CN107002055A - 真菌来源的高温酸性β‑葡萄糖苷酶及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
提供了真菌来源的高温酸性β‑葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。提供的β‑葡萄糖苷酶最适pH值为4.5，最适温度为75℃，在60℃下处理1h保留最适条件90％以上的酶活力。包含该β‑葡萄糖苷酶的编码基因的重组工程酵母菌株GS115/bgl3A具有高发酵水。
Description
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种真菌来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现，后来的研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶系的一个重要组成部分，可催化纤维素降解的最后一步反应，消除纤维二糖对外切和内切葡聚糖酶的抑制作用。
β-葡萄糖苷酶的水解活性在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值，特别是随着近年来环境能源等危机的加重，纤维素作为自然界最广泛的碳源受到各国政府的高度重视。能源方面，在农业秸秆和废弃纸浆处理过程中添加β-葡萄糖苷酶可促进秸秆纤维物质彻底水解为葡萄糖，可供酵母发酵生产乙醇，实现生物质能源的高效转化利用，并在一定程度上减少环境污染，具有重大的能源和环境共同可持续发展意义。另一方面，植物中有数百种不同的带有β-糖苷键的风味前体，而在食品、饮品工业中，这些糖苷键的水解可以提高产品的质量和口感。β-葡萄糖苷酶作为风味酶水解这些风味前体产生需要的糖苷，但其过程缓慢并不完全，所以人工在生产中或生产后加入外源的β-葡萄糖苷酶，能够有效的改善产品的品质(Williams et al.,1982)。β-葡萄糖苷酶也可以通过水解糖苷，释放维生素B6、抗氧化物及其它的营养物质，增加食品、饮品的营养。β-葡萄糖苷酶还被广泛用于水解大豆异黄酮，制备高活性的大豆异黄酮苷元产品，在饲料和医药行业潜力巨大。
β-葡萄糖苷酶还具有一定的糖苷转移酶活性，β-葡萄糖苷酶可用于工业化生产低聚龙胆糖，低聚龙胆糖是龙胆二糖、三糖和四糖的混合物，可保持食品中的水分，同时低聚龙胆糖具有轻微的苦味，特别适合于咖啡制品和巧克力制品中的应用，具有增味或味觉改良的作用，由于低聚龙胆糖显著的保健功能，正日益受到消费者的青睐(彭喜春等,2001)。
本发明的高温酸性β-葡萄糖苷酶可较好地满足生物质转化、工业生产和饲
用酶制剂的应用需求，且其高表达量和高催化效率可大大降低生产成本，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种真菌来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A。
本发明的另一目的是提供编码上述高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因bgl3A。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性β-葡萄糖苷酶的方法。
本发明的另一目的是提供上述高温酸性β-葡萄糖苷酶的应用。
本发明从嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces emersonii 12802)中分离得到一种新的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A，并构建了能够高效表达此β-葡萄糖苷酶的重组酵母菌株。
本发明提供了一种高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A，其选自：
(a)包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽；或者
(b)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的多肽。
SEQ ID NO.1：
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PKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
其中，该酶包括737个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“mlaeqiflsvlaaavtvqa”(SEQ ID NO.3)。
因此，成熟的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的理论分子量为76.3 kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAGINAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQACAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGYIMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPPVAFSSWNGGKANVDVTGDHKSVVRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLAMGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIAKQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKELFDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
本发明的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A具有高温酸性、高催化效率等特性。本发明筛选到Talaromyces emersonii 12802所产生的一种第3家族β-葡萄糖苷酶，其最适pH值为4.5，,最适温度为75℃，在60℃下处理1h保留最适条件90％以上的酶活力，热稳定性较好，37℃下也具有较高的催化活力。
本发明提供了编码上述高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的基因bgl3A，具体地该基因：
(a)编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽；
(b)编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的多肽；
优选地，根据本发明的编码上述高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的基因bgl3A，所述基因选自：
