CN107245471A - 一种重组吸水链霉菌及其在提高井冈霉素a产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组吸水链霉菌及其在提高井冈霉素A产量中的应用，所述重组吸水链霉菌是将糖基转移酶基因valG、UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶基因galU和葡萄糖磷酸变位酶基因pgm导入吸水链霉菌获得的。本发明所述工程菌S.hygroscopicus 5008‑valG‑galU‑pgm发酵产井冈霉素A的量为6.103g/L，相同情况下原始菌株产量为5.366g/L，工程菌比原始吸水链霉菌株井冈霉素A产量提高了13.73％，同时井冈霉素A与井冈羟胺A的比值从3.972提高到了4.458，井冈羟胺A的积累也明显降低。

Description

一种重组吸水链霉菌及其在提高井冈霉素A产量中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种对井冈霉素A发酵生产菌株的基因工程改造，即将糖基转移酶基因valG和UDPG合成途径中galU和pgm的关键酶基因过量表达，提高井冈霉素A的合成能力。
(二)背景技术
井冈霉素高效低毒，对环境友好，不易发生真菌抗药性，是我国及东南亚水稻主产区用于防治水稻纹枯病、稻瘟病的主要生物农药之一。井冈霉素具有独特的作用机理，被真菌细吸收后水解成为井冈羟胺A，从而发挥抑菌作用。井冈羟胺A对海藻糖酶有强烈的抑制作用，在真菌细胞中海藻糖属于重要的贮藏类碳水化合物，通过海藻糖酶降解海藻糖来供应能量和葡萄糖。井冈羟胺A通过抑制海藻糖酶从而使真菌无法获得充足的葡萄糖，抑制菌丝的生长。研究表明，井冈羟胺A是井冈霉素类化合物中对海藻糖酶抑制剂作用最有效的，与海藻糖酶有极高的亲和力。这是因为井冈霉素A比井冈羟胺A更容易进入菌丝体，通过真菌体内的β-葡萄糖苷酶水解成井冈羟胺A，从而阻碍真菌的葡萄糖供应系统抑制其生长。
在链霉菌合成井冈霉素A的代谢途径研究方面，通过基因置换实验和回补实验证实了其合成途径中的valG基因发挥糖基转移功能，即利用UDP-葡萄糖(UDPG)，将井冈羟胺A糖基化合成井冈霉素A。UDPG作为糖基化底物，提高其胞内含量，有助于糖基化反应。如通过体外添UDPG，胞内UDPG含量的增加会提高井冈霉素A的产量，同时前体井冈羟胺A的量有所减少，从而初步证明增加UDPG的胞内含量可以促使井冈羟胺A向井冈霉素A转化。已有研究表明，通过基因工程手段过量表达UDPG焦磷酸化酶，显著可提高胞内UDPG的浓度。而在大肠杆菌中过量表达葡糖磷酸变位酶(pgm)和UDPG-焦磷酸化酶(galU)，UDPG产量提高近60％。所以，通过基因工程使UDPG合成的关键酶UDP-葡萄糖焦磷酸酶过量表达，同时提高糖基化酶VlaG的活性，预期可以提高S.hygroscopicus var.jinggangensis 5008的井冈霉素A合成能力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种加强井冈霉素A生产菌胞内糖基化反应的方法，即通过基因组整合型表达质粒pIJ8630-valG-galU-pgm，改造生产菌株基因组，实现胞内过量表达糖基转移酶ValG和UDPG合成途径中UDPG-焦磷酸化酶(galU)和葡糖磷酸变位酶(pgm)，促进井冈羟胺A糖基化生成井冈霉素A，提高井冈霉素A的产量。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组吸水链霉菌，所述重组吸水链霉菌是将糖基转移酶基因valG、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU和葡萄糖磷酸变位酶基因pgm导入吸水链霉菌获得的。
进一步，所述糖基转移酶基因valG核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。所述葡萄糖磷酸变位酶基因pgm核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
进一步，所述重组吸水链霉菌以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008为宿主菌。
本发明还提供一种所述重组吸水链霉菌在提高井冈霉素A产量中的应用。具体，所述的应用是将重组吸水链霉菌接种至发酵培养基，在35-40℃，180-220r/min培养，发酵结束后，取发酵液于12000r/min离心2min，上清液经0.22μm水膜过滤除菌，收集滤液(即含井冈霉素A溶液)，滤液提纯，获得井冈霉素A；所述发酵培养基终浓度组成为：玉米粉100g/L，黄豆饼粉25g/L，酵母粉50g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
进一步，所述重组吸水链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将重组吸水链霉菌接种到种子培养基中，37℃、220r/min恒温培养24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：玉米粉30g/L，黄豆饼粉22g/L(煮透、过滤去沉淀)、酵母粉10g/L，NaCl2g/L，KH2PO4 0.8g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
本发明所述重组吸水链霉菌工程菌的制备方法为：
