CN102676478A - 一种新β-葡萄糖苷酶及其基因和在糖苷合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有β-葡萄糖苷酶活性的新蛋白质，其编码核酸，包含该核酸的表达载体以及含有该核酸或表达载体的转化体。本发明还提供所述的具有β-葡萄糖苷酶活性的新蛋白质作为催化剂在催化单糖和醇进行逆水解反应形成糖苷中的应用。与传统的杏仁β-葡萄糖苷酶相比，本发明的β-葡萄糖苷酶热稳定性更好，且与许多其他微生物来源的β-葡萄糖苷酶相比能耐受更高浓度的葡萄糖，在糖苷的合成中具有很好的工业应用前景。

Description

一种新β-葡萄糖苷酶及其基因和在糖苷合成中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新β-葡萄糖苷酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该β-葡萄糖苷酶或其重组酶作为催化剂在逆水解合成糖苷化合物中的应用。

背景技术

糖苷是糖基和糖基配体以共价键连接的一类化合物的统称。很多糖苷化合物具有特殊的生物活性，担负着重要的生理功能；一些糖苷化合物，如红景天苷、熊果苷具有特定的药用价值；而烷基葡萄糖苷作为一类新型绿色非离子表面活性剂，在洗涤剂、食品添加剂等领域中有着广泛的应用。与化学合成法相比，酶法合成糖苷无需使用重金属催化剂，反应条件温和，同时避免了繁琐的保护/去保护步骤，环境友好，格外受到青睐。由热力学控制的逆水解反应和由动力学控制的转糖基反应是糖苷酶应用于糖苷合成的两种反应模式。与转糖基反应相比，逆水解反应可以直接接受单糖作为底物，反应体系简单，且由于反应生成的副产物是水，目标产物糖苷的分离提取比较简便。

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC 3.2.1.21)是广泛存在于细菌、真菌、植物、以及动物体内的一类水解酶。植物种子发芽期间，在糖苷酶的作用下会生成大量葡萄糖，因此植物来源的β-葡萄糖苷酶通常能够耐受高浓度的葡萄糖。商品化的杏仁β-葡萄糖苷酶被广泛应用于逆水解反应合成糖苷化合物，但其存在着不够稳定的缺陷，即使反应温度提高到50℃，逆水解反应仍需要很长的时间才能达到平衡(J.Mol.Catal.B-Enzym.1996，1：165-172)。为了提高反应速率，需要挖掘稳定的β-葡萄糖苷酶，使得较高温度下的反应得以实现。近年来，许多嗜热微生物来源的β-葡萄糖苷酶陆续被分离表征，但多数微生物来源的β-葡萄糖苷酶的活性易受葡萄糖的抑制，因而限制了它们在逆水解反应合成糖苷中的应用。此外，即使是极端热稳定的β-葡萄糖苷酶，在高温下受反应体系中高浓度的有机溶剂和美拉德反应的影响，也易迅速丧失活性，如来源于极端嗜热菌Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶用于正己醇的糖化时，由于酶的迅速失活，转化率只能达到2.64％，远远没有到达平衡状态(Enzyme Microb.Technol.2001，29，621-624)。因此，针对糖苷化合物的逆水解合成，亟需筛选高效稳定的，耐受高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，以满足工业需要。

Genbank收录了一种β-葡萄糖苷酶DtGH(登录号为NC011297)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共包含445个氨基酸，它来源于Dictyoglomusthermophilum DSM 3960，其编码基因(Genbank登录号NC011297，REGION：1647894...1649231)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共包含1338个碱基。但至今尚未见该β-葡萄糖苷酶任何实际应用的文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的微生物来源的β-葡萄糖苷酶在生物催化合成烷基糖苷时不够稳定、易受高浓度葡萄糖抑制等问题，提供了一种催化活性高、热稳定好、对高浓度葡萄糖耐受性好、在低含水量体系中稳定、反应时间短的β-葡萄糖苷酶，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该β-葡萄糖苷酶在催化糖苷合成中的应用。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供一种分离的蛋白质，其特征在于：其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70％相同的蛋白质。

SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质来源于Dictyoglomusthermophilum DSM 3960，具有β-葡萄糖苷酶的功能，是一种新的β-葡萄糖苷酶。

所述的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从Dictyoglomus thermophilum DSM 3960中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。

SEQ ID No.2所示的β-葡萄糖苷酶和其他已知β-葡萄糖苷酶之间的同源性(即氨基酸序列相似性)见表1。本发明中氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的β-葡萄糖苷酶与已知β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列的同源性低于60％，具有显著差异性。

表1.本发明的新β-葡萄糖苷酶和其他已知β-葡萄糖苷酶同源性

蛋白质(b)是在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70％相同的蛋白质。其中，所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有β-葡萄糖苷酶活性，本发明发现这样的融合蛋白同样具有β-葡萄糖苷酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有β-葡萄糖苷酶活性，且衍生方式如上所述，并且与蛋白质(a)的同源性在70％以上，都可以达到本发明的发明目的。

根据本发明，在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1-3个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，但仍然保持β-葡萄糖苷酶活性。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶可以作为催化剂催化单糖和醇进行逆水解反应得到糖苷类化合物。

本发明的第二方面提供一种分离的核酸，其特征在于：其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70％相同的蛋白质。

SEQ ID No.1所示的核酸来源于Dictyoglomus thermophilum DSM 3960。SEQ ID No.1所示的核酸可以从Dictyoglomus thermophilum DSM 3960基因组中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No.1所示的核酸的重组载体中或者重组表达转化提中分离获得，也可以全人工合成获得。

本发明中，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为DtGH，全长1338bp。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1335个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No.1。本发明的β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQID No.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ ID No.1的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ ID No.1的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID No.1所示序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的第三方面提供一种包含本发明所述核酸的重组表达载体。它可通过本领域常规方法将本发明所述核酸连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET21a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET21a用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达质粒pET-DtGH。

本发明的第四方面提供一种包含本发明所述重组表达载体的重组表达转化体。它可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的β-葡萄糖苷酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。将前述重组表达质粒pET-DtGH转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-DtGH。

本发明的第五方面提供一种重组β-葡萄糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β-葡萄糖苷酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-葡萄糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，NaCl 10g/l，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生本发明所述的β-葡萄糖苷酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET-DtGH)重组表达转化体接种至含氨苄霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/l(优选0.35mmol/l)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-葡萄糖苷酶。

本发明中催化单糖和醇逆水解得到糖苷类化合物的催化剂，可以是上述产生的重组β-葡萄糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的β-葡萄糖苷酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的第六方面提供一种本发明所述的蛋白质在催化单糖和醇进行逆水解反应形成糖苷中的应用。

上述应用中，所述的逆水解反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的蛋白质优选本发明所述的β-葡萄糖苷酶或重组β-葡萄糖苷酶。所述的单糖优选葡萄糖或半乳糖。所述的醇优选烷基醇或者芳香醇。所述的烷基醇优选碳链长度为1～8的烷基醇(式1)。所述的芳香醇优选对羟基苯乙醇(式2)。

式1              式2

较佳的，所述的应用包括以下步骤：在pH 5.0～7.0的磷酸盐缓冲液中，在所述的蛋白质的催化下，单糖和醇进行逆水解反应，形成糖苷。

较佳的，所述的逆水解反应中，反应介质中较佳的还包括极性有机溶剂，所述的极性有机溶剂优选醇、乙腈和二氧六环中的任何一种或多种，更优选和底物相同的醇。水相的磷酸盐缓冲液优选占反应液体系的10％-15％(体积)。低含水量体系反应的产率较高，但含水量过低则反应速度慢。

