTG CCA GGT GAT GAT ATT GTC GGC TTT ATC ACA AAA GGC      1874Cys Asn Pro Val Pro Gly Asp Asp Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly

    605                 610                 615AGA GGG GTT TCG GTC CAT CGC GAA GAC TGT CCG AAT GTC AAA ACG AAT      1922Arg Gly Val Ser Val His Arg Glu Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn

620                 625                 630GAA GCC CAA GAG CGG CTG ATC CCG GTA GAG TGG GAA CAT GAG TCA CAA      1970Glu Ala Gln Glu Arg Leu Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln635                 640                 645                 650GTT CAA AAG CGC AAG GAA TAC AAT GTT GAG ATA GAG ATT CTT GGG TAT      2018Val Gln Lys Arg Lys Glu Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr

            655                 660                 665GAC CGC CGC GGA TTG CTG AAC GAG GTA CTC CAG GCA GTG AAT GAA ACG      2066Asp Arg Arg Gly Leu Leu Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr

        670                 675                 680AAA ACC AAT ATT TCA TCT GTC TCT GGC AAA TCG GAT CGC AAT AAA GTG      2114Lys Thr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val

    685                 690                 695GCA ACC ATC CAT ATG GCG ATT TTT ATC CAG AAT ATC AAT CAC TTG CAT      2162Ala Thr Ile His Met Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His

700                 705                 710AAA GTC GTC GAG CGT ATT AAA CAG ATT AGA GAT ATC TAT TCT GTG CGC      2210Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg715                 720                 725                 730CGC GTC ATG AAC TAAAGGGGTT AGAAAAGAGA TTAGTTGTTC AGCGAGTAAC          2262Arg Val Met AsnAGAAGCAAGC GTTACA                                                    2278序列2显示本发明relA-Bac多肽的氨基酸序列(2)序列2资料(i)序列特征：

(A)长度：734氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列2Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu Gln Val Ile Asp Lys Ala1               5                  10                  15Arg Ser Tyr Leu Ser Asp Glu His Ile Ala Phe Val Glu Lys Ala Tyr

         20                  25                  30Leu Tyr Ala Glu Asp Ala His Arg Glu Gln Tyr Arg Lys Ser Gly Glu

     35                  40                  45Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala Gly Ile Leu Val Asp Leu

 50                  55                  60Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly Phe Leu His Asp Val Val65                  70                  75                  80Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu Lys Glu Ala Phe Ser Glu

             85                  90                  95Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Gly Lys Ile Lys

        100                 105                 110Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu Asn His Arg Lys Met Phe

    115                 120                 125Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp

130                 135                 140Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His Leu Pro Gln Glu Lys Gln145                 150                 155                 160Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile Phe Ala Pro Leu Ala His

            165                 170                 175Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu Leu Glu Asp Thr Ala Leu

        180                 185                 190Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg Ile Val Asn Leu Met Lys

    195                 200                 205Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val Asp Glu Val Val Asn Glu

210                 215                 220Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile Lys Ala Asp Phe Ser Gly225                 230                 235                 240Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Met Val Leu Gln Asn

            245                 250                 255Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Val

        260                 265                 270Asn Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu Gly Ile Ile His Thr Cys

    275                 280                 285Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp Tyr Ile Ala Met Pro Lys

290                 295                 300Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val Ile Gly Pro Lys Ala305                 310                 315                 320Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe Glu Met His Glu Ile Ala

            325                 330                 335Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu Gly Lys Ala Ala

        340                 345                 350Asn Glu Gly Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu Ser Trp Phe Arg Glu Ile

    355                 360                 365Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala Glu Glu Phe Met Glu Ser

370                 375                 380Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys385                 390                 395                 400Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser Val Pro Ile Asp Phe Ser

            405                 410                 415Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys Thr Ile Gly Ala Lys Val

        420                 425                 430Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys Leu Arg Thr Gly Asp Ile

    435                 440                 445Val Glu Ile Leu Thr Ser Lys His   r Tyr Gly Pro Ser Gln Asp Trp

450                 455                 460Val Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys His Lys Ile Arg Gln Phe465                 470                 475                 480Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Gly Arg Glu Leu

            485                 490                 495Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe Glu Leu Lys Asp Val Leu

        500                 505                 510Thr Pro Glu Asn Ile Gln Lys Val Ala Asp Lys Phe Asn Phe Ser Asn