(a)包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核酸分子的DNA；或
(b)在严谨条件下与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示DNA序列杂交、且编码且具有木聚糖酶活性的多肽的DNA分子。
具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：
agcgccgcactccagtattccggtgatttccagcgacattgatgcggggaaggaatcaaggggacatcatccctggaattcctataagatggccgtcacccacgcatgaaaaataaaanatgctccttttgatntgcgactcgagtacccacagcgacagcgacgatcaccatgcttgctgagcaaatcttcctgagtgttctggcagcagccgtcactgtccaggcctatggcttcggcggctctggctgggacgccgcttatggcagagcaaaggctgcgctgaacaagntcaaccagaccgagaaggttggtatcgtcaccggtgtcaagtggatgggcggcccttgtgttggcaacacctacaagcccagttcgattgantacccttctctgtgtttgcaagactctcctctcggggtgcgttttgccaaccctgtgactgccttcccggntggtatcaacgccggcgccacatgggatagatctctcatcaacgcccgtggtgcggccatgggcgctgaggccaagggcctcggtgtgaacgtccagcttggccccgtcgctggtcctctcggcaagaatcccaatagtggcagaatctgggaagggttctcgaatgatccctatctcagcggtgttgcgatggaggaaaccatcgccggaatgcaaggatctggtgtgcaggcctgcgccaaggtacgtggatctcgttcttgcaacatgtacgatctgttgagggctgacacgatacctgaatctatagcactatattggtaacgagcaagagcacaaccgtgaaaccatcagctccaacatcgatgaccgcactctgcacgagctctacgtctggccgttcatgaacgccgtcaaggccaacgtcgcctccgtcatgtgctcgtacaacaaggtcaatggttcctggtcctgtgagaatgatgctcttctcaacggtctgttgaagactgagctcggattccccggatacatcatgagcgattggaacgcgcagcacaccacggtcaacagcgccaactcgggtctcgatatgaccatgcctggcagtgacttcaacaaccctcctggcagcatctgctgggggcccaacctcgaagccgccgtcgccaatggctccgttccgcagtcccgtttggacgacatggtcactcgtatccttgcgtcttggcacttggttggccaggatgagggctacccaccggtcgccttcagctcctggaatggcggcaaggccaatgttgacgtgacgggcgatcacaagagcgtcgtcagagctgtggctcgtgactctaccgttcttctgaagaacgacaataacgctttgcctctgcgcaagcccaagagcctcgcgatcatcggccaggatgcaaccgtcaaccctgccgggcccaacgcttgctctgatcgcggctgcgacactggtactctcgccatgggttggggcagtggtaccgctcagttcccagtgagtcgtcccattgcaacttccacaggagcgaccggtgactaacaagcacctagtacatcgtcggccctctcgatgctatccagtctcaggctgccgctgatggcactaacatcaccaccagcgcgaccgatgataccaccgcggcagcttctgcagccgcctccgccggaaccgccatcgtcttcatcaactccgactctggtgaagggtaagcccgggcgtcaagatcctcgtacagatgggcccgcatcgctaacattctacagttacatcaccgtcgagggcaacgctggtgaccgcaacaacctcgacccctggcacaacggcaacgagctcgtccaggccgttgcggctgcgaacaagaatgtcattgtcgtcgtccacagcgtcggtcccgtgatcttggagactatccttgcacagcccaacgtcaaggccattgtgtggcccggtctccctggacaagagagcggcaatgccctggtcgatgttctgtacggctccacctcccccagcggcaagttgccctataccattgccaagcagttcagcgactatggctccacctggacgacctccctggtcgatgacttcaccgagggtctgttcattgactaccgccactttgacgagaacaacattactcccagatacgagttcggatacggcttgtgttagtacttccttctctctctcgtagatccat
gctgtctttgcaacgacacaaactgacatgataatagcttacaccaccttcaaatactccgacctggacgtcaacgtccaggcccgccccggcgcagccgaaggccccatcgtccccggcggcgtcaaggaacttttcgacaccgtcggcaccgtcaccgtcaccgtccagaacagcggcaaggttgccggcgcggaagttgcccagctgtacatcggccttcccgactctgccccgtcgacccctcccaagcagctcagaggattccagaagttgcacctcgcgcccggccagagagagggcgccactttcgaactcacccgccgagacatcagctactgggacgttcagcagcagaagtgggttgttcctagcggtacgttcaaggtctatgttggaagctcgagcagggacattagggagcagggatcttgttgtacgagcacatgacggaggcgacgttgaccgtggtgtgctgcgcgttccaatc
根据本发明的具体实施方式，基于PCR的方法分离克隆了β-葡萄糖苷酶基因bgl3A，DNA全序列分析结果表明，β-葡萄糖苷酶BGL3A的结构基因bgl3A cDNA全长2214bp。其中，信号肽的碱基序列为：
atgcttgctgagcaaatcttcctgagtgttctggcagcagccgtcactgtccaggcc(SEQ ID NO.6)。
成熟的β-葡萄糖苷酶BGL3A的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
