CN105087424A - 一种耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，β-半乳糖苷酶，其编码核酸，包含该核酸的表达载体以及含有该核酸或表达载体的转化体。本发明还提供所述耐有机溶剂β-半乳糖苷酶作为催化剂，以廉价易得的乳糖为供体，在非水相体系中修饰核苷类药物的应用。该酶优良的催化活性很好地克服了目前核苷糖基化反应中糖基供体价格昂贵等问题，具有潜在的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂β-半乳糖苷酶及其基因，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。
背景技术
核苷类药物是临床上用于治疗病毒性感染、肿瘤、艾滋病的一类重要药物。目前使用的抗病毒药物中斤50％是核苷类药物。作为抗病毒药物，它们通过干扰感染细胞中核酸合成而使病毒复制收到抑制；作为抗肿瘤药物，它们通过干扰肿瘤细胞的DNA合成而起到抑制肿瘤细胞的效果。但与其它许多药物相似，核苷类药物通常缺乏选择性，这不仅影响疗效，还会对其它正常细胞产生毒副作用。
前药是指药物经过化学结构修饰后得到的无活性或活性较小、在体内经酶或非酶转化释放出活性药物而发挥药效的化合物，主要是用来降低母药的毒性、提高稳定性、利用度及选择性。目前前药设计主要是将一些基团或载体与母药共价结合，而在众多基团中，单糖无疑是最具前景的。首先，单糖具有特定的生物活性，不会产生副作用；其次，单糖具有很好的水溶性，它可以提高母药的水溶性及稳定性；更为重要的是，在人体内具有众多糖受体及转运体，可以提高药物的选择性。
糖基化是一类重要的改性修饰反应，不仅会改变化合物的水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。近年来，糖科学和糖组学在国际学术界和新兴产业界均得到了高度关注。但是糖分子存在多个性质相似的羟基，且糖苷键形成过程中还可能产生α-和β-两种异构体，因此传统化学法合成糖苷类化合物存在着区域和立体选择性差、需要保护/脱保护等步骤、副产物多等缺点，特别是复杂天然产物的糖基化反应目前利用化学手段较难实现。而用酶进行生物转化可弥补化学合成法的选择性不足等缺陷，酶法糖基化通常具有高度的区域及立体专一性，然而常规的酶法催化在水相中进行，而要修饰的核苷类药物、天然产物等均不溶于或难溶于水导致产率及转化率低，成为糖苷类化合物合成的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差的问题，还可以对产物进行一定程度的调控。
目前有关核苷类药物酶法糖基化修饰的报道主要在水相中进行，不能克服修饰水溶性较差的化合物时的低底物溶度、低转化率，且酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(oNPG)或对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNPG)，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。
发明内容
本发明针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，有机溶剂耐受性好、以乳糖为糖基供体的β-半乳糖苷酶，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该β-半乳糖苷酶在核苷类药物修饰中的应用。
为了实现本发明的目的，
一、本发明提供一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，其属于巨大芽孢杆菌属，命名为巨大芽孢杆菌YZ08(BacillusmegateriumYZ08)，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏登记号为CCTCCNO：M2015086。
本发明对巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumYZ08的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌株，有芽孢，好氧，最适生长温度为30～40℃。其生理生化特性表现在：液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。
经16SrDNA序列分析，该菌株鉴定为Bacillusmegaterium。
二、本发明BacillusmegateriumYZ08菌株生产的半乳糖苷酶，其氨基酸序列表如SEQIDNo：2所示。本发明的SEQIDNo：2所示的氨基酸序列组成的β-半乳糖苷酶可以从BacillusmegateriumYZ08中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工获得。
三、本发明提供一种基因，其编码本发明BacillusmegateriumYZ08菌株生产的半乳糖苷酶。优选地，其碱基序列如SEQIDNo：1所示。
本发明SEQIDNo.1所示的核酸来源于BacillusmegateriumYZ08中分离获得，也可以从含有该SEQIDNo：1所示的重组表达载体中或者重组表达转化体中分离获得，也可以人工获得。
本发明中，核苷酸序列如序列表SEQSEQIDNo：1所示，命名为gal，全长3105bp。其编码序列(CDS)从第一个碱基起至第3105个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQIDNo：2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQIDNo：1。本发明的β-半乳糖苷酶基因的碱基序列也可以是编码序列表中SEQIDNo：2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。
四、本发明提供一种重组表达载体，包含SEQIDNo：1所述的核苷酸序列。它可以通过本领域常规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体pET-gal。
五、本发明提供一种重组表达转化体，包含上述的重组表达载体。优选地，重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。本发明将前述的重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)。将前述重组表达质粒pET-gal转化至(E.coli)JM109(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。
六、本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β-半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β-半乳糖苷酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌JM109(DE3)/pET-gal接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.6-1.0时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。
本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可以是上述产生的重组β-半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞。
七、本发明还提供一种本发明所述的β-半乳糖苷酶在催化乳糖和核苷类化合物进行转糖基反应形成半乳糖基核苷类衍生物的应用。所述蛋白质在水相或非水相中以乳糖为糖基供体合成半乳糖基核苷类衍生物。
优选地，所述的应用以寡糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行；所述的条件为：采用0％或10％的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为20～100mmol/L，乳糖浓度为0.5mol/L，β-半乳糖苷酶的用量为0.5U/mL，在pH5.0～9.0的缓冲溶液中，35℃反应3～9h。
优选地，所述核苷类药物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、拉米夫定、吉西他滨中任一种；所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMSO、DMF中的一种或几种；优选地，所述非水相条件为：采用10％的二甲基亚砜，20mM阿昔洛韦或100mM叠氮胸苷或100mM拉米夫定或100mM吉西他滨，500mM乳糖为糖基供体，加入0.5U/mLβ-半乳糖苷酶，在50mMpH7.4的磷酸缓冲中，于35℃反应3-12h。