(1)孢子悬浮液的制备
将保藏于-80℃冰箱的吸水链霉菌5008先划线活化，再挑取单菌落划YMS平板，37℃恒温培养箱中培养6天后，可以观察到菌落表面有青色孢子，还能闻到浓浓的土腥味，向平板中加入2ml左右灭菌好的蒸馏水，再用棉签将孢子轻轻刮下，制成102-105cfu/ml吸水链霉菌5008孢子悬浮液；YMS平板组成：酵母抽提物4g/L，可溶性淀粉4g/L，麦芽糖10g/L，CoCl·6H2O 5mg/L，琼脂粉20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.2；
(2)质粒从大肠杆菌到吸水链霉菌的接合转移
1)将重组E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)接种到液体LB(安普霉素50μg/ml)中，37℃、180r/min摇床培养4小时(OD600在0.4-0.6)收集菌体；菌体用新鲜的LB把安普霉素冲洗掉，然后用0.1倍体积的LB悬浮，制得E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)细胞悬浮液；2)新鲜S.hygroscopicus 5008的孢子悬浮液：取步骤(1)制备的吸水链霉菌5008孢子悬浮液按体积比1:2.5加入到pH7.5、0.05MTES缓冲液中，50℃水浴10min；冷却到室温后加入等体积孢子萌发培养基；在180r/min、37℃培养箱中培养3h；8000rpm离心2min后，沉淀用无菌蒸馏水悬浮后加入等体积SOC培养基中，50℃水浴10min，离心去大部分上清，形成新的吸水链霉菌5008孢子悬浮液；3)共培养和接合转化：按体积比1:2的比例，将新的吸水链霉菌5008孢子悬浮液和步骤1)E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)细胞悬浮液混合，涂布LB平板，在30℃培养20h后加入安普霉素(终浓度50μg/ml)和萘啶酮酸(终浓度50μg/ml)覆盖，然后37℃再培养2天得到接合转化子，挑选接合转化子到含终浓度50μg/ml安普霉素和终浓度50μg/ml萘啶酮酸的YMS平板上，37℃培养7-10天并镜检，将成功构建的工程菌记为重组吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm；所述孢子萌发培养基质量终浓度组成：酵母膏1％，酪蛋白氨基酸1％，CaCl2 0.1mol/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。所述SOC培养基终浓度组成：胰蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、NaCl 0.05g/L、KCl 2.5mM、MgCl2 10mM、葡萄糖20mM，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明所述工程菌S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm发酵产井冈霉素A的量为6.103g/L，相同情况下原始菌株产量为5.366g/L，工程菌比原始吸水链霉菌株井冈霉素A产量提高了13.73％，同时井冈霉素A与井冈羟胺A的比值从3.972提高到了4.458，井冈羟胺A的积累也明显降低。
(四)附图说明
图1糖基转移酶valG、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶galU及葡萄糖磷酸变位酶pgm的PCR扩增电泳图，其中M：10000DNA Marker；1：valG PCR产物；2：galU PCR产物；3：pgm PCR产物。
图2pMD19-T-valG、pMD19-T-galU及pMD19-T-pgm质粒的单双酶切电泳图，其中M：10000DNA Marker；1、2、3：质粒pMD19-T-valG、pMD19-T-galU、pMD19-T-pgm单酶切；4、5、6：质粒pMD19-T-valG、pMD19-T-galU、pMD19-T-pgm双酶切。
图3pIJ8630-valG、pIJ8630-valG-galU、pIJ8630-valG-galU-pgm单酶切电泳图，其中M：15000DNA Marker；1：pIJ8630-valG；2：pIJ8630-valG-galU；3：pIJ8630-valG-galU-pgm。
图4pIJ8630-valG、pIJ8630-valG-galU、pIJ8630-valG-galU-pgm双酶切电泳图，其中M：15000DNA Marker；1：pIJ8630-valG；2：pIJ8630-valG-galU；3：pIJ8630-valG-galU-pgm。
图5井冈霉素A标品HPLC检测图。
图6井冈霉素A标准曲线。
图7井冈羟胺A标品HPLC检测图。
图8井冈羟胺A标准曲线。
图9原始吸水链霉菌5008和重组吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm不同时间段发酵产井冈霉素A的量。其中1：吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008)；2：重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG)；3：重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus5008-valG-galU)；4:重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm)。
