CN104894022B - 一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，一种半乳糖苷酶以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。该菌株分类命名为Lactobacillus casei YZ09，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2014540。本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。菌株YZ09所产半乳糖苷酶具有溶剂耐受性好、作用pH范围广、底物特异性好等性质。该半乳糖苷酶能廉价易得的乳糖为供体在非水相体系中修饰核苷类药物，具有很好的工业应用价值。

Description

一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因 和应用

技术领域

本发明涉及一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂半乳糖苷酶，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。

技术背景

叠氮胸苷、阿昔洛韦等核苷类药物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于临床治疗各种癌症。叠氮胸苷是第一个抗HIV病毒药物，阿昔洛韦则是目前临床上最有效的抗Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒之一，对急性视网膜坏死水痘带状疱疹病毒和EB病毒等其他疱疹病毒也有疗效。然而，叠氮胸苷由于高血浆浓度而引发较强的毒副作用，阿昔洛韦则会对血液系统、神经系统、消化系统等具有一定的毒副作用。为了获得最佳治疗效果和较小毒副作用，可以对叠氮胸苷等核苷类药物进行糖基化修饰。糖基化是一类重要的改性修饰反应，不仅会改变化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。研究表明(Abram R., Aman N., vonBorstel R., et al. Cell Biophysics, 1994, 24-25(1):127-133)5-氟尿苷的半乳糖衍生物（5’-O-β-半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍。Bonina等(Bonina, F., Puglia, C.; Rimoli, M. G.; Avallone, L., Abignente, E.; Boatto,G.; Nieddu, M.; Meli, R.; Amorena M.; de Caprariis, P. Eur. J. Pharm. Sci.,2002, 16(3): 167-174)也报道了叠氮胸苷的半乳糖基衍生物不仅可以降低叠氮胸苷的血浆浓度，而且可以保持有效浓度更长时间，避免频繁给药。

目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保护步骤，工艺非常复杂。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。Binder等(Binder W.H., Kiihlig H., Schmid W. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNPG)和四种天然核苷（2’-脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3-7 %，区域选择性很差。Andreotti等(Andreotti G.,Trincone A., Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007,47(1-2):8-32)利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳糖苷酶，以邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(oNPG)为糖基供体，催化叠氮胸苷半乳糖基化生成5’-O-β-半乳糖基-叠氮胸苷，产率达到了43 %，但其对底物的转化率仅为21.5 %。颜丽强等人(Yan L Q, Li N, ZongM H. Journal of Biotechnology, 2012, 164(2):371-375)利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG为供体进行了阿昔洛韦等无环核苷的半乳糖基化反应，但是对底物的转化率仅有13%，而且底物浓度仅为0.01 M。

虽然说在过去几年中生物法糖基化修饰核苷类药物取得了一定的突破与进展，但仍存在一些问题亟需解决。目前酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是oNPG或者是pNPG，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。而通常的酶法催化在水中进行，而要修饰阿昔洛韦等不溶于水或者难溶于水的化合物时，低产率及低转化率也成为糖基化修饰的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差的问题，还可以对产物进行一定程度的调控，如果再以寡糖为糖基供体，将能很好地克服目前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题。因此，筛选以寡糖为糖基供体在非水相中糖基化修饰核苷类药物的半乳糖苷酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一种有机溶剂耐受性好、以乳糖为糖基供体的β-半乳糖苷酶及其产生菌，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。

为了实现本发明的目的，本发明首先从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株耐有机溶剂β-半乳糖苷酶产生菌，分类命名为干酪乳杆菌YZ09(Lactobacillus casei YZ09)，其保藏编号为CCTCC：M 2014540。

本发明对干酪乳杆菌Lactobacillus casei YZ09的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌株，无芽孢的杆菌，兼性厌氧，最适生长温度为30～40℃。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应结果为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇等。

经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为Lactobacillus casei。

本发明对该耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09进行了产酶优化，优化后产酶量达到了6.58 U/mL

本发明分离克隆到Lactobacillus caseiYZ09菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂糖苷酶GAL基因全长1797个核苷酸，编码598个氨基酸。

本发明构建了耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL基因的表达载体。它可以通过本领域常规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体pET-gal。

本发明将上述重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)。将前述重组表达质粒pET-gal转化至(E.coli) JM109 (DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal。

