CN105087424B - 一株耐有机溶剂转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株以及该半乳糖苷酶的基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株耐有机溶剂高效转糖基β‑半乳糖苷酶高产菌株，β‑半乳糖苷酶，其编码核酸，包含该核酸的表达载体以及含有该核酸或表达载体的转化体。本发明还提供所述耐有机溶剂β‑半乳糖苷酶作为催化剂，以廉价易得的乳糖为供体，在非水相体系中修饰核苷类药物的应用。该酶优良的催化活性很好地克服了目前核苷糖基化反应中糖基供体价格昂贵等问题，具有潜在的工业应用价值。

Description

一株耐有机溶剂转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株以及该半乳糖 苷酶的基因和应用

技术领域

本发明涉及一株耐有机溶剂转糖基β-半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂β-半乳糖苷酶及其基因，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。

背景技术

核苷类药物是临床上用于治疗病毒性感染、肿瘤、艾滋病的一类重要药物。目前使用的抗病毒药物中斤50％是核苷类药物。作为抗病毒药物，它们通过干扰感染细胞中核酸合成而使病毒复制收到抑制；作为抗肿瘤药物，它们通过干扰肿瘤细胞的DNA合成而起到抑制肿瘤细胞的效果。但与其它许多药物相似，核苷类药物通常缺乏选择性，这不仅影响疗效，还会对其它正常细胞产生毒副作用。

前药是指药物经过化学结构修饰后得到的无活性或活性较小、在体内经酶或非酶转化释放出活性药物而发挥药效的化合物，主要是用来降低母药的毒性、提高稳定性、利用度及选择性。目前前药设计主要是将一些基团或载体与母药共价结合，而在众多基团中，单糖无疑是最具前景的。首先，单糖具有特定的生物活性，不会产生副作用；其次，单糖具有很好的水溶性，它可以提高母药的水溶性及稳定性；更为重要的是，在人体内具有众多糖受体及转运体，可以提高药物的选择性。

糖基化是一类重要的改性修饰反应，不仅会改变化合物的水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。近年来，糖科学和糖组学在国际学术界和新兴产业界均得到了高度关注。但是糖分子存在多个性质相似的羟基，且糖苷键形成过程中还可能产生α-和β-两种异构体，因此传统化学法合成糖苷类化合物存在着区域和立体选择性差、需要保护/脱保护等步骤、副产物多等缺点，特别是复杂天然产物的糖基化反应目前利用化学手段较难实现。而用酶进行生物转化可弥补化学合成法的选择性不足等缺陷，酶法糖基化通常具有高度的区域及立体专一性，然而常规的酶法催化在水相中进行，而要修饰的核苷类药物、天然产物等均不溶于或难溶于水导致产率及转化率低，成为糖苷类化合物合成的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差的问题，还可以对产物进行一定程度的调控。

目前有关核苷类药物酶法糖基化修饰的报道主要在水相中进行，不能克服修饰水溶性较差的化合物时的低底物溶度、低转化率，且酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(oNPG)或对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNPG)，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。

发明内容

本发明针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，有机溶剂耐受性好、以乳糖为糖基供体的β-半乳糖苷酶，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该β-半乳糖苷酶在核苷类药物修饰中的应用。

为了实现本发明的目的，

一、本发明提供一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，其属于巨大芽孢杆菌属，命名为巨大芽孢杆菌YZ08(Bacillus megaterium YZ08)，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO：M2015086。

本发明对巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium YZ08的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌株，有芽孢，好氧，最适生长温度为30～40℃。其生理生化特性表现在：液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。

经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为Bacillus megaterium。

二、本发明Bacillus megaterium YZ08菌株生产的半乳糖苷酶，其氨基酸序列表如SEQ ID No：2所示。本发明的SEQ ID No：2所示的氨基酸序列组成的β-半乳糖苷酶可以从Bacillus megaterium YZ08中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工获得。

三、本发明提供一种基因，其编码本发明Bacillus megaterium YZ08菌株生产的半乳糖苷酶。优选地，其碱基序列如SEQ ID No：1所示。

本发明SEQ ID No.1所示的核酸来源于Bacillus megaterium YZ08中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No：1所示的重组表达载体中或者重组表达转化体中分离获得，也可以人工获得。