本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研究中存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种β-半乳糖苷酶及利用重组β-半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的应用。反应以廉价易得的乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为基因gal的PCR扩增电泳图，其中：1.DNAMarker；2～3.基因gal的PCR扩增产物。
图2为重组β-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图(1：蛋白Marker；2：粗酶；3：镍柱纯化后酶液；4：切除His标签的纯酶)。
图3为重组β-半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。
本发明的生物材料，巨大芽孢杆菌YZ08(BacillusmegateriumYZ08)，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015086。
具体实施方式
实施例一
本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。
初筛采用如下方法：以X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)为底物，将本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝色，说明该菌株具有β-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，MgSO40.5g/L，K2HPO42.5g/L，X-Gal0.1g/L，pH7.0，琼脂20g/L。培养温度为37℃，培养时间为12-36h。此方法可筛选到大量耐有机溶剂β-半乳糖苷酶产生菌。
将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵培养基，具体配方为：乳糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，MgSO40.5g/L，K2HPO42.5g/L，pH7.0。培养温度为37℃，培养时间为24h，摇床转速为180rpm。发酵结束后取0.4mL发酵液加入至总体积1mL含有0.1mLDMSO，2.5g/L拉米夫定，2.5g/L吉西他滨，100g/L乳糖，50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的2mL离心管中，37℃，180rpm反应24小时后，取样用甲醇终止转化反应，反应液经HPLC检测，计算转化率，选取能半乳糖基化修饰拉米夫定、吉西他滨且转化率最高的菌株作为目标菌株。通过上述方法，发明人获得了一株半乳糖基化修饰拉米夫定及吉西他滨的耐有机溶剂菌株YZ08。
实施例二
本实施例说明耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ08的生物学性质、鉴定。
菌株YZ08的生物学性质：该菌株为革兰氏阳性菌株，有芽孢，好氧，最适生长温度为30～40℃。其生理生化特性表现在：液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。
经16SrDNA序列分析，该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium，命名为巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumYZ08。
巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium，已经保藏。分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)YZ08，保藏日期2015年3月5日，保藏单位全称为中国典型微生物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M2015086。
实施例三
本实施例说明巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)YZ08所产β-半乳糖苷酶GAL编码基因的分离克隆程序。
采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。根据巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)QMB1551(NCBIReferenceSequence：NC_014019.1)的全基因测序结果进行分析，获得一个编码β-半乳糖苷酶的基因，根据该基因序列设计引物SF和SR。
SF(SEQIDNO：3)序列为：gcgggatccgacgacgacgacgacaagatgttaaaaaccggcaagaaatt；
SR(SEQIDNO：4)序列为：gcgctcgagttatagaggttttagcgtaaacg。
其中，引物SF下划线部分为BamHⅠ酶切位点，斜体为肠激酶酶切位点，引物SR下划线部分为XhoⅠ酶切位点。
以巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)YZ08的基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPlusMasterMix10μL，引物SF和SR各1μL，DNA模板1μL和ddH2O7μL。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃，退火30s；(4)72℃，延伸2min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸7min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带(图1)。获得一条完整的β-半乳糖苷酶基因序列，全长3105bp，命名为gal，其碱基序列如表中SEQIDNO：1。
实施例四
本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。
将实施例1所得的β-半乳糖苷酶基因片段在37℃用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的质粒pET28a，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-gal。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。
实施例五
本实施例说明重组β-半乳糖苷酶的诱导表达与纯化过程。
将实施例2所得的重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按2％(v/v)的接重量接入装有40mLLB培养基的250mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床培养，当培养液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导6h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，即为重组β-半乳糖苷酶的粗酶液。
粗酶液用Ni-NTAAgarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，并用肠激酶切除组氨酸标签，得到了电泳纯β-半乳糖苷酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。
实施例六
本实施例说明β-半乳糖苷酶活力测定过程。
通过检测410nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活力。β-半乳糖苷酶活力测定方法如下：用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)配置浓度为10mmol/L的oNPG底物溶液。反应体系中先加入10μL适当稀释的酶液，再加入240μL底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为37℃，反应时间为10min，在410nm波长下检测反应结束时生成的oNP的量。以灭活酶液为空白对照。每1个单位(U)β-半乳糖苷酶定义为：在相应条件下，每分钟催化oNPG水解产生1μmoloNP所需的酶量。