本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β-半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β-半乳糖苷酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌JM109 (DE3)/pET-gal接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6-1.0时，在终浓度为0.1-1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。

本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可以是上述产生的重组β-半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞。

另一方面，本发明提供一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。该方法包括将具有本发明半乳糖基化酶活力的物质加入含有核苷类化合物的转化夜中，进行生物转化反应，使核苷类化合物转化为半乳糖基核苷类衍生物，所述转化液中含有核苷类化合物和糖基供体，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦，所述糖基供体为乳糖。

优选地，所述具有半乳糖基化酶活力物质包括具有半乳糖基化酶活力的发酵液、发酵液上清、纯化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重组表达蛋白。

优选地，所述半乳糖基化酶为β-半乳糖苷酶，更优选地，所述β-半乳糖苷酶为本发明中菌株YZ09所产β-半乳糖苷酶或其重组表达蛋白。

优选地，所述反应在非水相反应条件中进行。

优选地，所述的非水相条件为：采用5~20 %的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为10~300 mmol/L，乳糖浓度为0.1~1.5 mol/L，半乳糖酶的用量为0.5~10 U/mL，在pH5.0~9.0的缓冲溶液中，30~55 ℃反应1~12 h；优选的，非水相条件为10 %的亲水性有机溶剂，20 mM阿昔洛韦或100 mM叠氮胸苷，500 mM乳糖的糖基供体，1 U/mL β-半乳糖苷酶，50 mMpH7.4的磷酸缓冲，45 ℃反应6 h。更优选地，核苷类药物与乳糖的摩尔比为1∶3~1∶10。

优选地，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、肌苷、尿苷、2'-脱氧尿苷、5-氟-2'-脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷、胞苷。

优选地，所述的亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、乙醇或丙酮中的一种或几种；

另一方面，本发明提供一种本发明菌株所产半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在于，包括如下内容：

（一）将重组大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal，接种至含卡那霉素的LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0）中，37 ℃振荡培养过夜，按2%(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 ℃、180 rpm摇床培养，当培养液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 ℃诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，得到重组β-半乳糖苷酶的粗酶液。

（二）在pH7.4磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500 mmol/L，叠氮胸苷100 mmol/L或20 mM阿昔洛韦，加入上述（一）所得的粗酶液，在45℃，转速180 rpm条件下反应，定时取样。

本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研究中存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种新的β-半乳糖苷酶及利用重组β-半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的方法。反应以廉价易得的乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。

附图说明

图1为基因gal的PCR扩增电泳图，其中：1. DNA Marker；2~5. 基因gal的PCR扩增产物。

图2为重组β-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图（1：蛋白Marker；2：纯酶；3：细胞破碎液）。

图3为重组β-半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。

图4为pH对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图5为温度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图6为底物浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图7为乳糖浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图8为酶添加量对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图9为有机溶剂种类对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图10 为有机溶剂浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

图11为反应时间对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。

本发明所涉及的生物材料，是一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，其属于乳杆菌属，命名为Lactobacillus casei YZ09，已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保藏中心，地址为：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014540。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。

初筛采用如下方法：以X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）为底物，将本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝色，说明该菌株具有β-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，X-Gal 0.1g/L，pH 7.0，琼脂20g/L。培养温度为37 ℃，培养时间为12-36 h。此方法可筛选到大量耐有机溶剂β-半乳糖苷酶产生菌。

将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵培养基，具体配方为：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，pH 7.0。培养温度为37 ℃，培养时间为24 h，摇床转速为180 rpm。发酵结束后取0.4 mL发酵液加入至总体积1 mL含有0.1 mL DMSO，2.5 g/L叠氮胸苷，2.5 g/L阿昔洛韦，100 g/L乳糖，50 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的2 mL离心管中，37 ℃，180 rpm反应24小时后，取样用甲醇终止转化反应，反应液经HPLC检测，计算转化率，选取能半乳糖基化修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦且转化率最高的菌株作为目标菌株。通过上述方法，发明人获得了一株半乳糖基化修饰叠氮胸苷及阿昔洛韦的耐有机溶剂菌株YZ09。

实施例2

本实施例说明耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09的生物学性质、鉴定。

菌株YZ09的生物学性质：该菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，显微镜观察菌体为杆菌，兼性厌氧，最适生长温度为30～40 ℃。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应结果为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇等。