本发明中，核苷酸序列如序列表SEQSEQ ID No：1所示，命名为gal，全长3105bp。其编码序列(CDS)从第一个碱基起至第3105个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No：2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No：1。本发明的β-半乳糖苷酶基因的碱基序列也可以是编码序列表中SEQ ID No：2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。

四、本发明提供一种重组表达载体，包含SEQ ID No：1所述的核苷酸序列。它可以通过本领域常规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体pET-gal。

五、本发明提供一种重组表达转化体，包含上述的重组表达载体。优选地，重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。本发明将前述的重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)。将前述重组表达质粒pET-gal转化至(E.coli)JM109(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。

六、本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β-半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β-半乳糖苷酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌JM109(DE3)/pET-gal接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6-1.0时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。

本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可以是上述产生的重组β-半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞。

七、本发明还提供一种本发明所述的β-半乳糖苷酶在催化乳糖和核苷类化合物进行转糖基反应形成半乳糖基核苷类衍生物的应用。所述蛋白质在水相或非水相中以乳糖为糖基供体合成半乳糖基核苷类衍生物。

优选地，所述的应用以寡糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行；所述的条件为：采用0％或10％的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为20～100mmol/L，乳糖浓度为0.5mol/L，β-半乳糖苷酶的用量为0.5U/mL，在pH5.0～9.0的缓冲溶液中，35℃反应3～9h。

优选地，所述核苷类药物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、拉米夫定、吉西他滨中任一种；所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMSO、DMF中的一种或几种；优选地，所述非水相条件为：采用10％的二甲基亚砜，20mM阿昔洛韦或100mM叠氮胸苷或100mM拉米夫定或100mM吉西他滨，500mM乳糖为糖基供体，加入0.5U/mL β-半乳糖苷酶，在50mM pH7.4的磷酸缓冲中，于35℃反应3-12h。

本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研究中存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种β-半乳糖苷酶及利用重组β-半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的应用。反应以廉价易得的乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。

附图说明

图1为基因gal的PCR扩增电泳图，其中：1.DNA Marker；2～3.基因gal的PCR扩增产物。

图2为重组β-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图(1：蛋白Marker；2：粗酶；3：镍柱纯化后酶液；4：切除His标签的纯酶)。

图3为重组β-半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。

本发明的生物材料，巨大芽孢杆菌YZ08(Bacillus megaterium YZ08)，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015086。

具体实施方式

实施例一

本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。

初筛采用如下方法：以X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)为底物，将本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝色，说明该菌株具有β-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，X-Gal 0.1g/L，pH 7.0，琼脂20g/L。培养温度为37℃，培养时间为12-36h。此方法可筛选到大量耐有机溶剂β-半乳糖苷酶产生菌。

将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵培养基，具体配方为：乳糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，pH 7.0。培养温度为37℃，培养时间为24h，摇床转速为180rpm。发酵结束后取0.4mL发酵液加入至总体积1mL含有0.1mL DMSO，2.5g/L拉米夫定，2.5g/L吉西他滨，100g/L乳糖，50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的2mL离心管中，37℃，180rpm反应24小时后，取样用甲醇终止转化反应，反应液经HPLC检测，计算转化率，选取能半乳糖基化修饰拉米夫定、吉西他滨且转化率最高的菌株作为目标菌株。通过上述方法，发明人获得了一株半乳糖基化修饰拉米夫定及吉西他滨的耐有机溶剂菌株YZ08。

实施例二

本实施例说明耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ08的生物学性质、鉴定。

菌株YZ08的生物学性质：该菌株为革兰氏阳性菌株，有芽孢，好氧，最适生长温度为30～40℃。其生理生化特性表现在：液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。

经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，命名为巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumYZ08。

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，已经保藏。分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YZ08，保藏日期2015年3月5日，保藏单位全称为中国典型微生物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2015086。

实施例三

本实施例说明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YZ08所产β-半乳糖苷酶GAL编码基因的分离克隆程序。

