CN112063605A - 一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于酶工程技术领域。本发明在Thermotoga sp.KOL6来源的β‑葡萄糖苷酶基础上，通过定点突变的方式获得突变体，以巴斯德毕赤酵母KM71为表达宿主，实现突变体基因在毕赤酵母中的高效表达。同时，本发明的复合酶可有效转化纤维素生成低聚龙胆糖；以磷酸膨胀纤维素和葡萄糖为底物酶催化转化制备低聚龙胆糖，复配纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F时，原料的总转化率19.1％，相比野生型β‑葡萄糖苷酶分别提高74.7％。本发明的技术方案具有很高的工业应用价值。

Description

一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1,6糖苷键连接形成的低聚寡糖，主要成分是龙胆二糖，并含有少量的龙胆三糖和龙胆四糖，是一种新型功能性低聚糖。低聚龙胆糖具有极好的益肠道功效，与低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等功能性低聚糖相比，低聚龙胆糖具有低粘度、持水性好、对pH和热非常稳定等特点，可应用于一些其他低聚糖不耐受的食品中；且具备独特的提神苦味，可增加食品口味的丰富性。目前低聚龙胆糖在大众极为喜爱的食品中已有较为广泛的应用，是极具开发前景的高附加值糖类产品。
至今国内外仍仅有日本食品化工株式会社生产该产品(商品名Gentose#45、Gentose#80)，且产量不高，仅350吨，市场缺口较大。随着市场需求的扩大，酶法制备制备低聚龙胆糖具有反应条件温和、菌种安全、污染性小、成本低廉、易于分离等优点，开始受到国内外研究人员的关注，是目前生产低聚龙胆糖的主要发展趋势，但目前未有较为理想的案例报道。早期研究者利用β-葡萄糖苷酶催化逆水解缩合反应以高浓度葡萄糖或酸水解淀粉所得的葡萄糖浆为底物制备低聚龙胆糖，在200-900g/L葡萄糖底物浓度下，转化率大致分布于5-15％之间。近年来逐渐出现了利用β-葡萄糖苷酶转糖苷反应以纤维二糖为底物生产低聚龙胆糖的研究，相比目前以高浓度葡萄糖为底物的反应体系，这种转苷反应体系在催化效率和转化率上均具有明显优势，转化率约为19.6％，但底物纤维二糖成本昂贵，不适合大规模生产；如何开发得到一种能够有效利用廉价底物且可高效制备低聚龙胆糖的方法，成为迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明建立了一种复合酶催化纤维素转化制备低聚龙胆糖的反应体系，在一定浓度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶水解活性的条件下，利用高转糖苷活性β-葡萄糖苷酶取代传统纤维素降解酶体系中的高水解活性β-葡萄糖苷酶，可将纤维二糖转化为低聚龙胆糖，消除纤维二糖的产物抑制；上游纤维素酶对纤维素的水解又可填补纤维二糖的消耗。通过协同反应体系的调控，可实现高效低聚龙胆糖制备。
本发明首先提供了一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位和/或第200位突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶突变体为：将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸得到的，命名为Q34G；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸得到的，命名为Q34M；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为Y200F；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为Q34G/Y200F。
在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶突变体Q34G的氨基酸序列如SEQID NO.9所示，所述β-葡萄糖苷酶突变体Q34M的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述β-葡萄糖苷酶突变体Y200F的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述β-葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了编码上述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的表达载体。
本发明还提供了携带上述基因或者上述表达载体的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌或真菌。
本发明还提供了一种多酶复配制备低聚龙胆糖的方法，所述方法为将纤维素酶和上述β-葡萄糖苷酶突变体添加至含有纤维素和葡萄糖的反应体系中进行反应，得到反应液；从反应液中分离得到低聚龙胆糖。
在本发明的一种实施方式中，所述所述纤维素酶为内切纤维素酶、β-葡聚糖酶、I型纤维二糖水解酶、II型纤维二糖水解酶的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，向反应体系中添加的纤维素酶的浓度为10-50U/g纤维素滤纸酶活。
在本发明的一种实施方式中，向反应体系中添加的纤维素酶的浓度为25-50U/g纤维素滤纸酶活。