tatggcttcggcggctctggctgggacgccgcttatggcagagcaaaggctgcgctgaacaagctcaaccagaccgagaaggttggtatcgtcaccggtgtcaagtggatgggcggcccttgtgttggcaacacctacaagcccagttcgattgactacccttctctgtgtttgcaagactctcctctcggggtgcgttttgccaaccctgtgactgccttcccggctggtatcaacgccggcgccacatgggatagatctctcatcaacgcccgtggtgcggccatgggcgctgaggccaagggcctcggtgtgaacgtccagcttggccccgtcgctggtcctctcggcaagaatcccaatagtggcagaatctgggaagggttctcgaatgatccctatctcagcggtgttgcgatggaggaaaccatcgccggaatgcaaggatctggtgtgcaggcctgcgccaagcactatattggtaacgagcaagagcacaaccgtgaaaccatcagctccaacatcgatgaccgcactctgcacgagctctacgtctggccgttcatgaacgccgtcaaggccaacgtcgcctccgtcatgtgctcgtacaacgaggtcaatggttcctggtcctgtgagaatgatgctcttctcaacggtctgttgaagactgagctcggattccccggatacatcatgagcgattggaacgcgcagcacaccacggtcaacagcgccaactcgggtctcgatatgaccatgcctggcagtgacttcaacaaccctcctggcagcatctactgggggcccaacctcgaagccgccgtcgccaatggctccgttccgcagtcccgtttggacgacatggtcactcgtatccttgcgtcttggtacttggttggccaggatgagggctacccaccggtcgccttcagctcctggaatggcggcaaggccaatgttgacgtgacgggcgatcacaagagcgtcgtcagagctgtggctcgtgactctatcgttcttctgaagaacgacaataacgctttgcctctgcgcaagcccaagagcctcgcgatcatcggccaggatgcaactgtcaaccctgccgggcccaacgcttgctctgatcgcggctgcgacaccggtactctcgccatgggttggggcagtggtaccgctcagttcccatacatcgtcggccctctcgatgctatccagtctcaggctgccgctgatggcactaacatcaccaccagcacgaccgatgataccaccgcggcagcttctgcagccgcctccgccggaaccgccatcgtcttcatcaactccgactctggtgaaggttacatcaccgtcgagggcaacgctggtgaccgcaacaacctcgacccctggcacaacggcaacgagctcgtccaggccgttgcggctgtgaacaagaatgtcattgtcgt
tgtccacagcgtcggtcccgtgatcttggaggctatccttgcacagcccaacgtcaaggccattgtgtggcccggtctccctggacaagagagcggcaatgccctggtcgatgttctgtacggctccacctcccccagcggcaagttgccctataccattgccaagcagttcagcgactatggcaccacctggacgacctccctggtcgatgacttcaccgagggtctgttcattgactaccgccactttgacgagaacaacattactcccagatacgagttcggatacggcttgtcttacaccaccttcaaatactccgacctggacgtcaacgtccaggcccgccccggcgcagccgaaggccccatcgtccccggcggcgtcaaggaacttttcgacaccgtcggcaccgtcaccgtcaccgtccagaacagcggcaaggttgccggcgcggaagttgcccagctgtacatcggccttcccgactctgccccgtcgacccctcccaagcagctcagaggattccagaagttgcacctcgcgcccggccagagagagggcgccactttcgaactcacccgccgagacatcagctactgggacgttcagcagcagaagtgggttgttcctagcggtacgttcaaggtctatgttggaagctcgagcagggacattagggagcagggatctttccgtatttga
成熟蛋白理论分子量为76.3kDa，将β-葡萄糖苷酶基因bgl3A序列及其编码的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定BGL3A是一种新的β-葡萄糖苷酶。其氨基酸序列与来源于Neosartorya fischeri NRRL 181假设的第3家族β-葡萄糖苷酶氨基酸序列一致性最高为83％,与发表的来源于Aspergillus fumigatus Af293的第3家族β-葡萄糖苷酶氨基酸序列一致性最高为82％。
本发明也提供了上述蛋白的衍生物，其可由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多肽序列经过一个或多个(例如，一个或几个，或者如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的选自1～10的值，或者介于上述值中间的范围)氨基酸残基的取代、缺失和/或插入获得，并仍然具有β-葡萄糖苷酶活性。例如，一个常见的策略是保守氨基酸取代，即将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有明确定义。因此，在β-葡萄糖苷酶蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其酶活性。此外，本领域技术人员公知，在基因的克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。
又在一实施例中，本发明的具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白包括由在严谨条