采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。根据巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)QMB1551(NCBI Reference Sequence：NC_014019.1)的全基因测序结果进行分析，获得一个编码β-半乳糖苷酶的基因，根据该基因序列设计引物SF和SR。

SF(SEQ ID NO：3)序列为：gcgggatccgacgacgacgacgacaagatgttaaaaaccggcaagaaatt；

SR(SEQ ID NO：4)序列为：gcgctcgagttatagaggttttagcgtaaacg。

其中，引物SF下划线部分为BamHⅠ酶切位点，斜体为肠激酶酶切位点，引物SR下划线部分为XhoⅠ酶切位点。

以巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YZ08的基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq Plus Master Mix 10μL，引物SF和SR各1μL，DNA模板1μL和ddH₂O 7μL。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃，退火30s；(4)72℃，延伸2min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸7min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带(图1)。获得一条完整的β-半乳糖苷酶基因序列，全长3105bp，命名为gal，其碱基序列如表中SEQ ID NO：1。

实施例四

本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。

将实施例1所得的β-半乳糖苷酶基因片段在37℃用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的质粒pET28a，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-gal。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal。

实施例五

本实施例说明重组β-半乳糖苷酶的诱导表达与纯化过程。

将实施例2所得的重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(DE3)/pET-gal，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按2％(v/v)的接重量接入装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床培养，当培养液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导6h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，即为重组β-半乳糖苷酶的粗酶液。

粗酶液用Ni-NTA Agarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，并用肠激酶切除组氨酸标签，得到了电泳纯β-半乳糖苷酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。

实施例六

本实施例说明β-半乳糖苷酶活力测定过程。

通过检测410nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活力。β-半乳糖苷酶活力测定方法如下：用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)配置浓度为10mmol/L的oNPG底物溶液。反应体系中先加入10μL适当稀释的酶液，再加入240μL底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为37℃，反应时间为10min，在410nm波长下检测反应结束时生成的oNP的量。以灭活酶液为空白对照。每1个单位(U)β-半乳糖苷酶定义为：在相应条件下，每分钟催化oNPG水解产生1μmol oNP所需的酶量。

实施例七

本实施例考察β-半乳糖苷酶GAL的有机溶剂耐受性。

将纯化后的β-半乳糖苷酶GAL稀释液分别加入4种亲水性有机溶剂中，其混合比例为酶液：有机溶剂＝4∶1(v/v)，以加入相同体积50mM磷酸缓冲液(pH7.0)为对照。37℃，120rpm振荡，每隔12h取样检测β-半乳糖苷酶GAL的剩余活力。β-半乳糖苷酶GAL具有良好的有机溶剂耐受性，甲醇、乙醇、DMSO处理72h，其酶活几乎没有损失(图3)。

实施例八

本实施例说明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YZ08所产半乳糖苷酶与现有巨大芽孢杆菌来源的半乳糖苷酶的差异，具体数据如表1所示。

表1本发明半乳糖苷酶与已报道半乳糖苷酶的比较

实施例九

本实施例说明β-半乳糖苷酶GAL在水相或非水相体系中修饰核苷类药物的应用。

水相条件：以pH7.4的磷酸缓冲为反应介质，其中乳糖浓度为500mmol/L，核苷类药物的浓度为20-100mmol/L，加入0.5U实施例5制备的GAL粗酶液，在35℃，180rpm条件下反应，定时取样。

非水相条件：在pH7.4的磷酸缓冲中加入10％(v/v)二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500mmol/L，核苷类药物的浓度为20-100mmol/L，加入0.5U实施例5制备的GAL粗酶液，在35℃，180rpm条件下反应，定时取样。

反应结果如表2所示。

表2GAL水相或非水相合成半乳糖基核苷类药物结果

结果表明β-半乳糖苷酶GAL在非水相中以乳糖为糖基供体，具有良好的修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦、吉西他滨、拉米夫定的能力，表明该酶将来在修饰新型核苷类药物中具有巨大潜力，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株以及该半乳糖苷酶的基因和应用