在本发明的一种实施方式中，向反应体系中添加的β-葡萄糖苷酶突变体的浓度为100-400U/g葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，向反应体系中添加的β-葡萄糖苷酶突变体的浓度为300-400U/g葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，底物纤维素的浓度为200g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，底物葡萄糖的浓度为100g/L-400g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的pH为5.0。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为24-96h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为96h。
在本发明的一种实施方式中，所述底物纤维素的处理方式为：将纤维素原料采用磷酸膨化预处理获得磷酸溶胀纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：向pH5.0的缓冲液中添加经磷酸溶胀后的纤维素至浓度为200g/L，添加葡萄糖至浓度为400g/L，得到反应体系，向反应体系中添加50U/g纤维素滤纸酶活的纤维素酶和上述400U/g葡萄糖的β-葡萄糖苷酶突变体，在60℃条件下，反应96h。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
本发明还提供了上述突变体或上述基因或上述表达载体或上述微生物细胞或上述制备方法在制备低聚龙胆糖中的应用。
有益效果
(1)本发明的复合酶可有效转化纤维素生成低聚龙胆糖；当以20％磷酸膨胀纤维素(PASC)和40％葡萄糖为底物酶催化转化制备低聚龙胆糖，复配纤维素酶和β-葡萄糖苷酶突变体Q34G、Q34M、Y200F或Q34G/Y200F时，总转化率分别为17.6％、16.0％、16.7％和19.1％，相比野生型β-葡萄糖苷酶分别提高60.6％、46.1％、52.7％和74.7％。其中，转化率最高的复合酶(纤维素酶+β-葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F)以纤维素和葡萄糖为原料制备低聚龙胆糖产量最高可达114.7g/L，纤维二糖转化率可达57.3％。
(2)本发明实现了以更广泛、廉价的纤维素底物来制备低聚龙胆糖，大大降低了工业上低聚龙胆糖的生产成本，因此，本发明的技术方案具有很高的工业应用价值。
附图说明
图1：复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖示意图。
具体实施方式
下述实施例中纤维素、葡萄糖涉及购自上海维塔化学试剂有限公司；大肠杆菌JM109感受态细胞购自上海生工，巴斯德毕赤酵母KM71购自Invitrogen公司；里氏木霉购自中国菌种保藏中心。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
MD固体培养基：YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
YPD液体培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。
YPD固体培养基：在YPD液体培养基基础上，添加20g/L琼脂。
BMGY培养基：YNB 13.4g/L，甘油10g/L，生物素4×10-4g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 6.0)，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
BMMY培养基：YNB 13.4g/L，甲醇1％，生物素4×10-4g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 6.0)，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
发酵种子培养基：酵母粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，甘油30g/L。
BSM培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO4 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油30.0g/L，微量元素盐溶液4.32mL/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
纤维素酶滤纸酶活测定：
用打孔器在Waterman滤纸上打出半径为0.5cm的圆形滤纸小片，取10片圆形滤纸小片置于900μL的适当pH缓冲液中，然后置于一定温度的水浴锅中预热5min，再加入100μL一定稀释倍数的酶液，准确计时3h后加入1500μL DNS终止反应，沸水浴浴5min后于540nm处测吸光值，空白对照组采用热处理失活的酶液以同样的反应体系进行测定。
酶活单位定义为：每分钟水解纤维素底物产生1μmol的还原糖的酶活力为一个滤纸酶活单位(FPU)。
β-葡萄糖苷酶酶活的测定：
反应体系为1mL，pH 5.0的醋酸缓冲液960μL，加入适度稀释的粗酶液20μL，再加入20μL 100mmol/L的pNPG，在60℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入200μL的1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，冰浴5min，于405nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。
β-葡萄糖苷酶酶活的定义为：每毫升酶液每分钟水解pNPG产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。
低聚龙胆糖含量的检测：
采用HPLC检测低聚龙胆糖的含量；
色谱条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，RID示差检测器；流动相为75％乙腈，流速0.8mL/min；柱温35℃。
实施例1：β-葡萄糖苷酶突变体的构建