图10原始吸水链霉菌5008和重组吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm不同时间段发酵产井冈羟胺A的量。其中1：吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008)；2：重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG)；3：重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus5008-valG-galU)；4:重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm)。
图11重组质粒pIJ8630-valG构建示意图。
图12重组质粒pIJ8630-valG-galU构建示意图。
图13重组质粒pIJ8630-valG-galU-pgm构建示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：valG、galU和pgm的TA克隆及验证
(1)valG、galU、pgm的PCR扩增
在NCBI数据库中查出S.hygroscopicus subsp.Jinggangensis中valG基因的序列，根据基因序列和选择的酶切位点设计上下游引物，如表1，valG gene F1，valG geneR1。再以提取的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008基因组为模板进行PCR，反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，57℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸2min。用质量分数为0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，以DNAMarker(DL 10000)为对照。
表1PCR体系
同理，在NCBI数据库中找到E.coli JM109中galU、pgm基因的序列，根据基因序列和选择的酶切位点设计上下游引物，如下表2所示。再以galU、pgm基因为DNA模板，反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，57℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸2min。用琼脂糖凝胶电泳鉴定，以DNA Marker(DL 10000)为对照，如图1。
表2ValG、galU、pgm的PCR扩增引物
(2)ValG、galU、pgm分别与pMD19-T载体的连接
将上述的PCR扩增产物，分别进行电泳分离，胶回收，之后分别与T-Vector pMD19连接，于16℃连接1h。将连接产物分别转化到E.coli DH5α中，通过蓝白斑筛选得到T载体重组产物。
(3)重组质粒的验证
挑选步骤(2)白色菌落接种至LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，并提取质粒然后PCR跑胶验证。由于大肠杆菌基因组中含有galU及pgm基因序列，不能用菌落PCR，结合质粒的单酶切和双酶切验证和阳性质粒测序验证，将ValG、galU及pgm基因的克隆转化子分别命名为pMD19-T-valG、pMD19-T-galU、pMD19-T-pgm，其中pMD19-T-valG、pMD19-T-galU及pMD19-T-pgm质粒的单双酶切电泳图，如图2。
实施例2：pIJ8630-valG-galU-pgm共表达载体的构建及验证
(1)valG基因(即实施例1获得的质粒pMD19-T-valG)与穿梭质粒pIJ8630的双酶切。
于37℃酶切8h，将双酶切产物，通过跑琼脂糖电泳(1％w/v)，并按DNA胶回收试剂盒对双酶切产物进行回收，再跑琼脂糖电泳(1％w/v)验证浓度。
(2)valG基因与穿梭质粒pIJ8630的连接
用Ligation high Ver.2高效连接酶在16℃连接1h。
(3)重组质粒转化
将10μL反应连接液加到在冰上预冷30min的ET12567感受态细胞中，冰浴20min；然后在42℃热击70s，再冰浴2min；加入800μL新鲜无菌的LB液体培养基，于37℃摇床条件下复苏60min；最后将转化液浓缩后涂布于含安普霉(50μg/ml)LB筛选平板上，于37℃培养过夜。
(4)阳性转化子的筛选及验证
挑取安普霉素抗性LB平板中的单菌落进行菌落PCR，在PCR排管中每管加入10μL无菌水，用无菌牙签蘸取菌体于PCR排管，在PCR仪中98℃保持10min，作为菌落PCR模板。参照表1进行PCR扩增并筛选得到含有重组质粒pIJ8630-valG的阳性转化子。PCR程序为:
(5)galU与pIJ8630-valG的双酶切、连接、转化及验证
pMD19-T-galU、pIJ8630-valG质粒双酶切体系
galU、pIJ8630-valG质粒连接体系
先37℃双酶切8h，再16℃连接1h。将连接液转化到感受态ET12567中并验证，得到转化子pIJ8630-valG-galU。