实施例七
本实施例考察β-半乳糖苷酶GAL的有机溶剂耐受性。
将纯化后的β-半乳糖苷酶GAL稀释液分别加入4种亲水性有机溶剂中，其混合比例为酶液：有机溶剂＝4∶1(v/v)，以加入相同体积50mM磷酸缓冲液(pH7.0)为对照。37℃，120rpm振荡，每隔12h取样检测β-半乳糖苷酶GAL的剩余活力。β-半乳糖苷酶GAL具有良好的有机溶剂耐受性，甲醇、乙醇、DMSO处理72h，其酶活几乎没有损失(图3)。
实施例八
本实施例说明巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)YZ08所产半乳糖苷酶与现有巨大芽孢杆菌来源的半乳糖苷酶的差异，具体数据如表1所示。
表1本发明半乳糖苷酶与已报道半乳糖苷酶的比较
实施例九
本实施例说明β-半乳糖苷酶GAL在水相或非水相体系中修饰核苷类药物的应用。
水相条件：以pH7.4的磷酸缓冲为反应介质，其中乳糖浓度为500mmol/L，核苷类药物的浓度为20-100mmol/L，加入0.5U实施例5制备的GAL粗酶液，在35℃，180rpm条件下反应，定时取样。
非水相条件：在pH7.4的磷酸缓冲中加入10％(v/v)二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500mmol/L，核苷类药物的浓度为20-100mmol/L，加入0.5U实施例5制备的GAL粗酶液，在35℃，180rpm条件下反应，定时取样。
反应结果如表2所示。
表2GAL水相或非水相合成半乳糖基核苷类药物结果
结果表明β-半乳糖苷酶GAL在非水相中以乳糖为糖基供体，具有良好的修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦、吉西他滨、拉米夫定的能力，表明该酶将来在修饰新型核苷类药物中具有巨大潜力，具有广阔的应用前景。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株以及该半乳糖苷酶的基因和应用
<130>xb15061004
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>3105
<212>DNA
<213>BacillusmegateriumYZ08
<400>1
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<210>2
<211>1034
<212>PRT
<213>BacillusmegateriumYZ08
<400>2
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Claims (10)
1.一种耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，其特征在于，其属于巨大芽孢杆菌属，命名为BacillusmegateriumYZ08，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心，保藏登记号为CCTCCNO：M2015086。
2.一种由权利要求1所述菌株生产的半乳糖苷酶，其氨基酸序列表如SEQIDNo：2所示。
3.一种基因，其编码权利要求2所述的半乳糖苷酶。
4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。
5.一种重组表达载体，包含如权利4所述的核苷酸序列。
6.一种重组表达转化体，包含如权利要求5所述的重组表达载体。
7.权利要求6所述的重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。
8.权利要求2所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在于，以乳糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用以寡糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行；所述的条件为：采用0%或10%的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为20~100mmol/L，乳糖浓度为0.5mol/L，β-半乳糖苷酶的用量为0.5U/mL，在pH5.0~9.0的缓冲溶液中，35℃反应3-12h。
10.如权利要求9的所述的应用，其特征在于：所述核苷类药物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、拉米夫定、吉西他滨中任一种；所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMSO、DMF中的一种或几种；优选地，所述非水相条件为：采用10%的二甲基亚砜，20mM阿昔洛韦或100mM叠氮胸苷或100mM拉米夫定或100mM吉西他滨，500mM乳糖为糖基供体，加入0.5U/mLβ-半乳糖苷酶，在50mMpH7.4的磷酸缓冲中，于35℃反应3-12h。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN108588006A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-09-28 | 华东理工大学 | 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778928A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-05-31 | 山东大学 | 一种转糖基α一半乳糖苷酶基因 |
| CN103789287A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-05-14 | 云南师范大学 | 具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶AgaAJB07及其基因、重组载体、重组菌株 |
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2015
- 2015-06-10 CN CN201510315786.0A patent/CN105087424B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778928A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-05-31 | 山东大学 | 一种转糖基α一半乳糖苷酶基因 |
| CN103789287A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-05-14 | 云南师范大学 | 具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶AgaAJB07及其基因、重组载体、重组菌株 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| WP_013056873.1: "beta-galactosidase [Bacillus megaterium]", 《GENBANK》 * |
| 刘芳宁等: "微生物β-半乳糖苷酶的研究进展", 《中国酿造》 * |
| 卢丽丽等: "1-氟代糖在化学-酶法合成糖类中的应用", 《有机化学》 * |
| 叶敏等: "混合溶剂体系中牛肝β-半乳糖昔酶催化5-氟-2’-脱氧尿昔区域选择性半乳糖基化反应", 《催化学报》 * |
| 徐小曼等: "芽胞表面展示技术研究进展", 《生物工程学报》 * |
| 王红妹等: "转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖", 《山东大学学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108588006A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-09-28 | 华东理工大学 | 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用 |
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