根据核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶的基因序列，设计并合成引入Q34G、Q34M、Y200F突变的引物，对β-葡萄糖苷酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第34位的Gln密码子变成Gly密码子，第34位的Gln密码子变成Met密码子，第200位的Tyr密码子变成Phe密码子。将突变体基因置于表达载体中并导入巴斯德毕赤酵母进行表达，得到单突变β-葡萄糖苷酶。利用快速PCR技术，以表达载体pPIC9K-TpBgl3A(记载于公开号为CN111500560A的中国专利申请文本中)为模板，构建单突变Q34G、Q34M、Y200F及组合突变Q34G/Y200F。
引入Q34G突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ACGGGAACAAGTTGGGGGAACGGTTCTTGTGTA-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-TACACAAGAACCGTTCCCCCAACTTGTTCCCGT-3’(SEQ ID NO.4)
引入Q34M突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CAAGTTGGATGAACGGTTCTTGTGTAGGCAACA-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-GAACCGTTCATCCAACTTGTTCCCGTCACGATG-3’(SEQ ID NO.6)
引入Y200F突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-TGTGCTCGTGGAATAAAGTGAATGGTACTTATA-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-ACTTTATTCCACGAGCACATCACGCTGGCGACG-3’(SEQ ID NO.8)
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Primerstar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃15s，72℃10min)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到转化产物，将转化产物在LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑取阳性克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后，提取质粒，所有突变质粒均测序正确，将突变质粒转化表达宿主巴斯德毕赤酵母KM71感受态细胞，感受态细胞在MD固体培养基上挑取96个单菌落在新的MD固体培养基上等间距点种，30℃培育1～2d后，全部转接至装有1mL BMGY培养基的深孔板中培养48h，之后将菌体离心，弃上清后用0.5mL BMMY培养基悬浮菌体，并加1％(v/v)的甲醇诱导2d后离心菌体获取上清测酶活，挑选出酶活最高的转化子于-80℃条件下保存；得到的重组菌，分别命名为KM71/pPIC9K-Q34G、KM71/pPIC9K-Q34M、KM71/pPIC9K-Y200F和KM71/pPIC9K-Q34G/Y200F。
实施例2：野生型和突变体β-葡萄糖苷酶的表达及比酶活的测定
能够表达野生型β-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母菌株KM71/pPIC9K-TpBgl3A(记载于公开号为CN111500560A的中国专利申请文本中)。
从冰箱中取出重组菌株KM71/pPIC9K-TpBgl3A和实施例1得到的重组菌株KM71/pPIC9K-Q34G、KM71/pPIC9K-Q34M、KM71/pPIC9K-Y200F和KM71/pPIC9K-Q34G/Y200F的甘油管，分别从中吸取30μL菌液接种于10mL YPD液体培养基中，并在30℃摇床中振荡培养24～36h，得到培养液，分别吸取2.5mL培养液转接至50mL BMGY培养基中，30℃培养24h后，4000rpm离心10min后，过滤收集菌体，用25mL含1％(v/v)甲醇的BMMY培养基悬浮菌体，每24h补加一次0.25mL的甲醇，其中甲醇的终浓度为1％(v/v)，并在30℃条件下培养120h，得到发酵液；将所得发酵液10000rpm离心15min后，取上清即为含有野生酶和突变体Q34G、Q34M、Y200F和Q34G/Y200F的粗酶液。
分别测定上述粗酶液催化水解反应的比活，得到β-葡萄糖苷酶单突变体酶的水解反应比活力列于表1中，其中突变体Q34M的水解反应比活力略有增加，突变体Q34G的水解反应比活力与野生型基本持平，突变体Y200F和组合突变Q34G/Y200F的水解反应比活分别降低至野生型的2.6％和2.1％。酶水解活力的降低有利于转苷反应的发生和转苷产物的积累。
表1粗酶液当中不同的β-葡萄糖苷酶的酶活
Figure BDA0002699016910000061
实施例3：复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖
具体步骤如下：
以预处理纤维素和葡萄糖为原料，多酶复合催化转换制备低聚龙胆糖(如图1所示)。
1、纤维素预处理条件如下：纤维素原料采用磷酸膨化预处理获得磷酸溶胀纤维素(Phosphoric acid swollen cellulose,PASC)配置方法参考Schiilein等(Reference：Schulein.M.Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens[J].Biotechnol,1997,57(1-3):71-81)，有适当调整。具体步骤如下：
(1)称取10g微晶纤维素Avicel，加入30mL去离子水，充分搅拌；缓慢加入500mL预冷的86.2％磷酸溶液，边加边搅拌；在冰浴条件下充分搅拌，直至溶液呈透明粘稠状，无颗粒；