件下与序列表中的SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。如此处所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型地相互间至少60％同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选地，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间具有至少约65％、更优选地至少约70％、且甚至更优选地至少约75％或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知，可在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。严谨杂交条件的一个优选、非限制性实例为：在6×SSC中于约45℃杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。本领域技术人员能够理解，高度严谨条件可通过提高杂交温度，例如至50℃、55℃、60℃或65℃来实现。
另外，本领域普通技术人员将会理解：由于自然变异所致的遗传多态性可在群体中的个体间存在。此类自然变异一般可在β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列中导致1-5％的差异。β-葡萄糖苷酶中任何以及所有这种自然变异产生的、并且不改变β-葡萄糖苷酶功能活性的核苷酸突变和所得氨基酸多态性也在本发明的范围之内。因此，本发明也包括由SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示多聚核苷酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽。
在另一优选的实施方案中，β-葡萄糖苷酶蛋白为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％，或至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，或者至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，更优选地至少约98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％，甚至更优选地至少约99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源于本发明的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的全长氨基酸序列的活性蛋白。介于上述值中间的范围和同一性值(例如，69-90％同源性或98.1-99.9％一致性)也包括在本发明中。
另一方面，本发明提供一种新的β-葡萄糖苷酶基因SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。本发明进一步包括由于遗传密码的简并性而不同于本发明的SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所述核苷酸序列之一的核酸分子、及其编码的β-葡萄糖苷酶蛋白。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子为如在严谨条件下与SEQ ID
NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，优选其等位基因或天然突变体。在另一实施例中，本发明的分离核酸分子具有编码具SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。在再一实施例中，本发明的核酸分子编码与SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列基本一致的全长β-葡萄糖苷酶蛋白质，例如，通过取代、删除和/或插入一个或多个(如一个或几个，或者选自1～10的值)氨基酸残基而源自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的蛋白，或者，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少99％同源的蛋白。该核酸分子优选为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％,或至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.7％、97.8％、97.9％，或至少约98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％,甚至更优选地至少约99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源于SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的核苷酸序列，介于上述值的范围或同一性值(如76～97％同源或97.8～99.9％相同)也包括在本发明中。
本发明提供了包含上述高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组载体，选为pPIC9-bgl3A。将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-bgl3A。
本发明还提供了包含上述高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株GS115/bgl3A。
本发明还提供了一种制备高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶表达；
3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶BGL3A酶蛋白。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细
胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/bgl3A。
上述重组菌株GS115/bgl3A在实验室条件下大瓶诱导表达酶活可达33U/ml，发酵罐诱导表达可达3400U/ml以上的酶活，实现了高表达量发酵。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达β-葡萄糖苷酶蛋白。例如，β-葡萄糖苷酶基因可在如大肠杆菌的细菌细胞、酵母(如毕赤酵母、黑曲霉)、昆虫细胞(如使用杆状病毒表达载体的Sf9细胞或家蚕细胞)或植物细胞(如脓杆菌介导的拟南芥、烟草、玉米等)中表达。从而，本发明涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞、优选毕赤酵母。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，其包括但不限于上述的那些宿主细胞。优选毕赤酵母细胞。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。这个系统因为其表达高水平的异源蛋白的能力而闻名。作为有效的表达系统，许多β-葡萄糖苷酶基因已成功地在毕赤酵母中表达。同样本发明提供的新的β-葡萄糖苷酶基因也在毕赤酵母中表达，并具有高表达水平。因此，通过发酵大规模生产β-葡萄糖苷酶非常容易，并且成本比任何时候都低。