<130> xb15061004

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3105

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium YZ08

<400> 1

atgttaaaaa ccggcaagaa atttcattat acagcacctg caaacggata ccctgagtgg 60

aataacaacc ctgaaatttt tcaattgaac cgttcaaaag cacacgcttt acttatgcct 120

tatcaaacgg tcgaagaggc cttaaaaaat gatagaaaat cttctgttta ctatcaaagc 180

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aaatactggg agctgttcga tcaatatccg atcttgcaag gcggttttat atgggactgg 1740

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gcagtcgacg ctgctaaagg aaagtgttcc gttcaaaaca aacacttgtt tacaaacttg 1980

aacgcctatg attttgtttg gactgttgaa aaaaacggtg aactcgttga aaagcatgcg 2040

tctcttttaa atgtagctcc tgatggtaca gaagaactga cgctttctta tcctctttat 2100

gagcaagaaa atgaaactga tgaatttgtt ttaactcttt ctctcagatt gtccaaagat 2160

acagcttggg cttcagctgg atatgaagtg gcatacgaac agtttgtact gcctgccaaa 2220

accgctgtac cttcagtaaa agctgctcat cctgctttaa ccgttgacca aaatgaacaa 2280

acgcttacgg ttacaggaac taacttcacg gctatttttg ataagcgaaa aggacagttt 2340

atttcttaca actatgagca caccgagctg cttgcgtcgg gtttccgtcc gaatttttgg 2400

cgtgcagtaa ccgataatga cctcgggaat aaactgcatg aaagatgtca aacgtggcgt 2460

caagcaagct tagggcagca tgtgcaaaac ataagtgttc agccgcaaat tgactttgtt 2520

atcatttcgg ttgaactagc tttagacaac tctcttgctt cttgctatgt aacgtatacg 2580

ctatataacg atggtgaaat gaagattgaa caatctttag caccttctga gacaatgcct 2640

gaaattcctg aaatcggcat gctgtttatg atgaatgcgg cttttgattc tttaacgtgg 2700

tacggaagag gacctcatga aaattattgg gaccgtaaaa ctggcgctaa gctggccctt 2760

cataaaggca gtgtaaaaga gcaagttaca ccgtatttac gccctcaaga atgcggaaat 2820

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ggtttgccaa cagtcgagct gaacgcttta ccttactcac cttttgaact ggaggcttac 2940

gatcattttt acaaattgcc gtcaagcgat tcagtaaccg tgcgggttaa ctacaagcaa 3000

atgggcgttg gcggagacga cagctgggga gctaaaacac atcctgatta cacactatat 3060

gctaaccgct cgtatacaaa cacgtttacg ctaaaacctc tataa 3105

<210> 2

<211> 1034

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium YZ08

<400> 2

Met Leu Lys Thr Gly Lys Lys Phe His Tyr Thr Ala Pro Ala Asn Gly

1 5 10 15

Tyr Pro Glu Trp Asn Asn Asn Pro Glu Ile Phe Gln Leu Asn Arg Ser

20 25 30

Lys Ala His Ala Leu Leu Met Pro Tyr Gln Thr Val Glu Glu Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Asp Arg Lys Ser Ser Val Tyr Tyr Gln Ser Leu Asn Gly Ser

50 55 60

Trp Tyr Phe His Phe Ala Glu Asn Ala Asp Ala Arg Val Lys Asn Phe

65 70 75 80

Phe Ala Pro Glu Phe Ser Tyr Glu Lys Trp Asp Ser Ile Ser Val Pro

85 90 95

Ser His Trp Gln Leu Gln Gly Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Thr Asn Val

100 105 110

Ala Tyr Pro Trp Val Glu Asn Glu Glu Leu Glu Pro Pro Phe Ala Pro

115 120 125

Thr Lys Tyr Asn Pro Val Ser Gln Tyr Ile Arg Thr Phe Thr Pro Lys

130 135 140

Pro Glu Trp Lys Asp Gln Pro Val Tyr Val Ser Phe Gln Gly Val Glu

145 150 155 160

Ser Ala Phe Tyr Val Trp Ile Asn Gly Glu Phe Val Gly Tyr Ser Glu

165 170 175

Asp Ser Phe Thr Pro Ala Glu Phe Asp Ile Thr Ser Tyr Leu Gln Glu

180 185 190

Gly Glu Asn Thr Ile Ala Val Glu Val Tyr Arg Trp Ser Asp Ala Ser

195 200 205

Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Met Ser Gly Ile Phe Arg Asp

210 215 220

Val Tyr Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Val His Ile Tyr Asp Phe Ser Val