(2)将步骤(1)得到的溶液移至4℃条件下静置12h，使纤维素充分膨化；
(3)向步骤(2)中得到的膨化后的纤维素中加入1L的冰水，边加边搅拌，出现白色絮状物，得到混合物；
(4)将步骤(3)得到的混合物于6000rpm离心20min，收集白色絮状沉淀，弃掉上清(大离心杯)；
(5)重复步骤(3)、(4)后；向得到的白色絮状沉淀中加入10mL 2M Na2CO3，充分搅拌，中和剩余的磷酸；
(6)向步骤(5)中加入1L的冰水，充分搅拌后于6000rpm离心20min，弃上清；
(7)重复步骤(6)，直至溶液的pH达到5-7之间，取沉淀烘干，该沉淀即为磷酸溶胀纤维素，将制备的磷酸溶胀纤维素PASC保存于4℃条件下，备用。
2、纤维素酶的制备
纤维素酶为里氏木霉发酵获得，含内切纤维素酶和纤维二糖水解酶活性，其具体制备步骤如下：
(1)将PDA斜面保存的里氏木霉孢子用无菌水洗下，得到孢子浓度为107cfu/mL的孢子悬液；其中，PDA培养基：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L；
(2)按照2％(v/v)的接种量将孢子悬液接种于装有200mL发酵培养基的1L摇瓶中，搅拌转速200r/min，pH 5.0，30℃培养6d，得到发酵液；其中，发酵培养基：乳糖18g/L，微晶纤维素10g/L，玉米桨粉12g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4 1g/L，CaCl2 0.5g/L，Mandels微量元素营养盐1mL/L，吐温80 2mL/L，pH 4.8。
(3)将步骤(2)得到的发酵液离心取上清，即为纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活，酶活为456FPU/mL。
3、复合酶制备低聚龙胆糖
向50mM的pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中添加步骤1制备得到的磷酸溶胀纤维素(PASC)至浓度为200g/L，添加葡萄糖至浓度为400g/L，添加步骤3得到的纤维素酶粗酶液，浓度为50U/g纤维素滤纸酶活(FPU)，添加实施例2得到的β-葡萄糖苷酶粗酶液，浓度为400U/g葡萄糖，得到反应体系；将反应体系置于60℃，150rpm的水浴摇床中反应96h，每隔24h取一次样，并将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。
检测结果见表2，复合酶催化纤维素和葡萄糖制备低聚龙胆糖，分别采用β-葡萄糖苷酶突变体Q34G、β-葡萄糖苷酶突变体Q34M、β-葡萄糖苷酶突变体Y200F和β-葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F时，总转化率分别为17.6％、16.0％、16.7％和19.1％，其总转化率相比野生型β-葡萄糖苷酶分别提高60.6％、46.1％、52.7％和74.7％。
其中，转化率最高的复合酶(纤维素酶+β-葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F)以纤维素和葡萄糖为原料制备低聚龙胆糖产量最高可达114.7g/L，纤维二糖转化率可达57.3％，具有一定的应用价值。
表2野生酶以及突变体生产低聚龙胆糖的产量
Figure BDA0002699016910000081
实施例4：β-葡萄糖苷酶的来源对低聚龙胆糖产率的影响
具体实施方式同实施例3，区别在于，调整β-葡萄糖苷酶为：来源于绿色木霉的β-葡萄糖苷酶的野生酶(记载于ZL201710485406.7中国专利申请文本中)；总转化率为：8.7％。
实施例5：酶的复配比例对低聚龙胆糖产率的影响
具体实施方式同实施例3，区别在于，调整纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的复配比例。
当固定野生型β-葡萄糖苷酶添加量为400U/g葡萄糖时，分别调整纤维素酶添加量为10U/g纤维素滤纸酶活(FPU)、15U/g纤维素滤纸酶活(FPU)、25U/g纤维素滤纸酶活(FPU)，反应96h，总转化率分别为5.3％、5.9％、8.2％。
当固定纤维素酶添加量为50U/g纤维素滤纸酶活(FPU)时，分别调整野生型β-葡萄糖苷酶添加量为100U/g葡萄糖、200U/g葡萄糖、300U/g葡萄糖，反应96h，总转化率分别为3.7％、4.9％、9.2％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用
<130> BAA200930A
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Thr Ser Asp Trp Asp Glu Ala Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Ser Leu
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Ala Lys Leu Ser Gln Asn Glu Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Thr Ser
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35 40 45
Asp Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Ile Arg Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Asp Arg Ser Leu Ile Lys Asp Arg Gly Ala Ala Leu Gly Glu Glu
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165 170 175