载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。转化或转染宿主细胞的合适方法可在《分子克隆》实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社,NY,1989，Sambrook等人，和其它实验室手册中找到。
本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)β-葡萄糖苷酶蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞制备β-葡萄糖苷酶蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码β-葡萄糖苷酶蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的β-葡萄糖苷酶蛋白的基因)，直至产生β-葡萄糖苷酶蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离β-葡萄糖苷酶蛋白。
本发明的再一方面为在毕赤酵母中表达的β-葡萄糖苷酶。为了测定β-葡萄糖苷酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析的简单方法纯化β-葡萄糖苷酶。经过简单的净化，β-葡萄糖苷酶的纯度足以研究酶学性质的研究。
本发明还提供了上述高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的应用，包括生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是现有微生物来源的β-葡萄糖苷酶普遍酶活不高，催化效率偏低且热稳定性和耐酸能力不足的问题，从而提供一种新的能够成功应用于生物质能源、食品工业和饲料工业中的高催化效率的β-葡萄糖苷酶。本发明所提供的β-葡萄糖苷酶最适pH值为4.5，最适温度为75℃，在60℃下处理1h保留最适条件90％以上的酶活力，热稳定性较好，37℃下也具有较高的催化活力。其重组工程酵母菌株GS115/bgl3A的高发酵水平可较大的降低生产成本。
图1重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的最适pH。
图2重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的pH稳定性。
图3重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的最适温度。
图4重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的热稳定性。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces emersonii 12802)中分离得到一种新的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces emersonii 12802)培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH自然。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH自然)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1蓝状菌(Talaromyces emersonii 12802)β-葡萄糖苷酶编码基因bgl3A的克隆
提取嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces emersonii 12802)基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解120min，每隔20min混匀一次,在4℃下13000rpm离心10min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于-20℃静置30min后,4℃下13000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。
根据第三家族β-葡萄糖苷酶基因的保守区SSNIDD和GLDMT(A)MPGD(S)序列设计合成了简并引物P1，P2
P1:5'-GGCCGCAAYTGGGARGGNTT-3'；
P2:5'-GTCACCAGGCATNGHCATRTC-3'
以Talaromyces emersonii 12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约475bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。
表1.β-葡萄糖苷酶BGL3A TAIL-PCR特异性引物
通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后β-葡萄糖苷酶BGL3A基因DNA全长2682bp，包含5个内含子区域，其成熟基因序列全长2214bp，编码737个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端19个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为76.3kDa。
实施例2重组木聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码β-葡萄糖苷酶BGL3A的基因bgl3A双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟β-葡萄糖苷酶的基因片段(不包含信号肽序列)与表达载体pPIC9连接，获得含有Talaromyces emersonii 12802β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组质粒pPIC-bgl3A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/bgl3A。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定β-葡萄糖苷酶的活力。重组β-葡萄糖苷酶的表达量为33U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达。
以同样的方法构建包含信号肽序列的β-葡萄糖苷酶的基因bgl3A的表达载体，并在毕赤酵母中表达。
分离纯化获得重组β-葡萄糖苷酶。
实施例3重组β-葡萄糖苷酶的活性分析
β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基苯酚(pNP)的量。