(6)pgm与pIJ8630-ValG-galU的双酶切、连接、转化及验证
pMD19-T-pgm、pIJ8630-valG-galU质粒双酶切体系
pgm、pIJ8630-valG-galU质粒连接体系
先37℃双酶切8h，再16℃连接1h。将连接液转化到感受态ET12567中并验证，得到转化子，提取质粒后双酶切验证，其中重组质粒pIJ8630-valG、pIJ8630-valG-galU、pIJ8630-valG-galU-pgm单双酶切图如图3和图4，最终获得重组大肠杆菌E.coliET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)。
实施例5：重组吸水链霉菌的转化
(1)孢子悬浮液的制备
将保藏于-80℃冰箱的吸水链霉菌5008先划线活化，再挑取单菌落划YMS平板，37℃恒温培养箱中培养6天后，可以观察到菌落表面有青色孢子，还能闻到浓浓的土腥味。向平板中加入2ml左右灭菌好的蒸馏水，再用棉签将孢子轻轻刮下，形成102-105cfu/ml吸水链霉菌5008孢子悬浮液，然后用移液枪将102-105cfu/ml吸水链霉菌5008孢子悬浮液转移至灭菌后的2ml EP管中，加入甘油保藏于-20℃冰箱。YMS平板组成：酵母抽提物4g/L，可溶性淀粉4g/L，麦芽糖10g/L，CoCl·6H2O 5mg/L，琼脂粉20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.2。
(2)质粒从大肠杆菌到吸水链霉菌的接合转移
1)将实施例4构建的E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)菌制成菌悬液，即E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)接种到液体LB(安普霉素50μg/ml)中，37℃180rpm摇床培养4小时(OD600在0.4-0.6)收集菌体；菌体用新鲜的LB把安普霉素冲洗掉，然后用0.1倍体积的LB悬浮，制得E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)细胞悬浮液备用。2)新鲜S.hygroscopicus 5008的孢子悬浮液：取2ml步骤(1)制备的吸水链霉菌5008孢子悬浮液加入到5ml pH7.5、0.05M TES缓冲液中，50℃水浴10min；冷却到室温后加入等体积孢子萌发培养基；在180rpm、37℃培养箱中培养3h；8000rpm离心2min，沉淀用无菌蒸馏水悬浮后取1ml加入1ml SOC培养基中，50℃水浴10min，离心去大部分上清，形成新的吸水链霉菌5008孢子悬浮液。3)共培养和接合转化：按体积比1:2的比例，将步骤2)新的吸水链霉菌5008孢子悬浮液和步骤1)E.coli ET12567(pIJ8630-valG-galU-pgm)细胞悬浮液混合，涂布LB平板，在30℃培养20h后加入安普霉素(终浓度50μg/ml)和萘啶酮酸(终浓度50μg/ml)覆盖，然后37℃再培养2天得到接合转化子。挑选接合转化子到含终浓度50μg/ml安普霉素和终浓度50μg/ml萘啶酮酸的YMS平板上，37℃培养7-10天并镜检，将成功构建的工程菌记为重组吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm。
所述孢子萌发培养基质量终浓度组成：酵母膏1％，酪蛋白氨基酸1％，CaCl20.1mol/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。所述SOC培养基终浓度组成：胰蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、NaCl 0.05g/L、KCl 2.5mM、MgCl2 10mM、葡萄糖20mM，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
采用同样的方法分别构建S.hygroscopicus 5008-valG，S.hygroscopicus 5008-valG-galU。
实施例6：发酵产井冈霉素A的检测
(1)种子培养
将重组S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm和原始吸水链霉菌5008的孢子悬浮液(同实施例5步骤(1))接种到已灭菌的种子培养基中，其中以不带导入基因的原始吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008为对照组，然后把种子培养基置于220r/min，37℃恒温摇床培养24h，获得种子液。每升种子培养基组成为：玉米粉30g，黄豆饼粉22g，(煮透、过滤去沉淀)、酵母粉10g，NaCl 2g，KH2PO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH自然。
(2)发酵培养
在灭好紫外的安全柜中操作，先将种子液混合均匀，再分别从4瓶种子液中吸取5ml种子液加入50ml已灭好菌的发酵培养基中，把摇瓶放置于37℃，220r/min培养，每组设置3个平行。在培养进行到24h、48h、72h、96h、120h时，每个摇瓶分别取1ml采用HPLC检测井冈霉素A的量。每升发酵培养基组成为：玉米粉100g，黄豆饼粉25g，酵母粉50g，NaCl 1g，KH2PO4 1.5g，蒸馏水1000ml，pH自然。
(3)井冈霉素A产量HPLC检测