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225 230 235 240
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Ser Leu Ala Ile Ile Gly Ser Asp Ala Ala Val Asn Pro Asp Gly Pro
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Gly Asn Glu Leu Val Gln Ala Val Ala Gln Val Asn Gln Lys Thr Ile
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Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Leu Val Leu Glu Ser Ile Leu Ala
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cagaatgaaa agataggcat cgtgacggga acaagttggc agaacggttc ttgtgtaggc 120
aacacgtatc agccttcctc aatcgactac ccgtctctct gtctccaaga tggccctctt 180
ggtatccgat atgcaaaccc cgtcacggct tttcccgccg gaatcaatgc gggagctacc 240
tgggatcgct ctttgattaa agaccgcggt gctgctctag gagaagaagc aaagtctctt 300
ggggttcatg tatccttggg ccctgttgca ggaccgctgg gcaaagtgcc tcaaggagga 360
agactgtggg aaggattttc ggtcgaccca tatctcagtg gagtcgccat gacggaaacg 420
atcaacggtg ttcagggtgc tggagcccag gcgtgcgcga aacattatat tgggaatgaa 480
caggaaacga atcgcaacta catcgattcg accattgacg accgtgcctt tcatgaactc 540
tacctctggc cctttgcgga tgctgtccgc gcaaacgtcg ccagcgtgat gtgctcgtat 600
aataaagtga atggtactta tacctgtgag aatcctgcag tgctcaatca cactcttaaa 660
acagaactgg gattcaaagg ctacataatg agcgactggg gcgcgcaaca cactacaagc 720
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ggtaatgttc tgtggggtca gaagcttgca gacgcgattt cgaatggaga agttgaacag 840
tctagattgg acgacatggt aacccgaatt cttgcagctt ggtatcttgt tggccaggat 900
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acaggagacc atgccacggt tgtccgtaat gtggcgaggg attcgattgt gctgctgaag 1020
aatgataaca atactcttcc tctctctaag ccaaacagcc tggctatcat cggaagtgat 1080
gcggcagtga accccgacgg tccaaatgcc tgtagtgatc ggggctgtga tactggaact 1140
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<212> DNA
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<400> 4
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<212> PRT
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<400> 9
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Trp Asp Arg Ser Leu Ile Lys Asp Arg Gly Ala Ala Leu Gly Glu Glu
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Leu Gly Lys Val Pro Gln Gly Gly Arg Leu Trp Glu Gly Phe Ser Val
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Gln Gly Ala Gly Ala Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile Gly Asn Glu
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<213> 人工序列
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485 490 495
Glu Pro Asn Val Val Ala Ile Val Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Thr Ala Pro Ser
515 520 525
Gly Lys Leu Pro Tyr Thr Ile Ala Lys Gln Glu Ser Asp Tyr Gly Thr
530 535 540