经16S rDNA序列分析，菌株YZ09鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09，已经保藏。分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09保藏日期为2014年 11月2 日，保藏单位全称为中国典型微生物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014540。

实施例3

本实施例说明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09发酵产酶方法。

平板培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，K₂HPO₄ 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰 0.2 g/L，琼脂20 g/L，pH6.5，溶于水。

种子培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，K₂HPO₄ 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰 0.2 g/L，pH6.5，溶于水。

种子液制备：250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。刮取平板培养24 h的菌株YZ09，接入种子培养基中，摇床转速为180 rpm，培养温度为37 ℃，培养时间为10~12h，得到种子液。

产酶发酵培养基配方：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，pH 6.5。

250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。将种子液接种产酶发酵培养基，接种量为2 %(v/v)，发酵温度37 ℃，摇床转速为180 rpm，发酵时间为24 h。发酵结束后，取发酵液于8000 rpm、4 ℃离心10 min，弃上清，去菌体用与发酵液相同体积的50 mM磷酸缓冲液(pH7.0)重悬，超生破碎，于8000 rpm、4 ℃离心10 min，取上清为粗酶液，酶活达6.58U/mL。

实施例4

本实施例说明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09所产β-半乳糖苷酶GAL编码基因的分离克隆程序。

采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。根据干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 12A(NCBI Reference Sequence :NC_CP006690.1)的全基因测序结果进行分析，获得一个编码β-半乳糖苷酶的基因，根据该基因序列设计引物SF和SR。

SF (SEQ ID NO：2)序列为：GCGGGATCCATGACGACCTTTTCGATCGATC，

SR (SEQ ID NO：3)序列为：GCGGTCGACTTATTCCTCCTCTGTGTTCAGT。

其中，引物SF下划线部分为BamHⅠ酶切位点，引物SR下划线部分为SalⅠ酶切位点。

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) YZ09的基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，引物SF和SR各1 μL，DNA模板1 μL和ddH2O 7 μL。PCR扩增步骤为：(1) 95 ℃，预变性5 min；(2) 95 ℃，变性30 s；(3) 55 ℃，退火30 s；(4)72 ℃，延伸2 min；步骤(2)~(4)重复30次；(5) 72 ℃彻底延伸7 min，冷却至4 ℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带（图1）。获得一条完整的β-半乳糖苷酶基因序列，全长1797 bp，命名为gal，其碱基序列如表中SEQ ID NO :1。

实施例5

本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备 。

将实施例4所得的β-半乳糖苷酶基因片段在37 ℃用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切12 h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经BamHⅠ和SalⅠ酶切后的质粒pET28a，在16 ℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-gal。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal。

实施例6

本实施例说明重组β-半乳糖苷酶的诱导表达与纯化过程。

将实施例5所得的重组大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal，接种至含卡那霉素的LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0）中，37 ℃振荡培养过夜，按2 %(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 ℃、180rpm摇床培养，当培养液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG作为诱导剂，30℃诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，即为重组β-半乳糖苷酶的粗酶液。

粗酶液用Ni-NTA Agarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，得到了电泳纯β-半乳糖苷酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。

实施例7

本实施例说明β-半乳糖苷酶活力测定过程。

通过检测410 nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活力。β-半乳糖苷酶活力测定方法如下：用50 mM磷酸缓冲液(pH7.0)配置浓度为10 mmol/L 的oNPG底物溶液。反应体系中先加入10 μL适当稀释的酶液，再加入240 μL底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为37 ℃，反应时间为10 min，在410 nm波长下检测反应结束时生成的oNP的量。以灭活酶液为空白对照。每1个单位(U)β-半乳糖苷酶定义为：在相应条件下，每分钟催化oNPG水解产生1 μmol oNP所需的酶量。

实施例6制备的粗酶液酶活为147.28 U/mL。

实施例8

本实施例考察β-半乳糖苷酶GAL的有机溶剂耐受性。

将纯化后的β-半乳糖苷酶GAL稀释液分别加入6种亲水性有机溶剂中，其混合比例为酶液：有机溶剂=4∶1(v/v)，以加入相同体积50 mM磷酸缓冲液(pH7.0)为对照。37 ℃，120rpm振荡，每隔12 h取样检测β-半乳糖苷酶GAL的剩余活力，以缓冲液初始酶活为对照。β-半乳糖苷酶GAL具有良好的有机溶剂耐受性，在20 %甲醇、乙醇、DMSO、丙酮中处理96 h，其酶活几乎没有损失（图3）。