所述的底物单糖在反应液中的浓度为0.1～0.5mol/l，较佳的为0.1～0.25mol/l。

所述的底物醇在反应液中的浓度为1.0～6.0mol/l，优选2.5～5.5mol/l。

优选的，所述的烷基醇在反应体系中既是底物也是溶剂。对羟基苯乙醇在反应液中的浓度较佳的为2.5mol/l，此时使用的溶剂优选叔丁醇。

本发明中β-葡萄糖苷酶的用量为催化有效量，较佳的为2～10U/ml。每单位β-葡萄糖苷酶活力(U)定义为50℃，pH 7.0的条件下，每分钟催化pNPG(对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷)水解释放出1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/l，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。

所述的逆水解反应的温度较佳的为50～70℃，优选70℃。所述的逆水解反应的时间较佳的以达到反应平衡为准，一般为1天～3天。逆水解反应结束后，先过滤掉酶粉，旋转蒸发去除溶剂，得淡黄色粘状物，硅胶吸附，快速柱层析，旋转蒸发除去溶剂后得到白色固体。本发明中硅胶较佳的为200～300目或300～400目，快速柱层析流动相对烷基糖苷优选乙酸乙酯/甲醇＝8/1，对红景天苷优选乙酸乙酯/甲醇＝13/1。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均为市售。

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的植物来源β-葡萄糖苷酶在生物催化葡萄糖和醇类化合物脱水缩合合成相应糖苷的研究中存在不够稳定，反应时间长，而微生物来源β-葡萄糖苷酶在催化葡萄糖和醇类化合物脱水缩合合成相应糖苷过程中易受高浓度的葡萄糖的抑制，不耐受有机溶剂等问题，提供了一种新的β-葡萄糖苷酶及利用重组β-葡萄糖苷酶催化逆水解反应合成糖苷类化合物的方法。反应温度提高到70℃，葡萄糖浓度升高至0.25mol/l时，反应仍能较快达到平衡状态。相对于其他微生物来源的β-葡萄糖苷酶，本发明的重组β-葡萄糖苷酶对底物葡萄糖耐受性好，能耐受更高浓度的葡萄糖，在反应体系中更加稳定。与传统的植物(杏仁)来源的β-葡萄糖苷酶相比，本发明的β-葡萄糖苷酶具有更好的热稳定性，反应温度高，达到反应平衡的时间短，反应速度快，可大大降低糖苷的生产成本。本发明的重组β-葡萄糖苷酶可作为催化剂应用于制备糖苷类化合物，具有催化效率高，稳定性好，底物适用性广，反应条件温和，对环境友好的优点，在糖苷的合成中具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为基因DtGH的PCR扩增电泳图谱，其中：1.DNA Marker(MarkerIV，北京天根生化科技有限公司)；2～3.基因DtGH的PCR扩增产物。

图2为重组表达质粒pET-DtGH的构建示意图。

图3为重组β-葡萄糖苷酶DtGH的聚丙烯凝胶电泳图(泳道1为破碎液，泳道2为热处理后上清，泳道3为纯酶)。

具体实施方式

本发明人通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为β-葡萄糖苷酶基因的序列。所述的挖掘方法具体为，以来自苹果籽的糖苷酶ASG(其在烷基糖苷和芳香基糖苷合成中表现出色，中国发明专利，专利号：ZL 200410016652.0)的氨基酸序列为探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选出一批预测可能是编码β-葡萄糖苷酶的基因序列。然后对这些候选基因分别进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞，验证基因表达产物的功能。通过测定这些基因的表达产物催化pNPG水解生成对硝基苯酚的效率并进行比较，获得催化性能最佳的β-葡萄糖苷酶DtGH，从而完成了本发明。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

菌株Dictyoglomus thermophilum DSM 3960，系从DSMZ购买所得。

表达质粒pET21a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1～2过程如图2所示。

实施例1β-葡萄糖苷酶基因的克隆

根据Genbank收录的预测为Dictyoglomus thermophilum β-葡萄糖苷酶的基因序列(Genebank登录号：NC011297)为依据，设计PCR引物如下：