Ser Val Val Asn Gly Asp Asp Asn Phe Ser Glu Gly Ile Phe Val Asp
545 550 555 560
Tyr Arg His Phe Asp His Ala Asp Ile Glu Pro Arg Tyr Glu Phe Gly
565 570 575
Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Leu Ala Val Asp
580 585 590
Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gly Glu Thr Val Ser Gly Gly
595 600 605
Pro Ser Asp Leu Phe Thr Glu Val Gly Thr Val Ser Ala Ser Val Gln
610 615 620
Asn Thr Gly Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Gly
625 630 635 640
Leu Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe
645 650 655
Gln Lys Ile Leu Leu Glu Ala Asp Glu Ser Asp Thr Ala Ser Phe Ser
660 665 670
Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Gln Glu Gln Lys Trp
675 680 685
Val Val Pro Ser Gly Glu Phe Ser Val Tyr Val Gly Ser Ser Ser Arg
690 695 700
Asp Ile Arg Leu Thr Asp Thr Phe Thr Val
705 710
<210> 12
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gln Thr Ser Asp Trp Asp Glu Ala Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ala Lys Leu Ser Gln Asn Glu Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Thr Ser
20 25 30
Trp Gly Asn Gly Ser Cys Val Gly Asn Thr Tyr Gln Pro Ser Ser Ile
35 40 45
Asp Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Ile Arg Tyr
50 55 60
Ala Asn Pro Val Thr Ala Phe Pro Ala Gly Ile Asn Ala Gly Ala Thr
65 70 75 80
Trp Asp Arg Ser Leu Ile Lys Asp Arg Gly Ala Ala Leu Gly Glu Glu
85 90 95
Ala Lys Ser Leu Gly Val His Val Ser Leu Gly Pro Val Ala Gly Pro
100 105 110
Leu Gly Lys Val Pro Gln Gly Gly Arg Leu Trp Glu Gly Phe Ser Val
115 120 125
Asp Pro Tyr Leu Ser Gly Val Ala Met Thr Glu Thr Ile Asn Gly Val
130 135 140
Gln Gly Ala Gly Ala Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile Gly Asn Glu
145 150 155 160
Gln Glu Thr Asn Arg Asn Tyr Ile Asp Ser Thr Ile Asp Asp Arg Ala
165 170 175
Phe His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Asn
180 185 190
Val Ala Ser Val Met Cys Ser Phe Asn Lys Val Asn Gly Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Glu Asn Pro Ala Val Leu Asn His Thr Leu Lys Thr Glu Leu Gly
210 215 220
Phe Lys Gly Tyr Ile Met Ser Asp Trp Gly Ala Gln His Thr Thr Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ala Asn Ala Gly Leu Asp Met Thr Met Pro Gly Ser Asp Leu
245 250 255
Ser Asn Pro Pro Gly Asn Val Leu Trp Gly Gln Lys Leu Ala Asp Ala
260 265 270
Ile Ser Asn Gly Glu Val Glu Gln Ser Arg Leu Asp Asp Met Val Thr
275 280 285
Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Val Gly Gln Asp Gln Gly Tyr Pro
290 295 300
Ser Val Gln Phe Asn Ser Trp Asn Gly Gly Gln Thr Ser Ala Asn Val
305 310 315 320
Thr Gly Asp His Ala Thr Val Val Arg Asn Val Ala Arg Asp Ser Ile
325 330 335
Val Leu Leu Lys Asn Asp Asn Asn Thr Leu Pro Leu Ser Lys Pro Asn