样品处理：用移液枪取1ml发酵液置于1.5ml EP管中，用离心机于12000rpm离心2min，再将上清液移至新的离心管中，0.22μm的水膜过滤除菌，以此作为HPLC上样样品。
井冈霉素A标品处理：将井冈霉素A标准品，用超纯水配成0.00001g/ml，0.0001g/ml，0.001g/ml，0.01g/ml，0.1g/ml的溶液，进行HPLC检测，如图5。以浓度梯度为横坐标，6.221min处峰面积为纵坐标做标准曲线，如图6。
井冈羟胺A标品处理：将冈羟胺A标准品粉末，用超纯水配成0.00001g/ml，0.0001g/ml，0.001g/ml，0.01g/ml，0.1g/ml的溶液，进行HPLC检测，如图7。以浓度梯度为横坐标，4.443min处峰面积为纵坐标做标准曲线，如图8。
液相色谱条件：以体积比98:2的pH7.0磷酸盐缓冲液与甲醇为流动相，流速1ml/min检测波长210nm，Cl8柱，250×4.6mm，柱温25℃，进样量10μL。
(4)原始菌株和工程菌株的发酵情况
将4株菌S.hygroscopicus 5008，S.hygroscopicus 5008-valG，S.hygroscopicus5008-valG-galU，S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm分别接种发酵培养基，置于37℃，220rpm摇床中培养，每组设置3个平行样。培养进行到12h、24h、48h、72h、120h时，每个摇瓶分别取1ml发酵液，通过HPLC检测井冈霉素A和井冈羟胺A，如图9和图10。
将吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008)和3种重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus5008-valG，S.hygroscopicus 5008-valG-galU，S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm)在发酵12h、24h、48h、72h、120h时，通过HPLC检测出的井冈霉素A和井冈羟胺A的峰面积来算其在不同时段井冈霉素A和井冈羟胺A发酵产量。原始链霉菌株发酵到48h时井冈霉素A产量达到最高，产量为5.366g/L，构建的三种重组菌株在72h时井冈霉素A产值最高。重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG)发酵产井冈霉素A5.003g/L，重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG-galU)发酵产井冈霉素A 5.055g/L，重组吸水链霉菌(S.hygroscopicus 5008-valG-galU-pgm)发酵产井冈霉素A 6.103g/L，同时这四种菌株发酵中井冈霉素A和井冈羟胺A的比值分别为3.972，3.415，3.562，4.458，可见构建的前两种重组链霉菌井冈霉素A的产量并没有提高，反而比原始菌株产量低，导入三个基因的重组链霉菌比原始吸水链霉菌株产量提高了13.78％，同时井冈霉素A与井冈羟胺A的比值从3.975提高到了4.459，井冈羟胺A的积累也明显降低。

Claims (8)

1.一种重组吸水链霉菌，其特征在于所述重组吸水链霉菌是将糖基转移酶基因valG、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU和葡萄糖磷酸变位酶基因pgm导入吸水链霉菌获得的。
2.如权利要求1所述重组吸水链霉菌，其特征在于所述糖基转移酶基因valG核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述重组吸水链霉菌，其特征在于所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述重组吸水链霉菌，其特征在于所述葡萄糖磷酸变位酶基因pgm核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
5.如权利要求1所述重组吸水链霉菌，其特征在于所述重组吸水链霉菌以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008为宿主菌。
6.一种权利要求1所述重组吸水链霉菌在提高井冈霉素A产量中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用是将重组吸水链霉菌接种至发酵培养基，在35-40℃，180-220r/min培养，发酵结束后，取发酵液于12000r/min离心2min，上清液经0.22μm水膜过滤除菌，收集滤液，滤液提纯，获得井冈霉素A；所述发酵培养基终浓度组成为：玉米粉100g/L，黄豆饼粉25g/L，酵母粉50g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述重组吸水链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度5-10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将重组吸水链霉菌接种到种子培养基中，37℃、220r/min恒温培养24h，获得种子液；种子培养基组成为：玉米粉30g/L，黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L，NaCl 2g/L，KH2PO4 0.8g/L，溶剂为水，pH自然。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161573A (zh) * 2018-09-25 2019-01-08 浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司 一种井冈霉素发酵培养基及发酵方法