225 230 235 240

Arg Ser Ser Leu Asp Asn Asn Tyr Gln Asp Gly Glu Leu Ile Val Ser

245 250 255

Ala Asp Ile Leu Asn Tyr Phe Glu His Asp Thr Gln Gly Leu Thr Phe

260 265 270

Glu Ala Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Asp Gln Glu Val Leu Gln Ala Pro

275 280 285

Leu Gln Ile Asn Leu Ser Val Ser Asp Gln Arg Thr Val Ser Leu Arg

290 295 300

Thr His Ile Lys Ser Pro Glu Lys Trp Ser Ala Glu Ser Pro His Leu

305 310 315 320

Tyr Thr Leu Val Leu Ser Leu Lys Asn Ser Ala Gly Ser Ile Ile Glu

325 330 335

Thr Glu Ser Cys Lys Val Gly Phe Arg Thr Phe Glu Leu Lys Asn Gly

340 345 350

Leu Met Thr Ile Asn Gly Lys Arg Ile Val Leu Arg Gly Val Asn Arg

355 360 365

His Glu Phe Asp Ser Val Lys Gly Arg Ala Gly Ile Thr Arg Glu Asp

370 375 380

Met Leu His Asp Ile Leu Leu Met Lys Gln His Asn Ile Asn Ala Val

385 390 395 400

Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Asp Ser Val Trp Tyr Glu Leu Cys Asp

405 410 415

Glu Tyr Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly

420 425 430

Thr Trp Thr Tyr Leu Gln Glu Gly Glu Gln Lys Ala Val Pro Gly Ser

435 440 445

Lys Pro Glu Trp Arg Glu Asn Val Leu Asp Arg Cys Arg Ser Met Tyr

450 455 460

Glu Arg Asp Lys Asn His Pro Ser Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn

465 470 475 480

Glu Ser Phe Gly Gly Glu Asn Phe His His Met Tyr Thr Phe Phe Lys

485 490 495

Glu Lys Asp Ser Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Ile Phe His His

500 505 510

Arg Asp Tyr Asp Ala Ser Asp Ile Glu Ser Thr Met Tyr Val Lys Pro

515 520 525

Ala Asp Val Glu Arg Tyr Ala Leu Met Asn Pro Lys Lys Pro Tyr Ile

530 535 540

Leu Cys Glu Tyr Ser His Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Asn Leu Tyr

545 550 555 560

Lys Tyr Trp Glu Leu Phe Asp Gln Tyr Pro Ile Leu Gln Gly Gly Phe

565 570 575

Ile Trp Asp Trp Lys Asp Gln Ala Leu Gln Thr Thr Ala Glu Asp Gly

580 585 590

Thr Ser Tyr Leu Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp Thr Pro Asn Asp

595 600 605

Gly Asn Phe Cys Gly Asn Gly Leu Ile Phe Ala Asp Gly Thr Ala Ser

610 615 620

Pro Lys Ile Ala Glu Val Lys Lys Cys Tyr Gln Pro Val Lys Trp Thr

625 630 635 640

Ala Val Asp Ala Ala Lys Gly Lys Cys Ser Val Gln Asn Lys His Leu

645 650 655

Phe Thr Asn Leu Asn Ala Tyr Asp Phe Val Trp Thr Val Glu Lys Asn

660 665 670

Gly Glu Leu Val Glu Lys His Ala Ser Leu Leu Asn Val Ala Pro Asp

675 680 685

Gly Thr Glu Glu Leu Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Tyr Glu Gln Glu Asn