反应步骤：125μl 2mM pNPG底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于60℃反应10min，加入1.5mL 1M的Na2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD405值。
酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
实施例4重组β-葡萄糖苷酶的性质测定
测定实施例2获得重组β-葡萄糖苷酶的性质
1、重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例2纯化的重组β-葡萄糖苷酶BGL3A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，β-葡萄糖苷酶BGL3A的最适pH为4.5，在pH3.0下保留部分酶活。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中75℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明β-葡萄糖苷酶BGL3A的pH耐受性。
2、β-葡萄糖苷酶BGL3A的最适温度及热稳定性测定方法如下：
木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在最适温度下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为75℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，β-葡萄糖苷酶BGL3A有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。
3、β-葡萄糖苷酶BGL3A的酶动力学测定方法如下：
用不同浓度的pNPG为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其在75℃下的Km值。经测定，以pNPG为底物时的Km值为0.18mM，最大反应速度Vmax为1308.73μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对β-葡萄糖苷酶BGL3A酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在75℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶的活力没有影响，对SDS具有较好的耐受能力，5mmol/L SDS条件下具有最适条件78％的相对酶活力，而Ag+和Cu2+抑制其部分活力。
5、重组β-葡萄糖苷酶BGL3A的底物特异性
β-葡萄糖苷酶BGL3A底物较为专一，特异性水解非还原端的葡萄糖苷元，对纤维类多聚糖基本没有水解能力(表2)。
表2.β-葡萄糖苷酶BGL3A底物特异性分析
实施例5重组β-葡萄糖苷酶对滤纸的协同降解
滤纸酶活可作为衡量微生物所产纤维素酶系的总活力的指标，直接反应纤维素酶类的水解能力。本实施例中，以Whatman定量滤纸为底物测定了β-葡萄糖苷酶BGL3A与嗜热真菌特异腐质霉的诱导培养上清对滤纸的协同降解，研究其对滤纸的水解能力。
以适量定量滤纸为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，加入100ul特异腐质霉培养上清和100ulβ-葡萄糖苷酶BGL3A稀释酶液(稀释倍数分别为1、10和50，相当于30U、3U和0.6U)作为试验组，以100ul缓冲液替代酶液作为空白对照组，50℃反应1h后，采用DNS法测定生成的还原糖当量。结果表明，添加β-葡萄糖苷酶BGL3A酶液后，试验组分别表现出相对于单独特异腐质霉上清1.296倍、1.198倍和1.129倍的滤纸酶活。说明β-葡萄糖苷酶BGL3A具有较强的水解纤维素的能力，可很好地协同外切纤维素酶和纤维二糖水解酶降解复杂底物。
Claims (10)
- 一种高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A，其特征在于，其选自：(a)包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽；或者(b)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且不改变β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的多肽。
- 高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A，其特征在于，所述基因：(a)编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽；(b)编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且不改变β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的多肽。
- 根据权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A，其特征在于，所述基因选自：(a)包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核酸分子的DNA；或(b)在严谨条件下与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示DNA序列杂交、且编码且具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽的DNA分子。
- 包含权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组载体。
- 包含权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组载体pPIC9-bgl3A。
- 包含权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组菌株。
- 包含权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3A的重组菌株GS115/bgl3A。
- 一种制备高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶表达；3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶Xyl3A。
- 权利要求1所述高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A的应用。
- 权利要求1所述高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A在能源、食品和饲料方面的应用。
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