实施例9

本实施例说明不同因素对叠氮胸苷半乳糖基化的影响。

分别设计pH、温度、底物浓度、乳糖浓度、酶量、有机溶剂种类、有机溶剂浓度、反应时间等作为单变量因素，研究其对转化率的影响。实验结果(图4-11)表明最适反应pH为7.4左右，最适反应温度为45 ℃，最适底物浓度为100 mM，乳糖浓度为500 mmol/L，酶添加量为1U/mL，最适反应体系为10%(v/v)二甲基亚砜，反应6 h达到最大转化率。

实施例10-18

本实施例说明β-半乳糖苷酶GAL在非水相体系中修饰核苷类化合物的应用。

在pH7.4磷酸缓冲液中加入10 % (v/v)二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500 mmol/L，核苷类化合物20 mmol/L或100 mmol/L，加入1 U实施例3或实施例6制备的GAL粗酶液，在45 ℃，180 rpm条件下反应6 h后取样。样品用甲醇稀释适当倍数，采用HPLC进行检测，结果见表1。

表1. GAL非水相合成半乳糖基核苷类化合物结果

结果表明β-半乳糖苷酶GAL在非水相中以乳糖为糖基供体，具有良好的修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦的能力，表明该酶将来在修饰新型核苷类药物中具有巨大潜力，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用

<130> xb15061003

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> Lactobacillus casei YZ09

<400> 1

atgacgacct tttcgatcga tcatgagttt atgttggacg gtcagccgtt caagattctg 60

tctggcgcga ttcattactt ccgagtccat cccagtgatt ggtatcacag cctttataac 120

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aagccagcga tgaggcaagc ggacaatccg ttgacggcga aagtttcatt attctcagta 1080

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<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SF

<400> 2

gcgggatcca tgacgacctt ttcgatcgat c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SR

<400> 3

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Claims (10)

1.一种耐有机溶剂半乳糖苷酶的高产菌株，其特征在于，其属于乳杆菌属，命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）YZ09， 已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014540。

2.一种由权利要求1所述菌株生产的半乳糖苷酶，其特征在于，所述半乳糖苷酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO ：1所示。

3.一种重组表达载体，其包含如权利2所述的核苷酸序列。

4.一种重组表达转化体，其包含如权利要求3所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于，其为重组大肠埃希氏菌(E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal；所述重组大肠埃希氏菌的制备方法为：半乳糖苷酶的编码基因用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达载体pET-gal，将重组表达载体pET-gal转化至大肠杆菌(E.coli) JM109 (DE3) 中，获得重组大肠埃希氏菌 (E.coli) JM109 (DE3)/pET-gal。

6.权利要求2所述的半乳糖苷酶在酶法生产半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在于，半乳糖苷酶与乳糖在含有10%DMSO的有机溶剂中进行反应。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，0.5~10U/mL的半乳糖苷酶与0.1~1.5mol/L的乳糖，以及10~300mmol/L的核苷类化合物，在含有10%DMSO的pH5.0~9.0的缓冲溶液中，30~55℃反应1~12 h。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，1U/mL的半乳糖苷酶与500mM的乳糖，以及20 mM阿昔洛韦或100 mM叠氮胸苷，在含有10%DMSO的50 mM pH7.4的磷酸缓冲液中，45℃反应6h。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、肌苷、尿苷、2'-脱氧尿苷、5-氟-2'-脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷或胞苷。

10.一种权利要求5所述的重组表达转化体在酶法生产半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在于，包括如下内容：

（1）将重组表达转化体，接种至含卡那霉素的LB培养基中，LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0；37 ℃振荡培养过夜，按2 %v/v的接种量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 ℃、180 rpm摇床培养，当培养液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 ℃诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞；将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，得到半乳糖苷酶的粗酶液；

（2）向pH7.4的磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜、500 mmol/L的乳糖、以及100mmol/L的叠氮胸苷或20 mM的阿昔洛韦、上述（1）中所得的粗酶液，在45℃，转速180 rpm条件下反应，定时取样。