上游引物：CGCGGATCCATGGCTAAATTAGTTTTTCCTAA；

下游引物：CCGCTCGAGCCCATCTACTCCATTCTCTTCAA。

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点。

以Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCRMasterMix 10μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/l)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 7μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1.5min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸7min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1200～1400bp区间的目标条带(图1)。获得一条完整的Dictyoglomusthermophilum DSM 3960的β-葡萄糖苷酶全长基因序列，经DNA测序，全长1335bp，命名为DtGH，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1。

实施例2重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的β-葡萄糖苷酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经BamHI和XhoI酶切后的质粒pET21a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-DtGH。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有氨苄霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有氨苄霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-DtGH，菌落PCR验证阳性克隆。

实施例3重组β-葡萄糖苷酶的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-DtGH，接种至含氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，NaCl 10g/l，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.35mmol/l的IPTG作为诱导剂，37℃诱导5h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组β-葡萄糖苷酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图3)，重组蛋白以部分可溶的形式存在。

冻干酶粉的制备：将所得重组β-葡萄糖苷酶的粗酶液均匀倾倒在敞口容器内(水果盘)，厚度＜0.5cm。置于-80℃冰箱预冷6h，再迅速置于冷冻干燥机内，冷冻干燥48h。干燥后，收集冻干酶粉于干燥的小瓶中。

实施例4重组β-葡萄糖苷酶活力的测定

通过检测405nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定β-葡萄糖苷酶的活力。β-葡萄糖苷酶活力测定方法如下：反应体系为1ml，加入960μl磷酸钠缓冲液(50mmol·l^-1，pH 7.0)，5μl pNPG(100mmol·l^-1，溶于DMSO中)，50℃保温1分钟后加入35μl适量实施例3制备的冻干酶粉溶解后的酶液，迅速混匀，检测405nm处吸光值的变化。在测定前需要先求得pNPG的自然水解速率，测定体系为：995μl磷酸钠缓冲液(50mmol·l^-1，pH 7.0)+5μlpNPG(100mmol·l^-1)。酶浓度的计算公式为：酶浓度(U/ml)＝(ΔA₁/Δt₁-ΔA₀/Δt₀)/ε₄₀₅×1÷0.035；式中，ΔA₁，ΔA₀为待测样品及自然水解样品的吸光值的变化；Δt₁，Δt₀为待测样品和自然水解样品时间的变化，ε₄₀₅为对硝基苯酚在405nm处的消光系数。每单位β-葡萄糖苷酶的定义为在上述条件下，每分钟催化水解pNPG释放出1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

实施例3制备的冻干酶粉的酶活力是0.4U/mg冻干酶粉。

实施例5-6重组β-葡萄糖苷酶DtGH催化逆水解合成红景天苷和对羟基苯乙基半乳糖苷

在10ml具塞试管中，加入40mg一水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)，或36mg半乳糖(C₆H₁₂O₆)，终浓度0.1mol·l^-1，690mg对羟基苯乙醇，终浓度2.50mol·l^-1，0.2ml磷酸缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.05mol·l^-1，pH 7.0)，1.8ml叔丁醇和40mg DtGH酶粉(实施例3制备)，混合均匀后密封，放入摇床(160rpm，70℃)反应。反应72h后，检测反应达到平衡。用液相色谱(Inertsil ODS-4column，GL Sciences Inc.)分析测定产物浓度，流动相为甲醇/水(70/30，v/v，0.8ml·min^-1)，30℃，275nm紫外检测。结果见表2。