340 345 350
Ser Leu Ala Ile Ile Gly Ser Asp Ala Ala Val Asn Pro Asp Gly Pro
355 360 365
Asn Ala Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Thr Gly Thr Leu Ala Met Gly
370 375 380
Trp Gly Ser Gly Thr Cys Glu Phe Pro Tyr Leu Val Gly Pro Leu Glu
385 390 395 400
Ala Ile Lys Asn Gln Ala Asn Ala Asp Gly Thr Thr Ile Thr Ser Ser
405 410 415
Thr Thr Asp Ser Thr Ser Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Asn Ala Asp
420 425 430
Val Ala Ile Val Phe Ile Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn
435 440 445
Val Glu Gly Ser Ser Gly Asp Arg Leu Asn Leu Asp Pro Trp His Ser
450 455 460
Gly Asn Glu Leu Val Gln Ala Val Ala Gln Val Asn Gln Lys Thr Ile
465 470 475 480
Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Leu Val Leu Glu Ser Ile Leu Ala
485 490 495
Glu Pro Asn Val Val Ala Ile Val Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Thr Ala Pro Ser
515 520 525
Gly Lys Leu Pro Tyr Thr Ile Ala Lys Gln Glu Ser Asp Tyr Gly Thr
530 535 540
Ser Val Val Asn Gly Asp Asp Asn Phe Ser Glu Gly Ile Phe Val Asp
545 550 555 560
Tyr Arg His Phe Asp His Ala Asp Ile Glu Pro Arg Tyr Glu Phe Gly
565 570 575
Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Leu Ala Val Asp
580 585 590
Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gly Glu Thr Val Ser Gly Gly
595 600 605
Pro Ser Asp Leu Phe Thr Glu Val Gly Thr Val Ser Ala Ser Val Gln
610 615 620
Asn Thr Gly Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Gly
625 630 635 640
Leu Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe
645 650 655
Gln Lys Ile Leu Leu Glu Ala Asp Glu Ser Asp Thr Ala Ser Phe Ser
660 665 670
Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Gln Glu Gln Lys Trp
675 680 685
Val Val Pro Ser Gly Glu Phe Ser Val Tyr Val Gly Ser Ser Ser Arg
690 695 700
Asp Ile Arg Leu Thr Asp Thr Phe Thr Val
705 710

Claims (10)

1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位和/或第200位突变得到的。
2.如权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的。
3.编码权利要求1或2所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述表达载体的微生物细胞。
6.一种多酶复配制备低聚龙胆糖的方法，其特征在于，所述方法为将纤维素酶和权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶突变体添加至含有纤维素和葡萄糖的反应体系中进行反应，得到反应液；从反应液中分离得到低聚龙胆糖。
7.如权利要求6所述的一种多酶复配制备低聚龙胆糖的方法，其特征在于，所述纤维素酶为内切纤维素酶、β-葡聚糖酶、I型纤维二糖水解酶、II型纤维二糖水解酶的一种或多种。
8.如权利要求6或7所述的一种多酶复配制备低聚龙胆糖的方法，其特征在于，向反应体系中添加的纤维素酶的浓度为10-50U/g纤维素滤纸酶活；可选地，向反应体系中添加的β-葡萄糖苷酶突变体的浓度为100-400U/g葡萄糖。
9.如权利要求6-8任一所述的一种多酶复配制备低聚龙胆糖的方法，其特征在于，所述反应体系中，底物纤维素的浓度为200g/L；可选的，底物葡萄糖的浓度为100g/L-400g/L。
10.权利要求1或2所述的突变体或权利要求3所述的基因或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的微生物细胞或权利要求6-9任一所述的方法在制备低聚龙胆糖中的应用。
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