    515                 520                 525Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Ala Leu

530                 535                 540Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu Arg Lys Gln Arg Asp Gln545                 550                 555                 560Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val Thr Gly Glu Pro Lys Pro

            565                 570                 575Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly Val Arg Val Lys Gly Ile

        580                 585                 590Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys Cys Asn Pro Val Pro Gly

    595                 600                 605Asp Asp Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly Arg Gly Val Ser Val His

610                 615                 620Arg Glu Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn Glu Ala Gln Glu Arg Leu625                 630                 635                 640Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln Val Gln Lys Arg Lys Glu

            645                 650                 655Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr Asp Arg Arg Gly Leu Leu

        660                 665                 670Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr Lys Thr Asn Ile Ser Ser

    675                 680                 685Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val Ala Thr Ile His Met Ala

690                 695                 700Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His Lys Val Val Glu Arg Ile705                 710                 715                 720Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg Arg Val Met Asn

            725                 730

序列3显示分离的本发明多核苷酸序列，含有编码表现ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。多肽命名为relA-BacII并从解淀粉芽孢杆菌菌株获得。

(2)序列3资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：2239碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (vi)最初来源

    (A)生物体：relA-bacII

    (B)菌株：解淀粉芽孢杆菌

  (ix)特征：

    (A)名字/关键词：CDS

    (B)位置：21..2225

  (xi)序列描述：序列3：CATTTAAAAA AGGTGATTCC ATG GCG AAC GAA CAA GTA TTG ACT GCC GAG          50

                  Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu

                    1               5                  10CAA GTA ATA GAT AAA GCG CGC ACT TAT CTG CCG GAG GAG CAG ATT GCG        98Gln Val Ile Asp Lys Ala Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Ile Ala

             15                  20                  25TTT GTT GAG AAA GCT TAT CTG TAT GCG CAA GAC GCG CAT CGC GAA CAG       145Phe Val Glu Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Gln Asp Ala His Arg Glu Gln

         30                  35                  40TAT CGC AAA TCA GGT GAG CCG TAC ATC ATT CAT CCG ATT CAG GTG GCG       194Tyr Arg Lys Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala

     45                  50                  55GGA ATC CTC GTC GAT CTG GAA ATG GAC CCT TCC ACG ATT GCG GGC GGA       242Gly Ile Leu Val Asp Leu Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly

 60                  65                  70TTT CTG CAT GAC GTG GTC GAG GAC ACG GAT GTC ACC CTC GAT GAC CTG       290Phe Leu His Asp Val Val Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu75                  80                  85                  90AAG GAA GCA TTT TCT GAA GAA GTG GCG ATG CTT GTC GAC GGT GTA ACG       338Lys Glu Ala Phe Ser Glu Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr

             95                 100                 105AAG CTC GGT AAA ATT AAG TAT AAA TCT CAA GAG GAG CAG CAG GCG GAA       386Lys Leu Gly Lys Ile Lys Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu

        110                 115                 120AAC CAT CGA AAA ATG TTT GTC GCT ATG GCT CAG GAT ATC AGA GTC ATA       434Asn His Arg Lys Met Phe Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile

    125                 130                 135TTG ATC AAG CTG GCG GAT CGC CTT CAT AAT ATG CGG ACG TTA AAG CAT       482Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His

140                 145                 150CTT CCG CAG GAA AAG CAG CGG AGA ATT TCA AAT GAG ACG CTG GAA ATC       530Leu Pro Gln Glu Lys Gln Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile155                 160                 165                 170TTC GCT CCG CTG GCC CAT CGG CTC GGG ATT TCT AAG ATC AAA TGG GAG       578Phe Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu

            175                 180                 185CTT GAA GAC ACC GCT CTC CGT TAT TTG AAT CCT CAG CAA TAT TAC AGA       626Leu Glu Asp Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg

        190                 195                 200ATC GTT AAC CTC ATG AAG AAA AAG CGC GCG GAA CGC GAA CTT TAT GTC       674Ile Val Asn Leu Met Lys Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val

    205                 210                 215GAT GAG GTT GTC AAT GAA GTG AAA AAA CGC GTC GAA GAA GTG AAT ATC       722Asp Glu Val Val Asn Glu Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile

220                 225                 230AAA GCG GAC TTT TCA GGC CGT CCG AAG CAC ATC TAC AGC ATT TAC CGC       770Lys Ala Asp Phe Ser Gly Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg235                 240                 245                 250AAG ATG GCG CTG CAA AAT AAA CAG TTT AAT GAA ATA TAT GAT CTG CTC       818Lys Met Ala Leu Gln Asn Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu

            255                 260                 265GCC GTC CGT ATT CTT GTC GGA AGC ATT AAA GAC TGC TAC GCC GTA CTC       866Ala Val Arg Ile Leu Val Gly Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu

        270                 275                 280GGC ATT ATT CAT ACG TGC TGG AAG CCG ATG CCG GGC AGA TTC AAA GAT       914Gly Ile Ile His Thr Cys Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp

    285                 290                 295TAT ATT GCG ATG CCT AAG CCG AAT ATG TAT CAG TCC CTG CAT ACG ACA       962Tyr Ile Ala Met Pro Lys Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr

300                 305                 310GTA ATC GGG CCT AAA GGC GAT CCG CTG GAA GTG CAG ATC AGA ACG TTT      1010Val Ile Gly Pro Lys Gly Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe315                 320                 325                 330GAG ATG CAT GAG ATC GCT GAA TAC GGG GTG GCT GCA CAC TGG GCA TAT      1058Glu Met His Glu Ile Ala Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr

            335                 340                 345AAA GAA GGC AAG GCT GCA AAC GAA GAA GCG ACA TTT GAG AAA AAA CTG      1106Lys Glu Gly Lys Ala Ala Asn Glu Glu Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu

        350                 355                 360TCC TGG TTC CGC GAA ATT CTG GAA TTC CAA AAC GAA TCT ACC GAT GCG      1154Ser Trp Phe Arg Glu Ile Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala

    365                 370                 375GAA GAA TTT ATG GAA TCG CTG AAA ATC GAT TTA TTT TCT GAC ATG GTA      1202Glu Glu Phe Met Glu Ser Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val

380                 385                 390TAC GTA TTT ACG CCA AAA GGC GAT GTC ATT GAA CTG CCG TCA GGC TCT      1250Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser395                 400                 405                 410GTA CCG ATT GAT TTT TCC TAC AGG ATT CAC TCC GAG ATC GGC AAC AAA      1298Val Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys

            415                 420                 425ACC ATC GGA GCG AAA GTG AAC GGG AAA ATG GTG ACG CTT GAC CAT AAG      1346Thr Ile Gly Ala Lys Val Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys

        430                 435                 440CTC CGG ACG GGC GAC ATT GTC GAA ATC GTG ACG TCC AAG CAT TCA TAC      1394Leu Arg Thr Gly Asp Ile Val Glu Ile Val Thr Ser Lys His Ser Tyr

    445                 450                 455GAT CCG AGT CAA GAC TGG ATC AAA CTC GCA CAG ACG TCA CAG GCG AAA      1442Asp Pro Ser Gln Asp Trp Ile Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys

460                 465                 470CAC AAA ATC CGC CAA TTC TTC AAG AAA CAG CGC CGT GAA GAA AAT GTC      1490His Lys Ile Arg Gln Phe Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val475                 480                 485                 490GAA AAA GGC CGT GAG CTG GTC GAA AAA GAA ATT AAA AAT CTT GAT TTT      1538Glu Lys Gly Arg Glu Leu Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe

            495                 500                 505GAA GTG AAG GAA GTT TTA ACG CTC GAA AAC CTT CAA AAG GTT GCC GAC      1586Glu Val Lys Glu Val Leu Thr Leu Glu Asn Leu Gln Lys Val Ala Asp

        510                 515                 520AAG TTC AAT TTC TCA AAT GAA GAG GAT ATG TAC GCG GCG GTC GGG TAT      1634Lys Phe Asn Phe Ser Asn Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr

    525                 530                 535AAC GGG ATT ACC GCT TTG CAG GTG GCA AAC AGG CTC ACC GAA AAA GAA      1682Asn Gly Ile Thr Ala Leu Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu

540                 545                 550CGG AAG CTG CGT GAT CAG GAA GAG CAG GAA AAA ATC GTT CAG GAA GTC      1730Arg Lys Leu Arg Asp Gln Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val555                 560                 565                 570ACT TCC GAG CCG AAA CAG TAT CCG CAA GGG AGA AAA CGG GAA GCG GGT      1778Thr Ser Glu Pro Lys Gln Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly

            575                 580                 585GTG CGC GTG AAA GGC ATC GAC AAC CTT CTC GTC CGT CTG TCG AAA TGC      1826Val Arg Val Lys Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys

        590                 595                 600TGC AAC CCG GTG CCA GGC GAT CAT ATT GTC GGT TTT ATT ACA AAA GGG      1874Cys Asn Pro Val Pro Gly Asp His Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly

    605                 610                 615CGC GGT GTA TCC GTT CAC CGT GAT GAC TGT CCG AAC GTA AAA ACG AAT      1922Arg Gly Val Ser Val His Arg Asp Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn

620                 625                 630GAA GCG CAG GAA CGA TTG ATC CCT GTT GAA TGG GAG CAT GAA TCA CAA      1970Glu Ala Gln Glu Arg Leu Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln635                 640                 645                 650GTT CAA AGA CGC AAA GAA TAT AAC GTT GAG ATT GAG ATT CTG GGG TAT      2018Val Gln Arg Arg Lys Glu Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr

            655                 660                 665GAC CGT CTC GGG CTG TTA AAT GAA GTG CTT CAG GCC GTA AAC GAA ACG      2066Asp Arg Leu Gly Leu Leu Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr

        670                 675                 680AAA ACC AAC ATC TCG TCT GTC TCG GGC AAA TCC GAC CGC AAT AAA GTC      2114Lys Thr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val

    685                 690                 695GCT ACG ATT CAT ATG GCG ATT TTT ATT CAA AAC ATC AAT CAT CTG CAC      2162Ala Thr Ile His Met Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His

700                 705                 710AAA GTG GTC GAG CGG ATT AAG CAG ATC AGA GAC ATA TAT TCA GTC CGC      2210Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg715                 720                 725                 730CGG GTA ATG AAC TAA AAGGAGCTTG CTAT                                  2239Arg Val Met Asn  *

            735序列4显示本发明relA-BacII多肽的氨基酸序列(2)序列4资料：(i)序列特征：

(A)长度：735氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列4Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu Gln Val Ile Asp Lys Ala1               5                  10                  15Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Ile Ala Phe Val Glu Lys Ala Tyr

         20                  25                  30Leu Tyr Ala Gln Asp Ala His Arg Glu Gln Tyr Arg Lys Ser Gly Glu

     35                  40                  45Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala Gly Ile Leu Val Asp Leu

 50                  55                  60Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly Phe Leu His Asp Val Val65                  70                  75                  80Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu Lys Glu Ala Phe Ser Glu

             85                  90                  95Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Gly Lys Ile Lys

        100                 105                 110Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu Asn His Arg Lys Met Phe

    115                 120                 125Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp

130                 135                 140Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His Leu Pro Gln Glu Lys Gln145                 150                 155                 160Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile Phe Ala Pro Leu Ala His

            165                 170                 175Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu Leu Glu Asp Thr Ala Leu

        180                 185                 190Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg Ile Val Asn Leu Met Lys

    195                 200                 205Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val Asp Glu Val Val Asn Glu

210                 215                 220Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile Lys Ala Asp Phe Ser Gly225                 230                 235                 240Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Met Ala Leu Gln Asn

            245                 250                 255Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Val

        260                 265                 270Gly Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu Gly Ile Ile His Thr Cys

    275                 280                 285Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp Tyr Ile Ala Met Pro Lys

290                 295                 300Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val Ile Gly Pro Lys Gly305                 310                 315                 320Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe Glu Met His Glu Ile Ala

            325                 330                 335Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu Gly Lys Ala Ala

        340                 345                 350Asn Glu Glu Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu Ser Trp Phe Arg Glu Ile

    355                 360                 365Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala Glu Glu Phe Met Glu Ser

370                 375                 380Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys385                 390                 395                 400Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser Val Pro Ile Asp Phe Ser

            405                 410                 415Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys Thr Ile Gly Ala Lys Val

        420                 425                 430Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys Leu Arg Thr Gly Asp Ile

    435                 440                 445Val Glu Ile Val Thr Ser Lys His Ser Tyr Asp Pro Ser Gln Asp Trp

450                 455                 460Ile Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys His Lys Ile Arg Gln Phe465                 470                 475                 480Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Gly Arg Glu Leu