表2.DtGH催化逆水解合成红景天苷和对羟基苯乙基半乳糖苷

实施例7-14重组β-葡萄糖苷酶DtGH催化逆水解合成烷基葡萄糖苷

在10ml具塞试管中，加入40mg一水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，终浓度0.1mol·l^-1)，40mg实施例3制备的DtGH酶粉，0.2ml磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.05mol·l^-1，pH 7.0)和1.8ml相应的直链烷基醇，混合均匀后密封，放入摇床(160rpm，70℃)反应。反应72h后，检测反应达到平衡。用液相色谱分析测定产物浓度，结果见表3。

产物浓度的具体分析条件如下：

实施例7-12：Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)，流动相为5mM H₂SO₄(0.6ml·min^-1)，65℃，示差检测器检测。

实施例13，14：Inertsil ODS-4column(GL Sciences Inc.)，流动相为甲醇/水(2∶1，v/v，0.8ml·min^-1)，30℃，示差检测器检测。

表3.DtGH催化逆水解合成烷基葡萄糖苷结果

实施例15重组β-葡萄糖苷酶DtGH在葡萄糖溶液中的稳定性

在10ml具塞试管中，加入40mg一水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，终浓度1.0mol·l^-1)，40mg实施例3制备的DtGH酶粉，0.2ml磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.05mol·l^-1，pH 7.0)，混合均匀后密封，放入摇床(160rpm，70℃)振荡保温，间隔不同的时间加入1.8ml正辛醇，反应3h后取样检测反应生成的辛基糖苷浓度，计算反应初速率与残余活力。DtGH酶粉在70℃，1.0mol·l^-1葡萄糖溶液中保温7天后仍能保持约80％的活力。

实施例16重组β-葡萄糖苷酶DtGH在缓冲液-正辛醇两相体系中的稳定性

在10ml具塞试管中，加入40mg实施例3制备的DtGH酶粉，0.2ml磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.05mol·l^-1，pH 7.0)，1.8ml正辛醇，混合均匀后密封，放入摇床(160rpm，70℃)振荡保温，间隔不同的时间加入40mg一水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，终浓度0.1mol·l^-1)，反应3h后取样检测反应生成的辛基糖苷浓度，计算反应初速率与残余活力。DtGH酶粉在70℃，缓冲液-正辛醇两相体系中保温7天后仍能保持约70％的活力。

实施例17重组β-葡萄糖苷酶DtGH催化逆水解合成辛基葡萄糖苷

取6400U实施例3制备的DtGH冻干酶粉(0.4U/mg冻干酶粉)，39.6g一水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，0.25mol·l^-1)，溶解于80ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH 7.0)中，加入320ml乙腈，400ml正辛醇，70℃，180rpm搅拌。反应72h后，检测反应达到平衡，转化率为6％。反应结束后过滤除去酶粉，旋转蒸发去除溶剂，得淡黄色粘状物，硅胶吸附，使用200～300目的硅胶进行快速柱层析，流动相为：乙酸乙酯/甲醇＝8/1，合并含有产物的洗脱液，旋转蒸发除去溶剂后得到3.23g白色固体，分离得率为92％，产物的纯度为98％。

Claims (11)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于：其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70％相同的蛋白质。

2.一种分离的核酸，其特征在于：其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70％相同的蛋白质。

3.一种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。

5.一种重组β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组β-葡萄糖苷酶。

6.一种如权利要求1所述的蛋白质在催化单糖和醇进行逆水解反应形成糖苷中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的应用包括以下步骤：在pH 5.0～7.0的磷酸盐缓冲液中，在权利要求1所述的蛋白质的催化下，单糖和醇进行逆水解反应，形成糖苷。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的单糖在反应液中的浓度为0.1～0.5mol/l；所述的蛋白质的用量为2～10U/ml；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/l；所述的逆水解反应的温度为50～70℃。

9.如权利要求6和7所述的应用，其特征在于：所述的单糖为葡萄糖或者半乳糖。

10.如权利要求6和7所述的应用，其特征在于：所述的醇为烷基醇或者芳基醇。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的醇为碳链长度为1～8的烷基醇或对羟基苯乙醇。

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