690 695 700

Glu Thr Asp Glu Phe Val Leu Thr Leu Ser Leu Arg Leu Ser Lys Asp

705 710 715 720

Thr Ala Trp Ala Ser Ala Gly Tyr Glu Val Ala Tyr Glu Gln Phe Val

725 730 735

Leu Pro Ala Lys Thr Ala Val Pro Ser Val Lys Ala Ala His Pro Ala

740 745 750

Leu Thr Val Asp Gln Asn Glu Gln Thr Leu Thr Val Thr Gly Thr Asn

755 760 765

Phe Thr Ala Ile Phe Asp Lys Arg Lys Gly Gln Phe Ile Ser Tyr Asn

770 775 780

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785 790 795 800

Arg Ala Val Thr Asp Asn Asp Leu Gly Asn Lys Leu His Glu Arg Cys

805 810 815

Gln Thr Trp Arg Gln Ala Ser Leu Gly Gln His Val Gln Asn Ile Ser

820 825 830

Val Gln Pro Gln Ile Asp Phe Val Ile Ile Ser Val Glu Leu Ala Leu

835 840 845

Asp Asn Ser Leu Ala Ser Cys Tyr Val Thr Tyr Thr Leu Tyr Asn Asp

850 855 860

Gly Glu Met Lys Ile Glu Gln Ser Leu Ala Pro Ser Glu Thr Met Pro

865 870 875 880

Glu Ile Pro Glu Ile Gly Met Leu Phe Met Met Asn Ala Ala Phe Asp

885 890 895

Ser Leu Thr Trp Tyr Gly Arg Gly Pro His Glu Asn Tyr Trp Asp Arg

900 905 910

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915 920 925

Val Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Cys Gly Asn Lys Thr Asp Val

930 935 940

Arg Trp Ala Thr Ile Thr Asn Asp Gln Gly Arg Gly Phe Leu Ile Lys

945 950 955 960

Gly Leu Pro Thr Val Glu Leu Asn Ala Leu Pro Tyr Ser Pro Phe Glu

965 970 975

Leu Glu Ala Tyr Asp His Phe Tyr Lys Leu Pro Ser Ser Asp Ser Val

980 985 990

Thr Val Arg Val Asn Tyr Lys Gln Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser

995 1000 1005

Trp Gly Ala Lys Thr His Pro Asp Tyr Thr Leu Tyr Ala Asn Arg

1010 1015 1020

Ser Tyr Thr Asn Thr Phe Thr Leu Lys Pro Leu

1025 1030

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SF

<400> 3

gcgggatccg acgacgacga cgacaagatg ttaaaaaccg gcaagaaatt 50

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SR

<400> 4

gcgctcgagt tatagaggtt ttagcgtaaa cg 32

Claims (10)

1.一种耐有机溶剂转糖基β-半乳糖苷酶高产菌株，其特征在于，其为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）YZ08，已于2015年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO：M 2015086。

2.一种由权利要求1所述菌株生产的半乳糖苷酶，其氨基酸序列表如SEQ ID No：2所示。

3.一种基因，其编码权利要求2所述的半乳糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

5.一种重组表达载体，包含如权利4所述的核苷酸序列。

6.一种重组表达转化体，包含如权利要求5所述的重组表达载体。

7.权利要求6所述的重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal；所述重组大肠埃希氏菌制备方法为，耐有机溶剂糖苷酶GAL基因用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达载体pET-gal，将前述重组表达载体pET-gal转化至大肠杆菌(E.coli) JM109 (DE3) 中，获得重组大肠埃希氏菌(E.coli)JM109 (DE3)/pET-gal。

8.权利要求2所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在于，以乳糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用以寡糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行；所述的条件为：采用0 %或10 %的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为20~100 mmol/L，乳糖浓度为0.5 mol/L，β-半乳糖苷酶的用量为0.5 U/mL，在pH5.0~9.0的缓冲溶液中，35 ℃反应3-12 h。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述核苷类药物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、拉米夫定、吉西他滨中任一种；所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMSO、DMF中的一种或几种；所述非水相条件为：采用10 %的二甲基亚砜，20 mM阿昔洛韦或100 mM叠氮胸苷或100mM拉米夫定或100 mM吉西他滨，500 mM乳糖为糖基供体，加入0.5 U/mL β-半乳糖苷酶，在50 mM pH7.4的磷酸缓冲液中，于35 ℃反应3-12 h。