            485                 490                 495Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe Glu Val Lys Glu Val Leu

        500                 505                 510Thr Leu Glu Asn Leu Gln Lys Val Ala Asp Lys Phe Asn Phe Ser Asn

    515                 520                 525Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Ala Leu

530                 535                 540Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu Arg Lys Leu Arg Asp Gln545                 550                 555                 560Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val Thr Ser Glu Pro Lys Gln

            565                 570                 575Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly Val Arg Val Lys Gly Ile

        580                 585                 590Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys Cys Asn Pro Val Pro Gly

    595                 600                 605Asp His Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly Arg Gly Val Ser Val His

610                 615                 620Arg Asp Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn Glu Ala Gln Glu Arg Leu625                 630                 635                 640Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln Val Gln Arg Arg Lys Glu

            645                 650                 655Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr Asp Arg Leu Gly Leu Leu

        660                 665                 670Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr Lys Thr Asn Ile Ser Ser

    675                 680                 685Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val Ala Thr Ile His Met Ala

690                 695                 700Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His Lys Val Val Glu Arg Ile705                 710                 715                 720Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg Arg Val Met Asn  *

            725                 730                 735

Claims (18)

1.选自下列组中的分离的多核苷酸分子：

(a)编码具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列1所示核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)(a)的物种同系物；

(c)编码具ppGpp合成酶活性的至少与序列2从氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸序列70％相同的多肽的多核苷酸分子；

(d)与(a)，(b)或(c)互补的分子；以及

(e)(a)，(b)，(c)或(d)的简并核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸分子编码具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列3所示从核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列。

3.含有下列可操作连接元件的表达载体：一个转录启动子；一段选自下列组中的DNA片段：

(a)编码具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列1所示从核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)(a)的物种同系物；

(c)编码具ppGpp合成酶活性的至少与序列2从氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸序列70％相同的多核苷酸分子；以及

(d)(a)，(b)，或(c)的简并核苷酸序列；以及一个转录终止子。

4.引入了权利要求3的表达载体的培养细胞，其中上述细胞表达由DNA片段编码的多肽。

5.选自下列组中的具有ppGpp合成酶活性的分离的多肽：

a)含有序列2所示从残基1至残基734的氨基酸序列的多肽分子；以及

b)与序列2从氨基酸残基1至氨基酸残基734的氨基酸至少70％相同的多肽分子。

6.含有权利要求5的纯化的多肽的组合物。

7.生产具ppGpp合成酶活性的多肽的一种方法，包括：

培养引入了权利要求3表达载体的细胞，其中上述细胞表达由DNA片段编码的多肽；以及

回收该多肽。

8.用于在革兰氏阳性细菌中改善至少一种感兴趣蛋白的产生的表达系统，其中表达系统含有比野生型表达更少量的权利要求5的多肽的革兰氏阳性细菌。

9.权利要求8的表达系统，其中上述芽孢杆菌菌种是枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillus clausii，或特别地是地衣芽孢杆菌。

10.权利要求8-9中任一个表达系统，其中上述感兴趣蛋白质是使用一种表达载体重组产生的。

11.权利要求8-10中任一个表达系统，其中上述感兴趣蛋白质是一种同源蛋白质。

12.权利要求8-10中任一个表达系统，其中上述感兴趣蛋白质是一种异源蛋白质。

13.权利要求10-12中任一个表达系统，其中上述蛋白质是一种外蛋白质并是使用表达载体表达的。

14.权利要求8-13中任一个表达系统，其中上述感兴趣蛋白质，优选地是一种外蛋白，是一种蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支链淀粉酶，纤维素酶，葡糖异构酶，蛋白质二硫键异构酶，CGT酶(环化糊精葡糖酸转移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，木聚糖酶，细菌蛋白质毒素，微生物表面蛋白质，病毒蛋白质，药物。

15.权利要求8-14中任一个表达系统，其中上述革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌属的菌株。

16.权利要求15的表达系统，其中上述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillus Clausii，或地衣芽孢杆菌。

17.在革兰氏阳性细菌中改善生产至少一种感兴趣蛋白质的方法，该方法包括：

i)培养权利要求8到16中任一个表达系统；以及

ii)从产生的培养肉汤或表达系统纯化上述感兴趣蛋白质。

18.权利要求17的方法，其中的培养是通过补料分批发酵完成的。