CN112899210A (zh) * 2021-03-08 2021-06-04 上海交通大学 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060097335A (ko) * 2005-03-07 2006-09-14 다인바이오 주식회사 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터와 이의 프라이머
CN101440357A (zh) * 2008-12-04 2009-05-27 上海交通大学 积累井冈霉亚基胺a的基因工程菌株及其构建方法
US8101732B2 (en) * 2008-09-17 2012-01-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Methods of producing validamycin A analogs and uses thereof
WO2013153554A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 Natco Pharma Limited Fermentation process for the production of rapamycin
CN103937856A (zh) * 2014-04-21 2014-07-23 浙江大学 一种提高井冈霉素产量的发酵方法
CN104593309A (zh) * 2015-01-06 2015-05-06 浙江工业大学 一种产udpg的重组工程菌及其应用
CN105754890A (zh) * 2015-12-21 2016-07-13 武汉科诺生物科技股份有限公司 一株产井冈霉素的吸水链霉菌及其应用
CN106434795A (zh) * 2016-09-19 2017-02-22 浙江大学 一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060097335A (ko) * 2005-03-07 2006-09-14 다인바이오 주식회사 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터와 이의 프라이머
US8101732B2 (en) * 2008-09-17 2012-01-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Methods of producing validamycin A analogs and uses thereof
CN101440357A (zh) * 2008-12-04 2009-05-27 上海交通大学 积累井冈霉亚基胺a的基因工程菌株及其构建方法
WO2013153554A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 Natco Pharma Limited Fermentation process for the production of rapamycin
CN103937856A (zh) * 2014-04-21 2014-07-23 浙江大学 一种提高井冈霉素产量的发酵方法
CN104593309A (zh) * 2015-01-06 2015-05-06 浙江工业大学 一种产udpg的重组工程菌及其应用
CN105754890A (zh) * 2015-12-21 2016-07-13 武汉科诺生物科技股份有限公司 一株产井冈霉素的吸水链霉菌及其应用
CN106434795A (zh) * 2016-09-19 2017-02-22 浙江大学 一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI XU等: "Catalytic Analysis of the Validamycin Glycosyltransferase(ValG) and Enzymatic Production of 4""-epi-Validamycin A.", 《J NAT PROD.》 *
刘杰等: "吸水链霉菌valG基因的克隆与表达", 《发酵科技通讯》 *
李磊: "吸水链霉菌5008中井冈霉素生物合成机理的研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161573A (zh) * 2018-09-25 2019-01-08 浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司 一种井冈霉素发酵培养基及发酵方法
CN112899210A (zh) * 2021-03-08 2021-06-04 上海交通大学 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法

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