CN116855560A - 一种提高海藻糖转化率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高海藻糖转化率的方法。在海藻糖合酶和海藻糖水解酶双酶法合成海藻糖的过程中，通过添加特定普鲁兰酶，在接近中性pH值条件下，其海藻糖的转化效率提高50%。因此，本发明提供了一种温度和pH性能优良的普鲁兰酶用于生产海藻糖的方法，具有较广的应用价值。

Description

一种提高海藻糖转化率的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及添加普鲁兰酶提高海藻糖转化效率的方法。

背景技术

海藻糖由两个葡萄糖基通过α-1,1糖苷键连接形成，其作为一种安全、稳定的天然二糖，素有“生命之糖”的美誉，被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。

海藻糖生物合成法包括磷酸化酶法、单酶法、双酶法。双酶法合成海藻糖的途径中主要需要两种酶，麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，是以淀粉为底物制备海藻糖的两个关键酶。专利文献CN99123896.6公开了最适温度50℃和最适pH6.0的MTSase和MTHase，转化率可达到80％，日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。

但这两种酶均是以直链淀粉为底物进行反应，降低了底物淀粉的利用率，专利CN108707634B公开了在以上两个酶的基础上额外添加普鲁兰酶、糖基转移酶、环糊精葡萄糖基转移酶等多酶复配的方法生产海藻糖，纯酶体外复配合成海藻糖成本依然居高不下。以上方法在生产过程原理是：淀粉首先经过高温液化并由普鲁兰酶等脱枝酶将其水解为直链淀粉，然后由MTSase识别并与直链淀粉还原性末端结合，通过分子内转糖基作用将α-1,4-糖苷键转化为α-1,1-糖苷键，生成中间产物麦芽糖基海藻糖，随后MTHase作用于与海藻糖基团相连的α-1,4-糖苷键，水解并生成一分子海藻糖以及少两个葡萄糖单元的直链淀粉，直链淀粉在后续反应中继续作为底物。

商品化的普鲁兰酶最适反应温度为55-60℃，最适pH4.5-5.0，pH6.0时活力较低，导致普鲁兰酶和双酶共同转化淀粉生产海藻糖的效率低；而节杆菌、根瘤菌、螺旋短杆菌等来源的MTSase和MTHase在p H 6.5-7.0条件下表现出较高的催化活性，专利文献CN103205475A公开了解决普鲁兰酶和双酶共同转化淀粉生产海藻糖效率低的问题的方法，筛选使用最适反应pH5.5，最适反应温度60℃的海藻糖合酶与海藻糖水解酶合成海藻糖。

综上，双酶法工艺较为成熟，导致海藻糖市场竞争较为激烈。同时为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力，因而控制加酶成本以及提高海藻糖转化率是目前海藻糖产业迫切追求的目标，

发明内容

本发明目的在于控制加酶成本以及提高海藻糖转化率。

对此，本发明提供一种提高海藻糖转化率的方法，其特征在于，在海藻糖合酶和海藻糖水解酶双酶法合成海藻糖的过程中，添加普鲁兰酶来提高海藻糖转化率。

优选地，所述普鲁兰酶是中性Ⅰ型普鲁兰酶。更优选地，所述普鲁兰酶是GeneBank号为HQ844266.1所示的普鲁兰酶。

具体实施方式中，所述海藻糖合成酶的GenBank登录号为AB045141.1的743bp-3016bp之间的序列，所述海藻糖水解酶的GenBank登录号为AB045141.1的3013bp-4740bp之间的序列。

在具体实施方式中，所述普鲁兰酶通过枯草芽孢杆菌(更具体是枯草芽孢杆菌SCK6)中分泌表达得到。

在优选实施方式中，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶通过枯草芽孢杆菌(更具体是枯草芽孢杆菌SCK6)中分泌表达得到。

更优选地，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达通过与普鲁兰酶的结合结构域序列CBM68(具体由如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所编码)串联表达。

在具体实施方式中，反应体系为采用表达获得的海藻糖合酶和海藻糖水解酶混合酶液，底物(优选为麦芽糊精)，并添加所述普鲁兰酶，于40-65℃反应温度水浴反应12-72小时，任选地于100℃煮沸10min终止反应。

优选地，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶酶活浓度为15-25U/ml，所述普鲁兰酶的添加量为1-8U/ml；反应温为55至65℃；反应体系的pH值为5-9；反应时间为24-48h。更优选地，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶酶活浓度为20U/ml，所述普鲁兰酶的添加量为为3-6U/ml；反应温为60℃；反应体系的pH值为6-7；反应时间为24h。

目前，商品化的普鲁兰酶可分为I型和II型，I型普鲁兰酶水解普鲁兰糖、支链淀粉以及其他小分支低聚糖中的α-1,6糖苷键，产物主要是麦芽三糖和一些线性寡糖；II型普鲁兰酶，又名淀粉普鲁兰酶，是一种双功能酶，它除了具有I型普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键的脱支功能外，还能够随机水解淀粉和相关线性寡糖直链上的α-1,4糖苷键，具有α-淀粉酶功能。本发明人前期发现的普鲁兰酶是中性Ⅰ型普鲁兰酶，具有更专一的底物特异性，更利于双酶法生产海藻糖的反应的进行，避免底物浪费。

工业生产中使用的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)：选择来自于分枝节杆菌(Athrobacter ramosus)的海藻糖合酶和水解酶，其最适温度为50℃，最适pH为6.0-7.0。目前市场上的普鲁兰酶多为酸性，最适反应pH 4.5-pH5.0，本发明使用的普鲁兰酶最适反应温度为60℃，最适反应pH为pH6.5，温度和pH与现有技术中酶活较高的海藻糖合酶和海藻糖水解酶具有最相似的反应温度和反应pH，更有利于提高海藻糖转化率，进一步节约生产成本。

其次本发明中将海藻糖合酶和水解酶的基因N端连接CBM68结合结构域，且连接在PMA0911的表达量明显高于传统质粒PHT43。

因此，本发明公开在海藻糖合酶和海藻糖水解酶双酶法合成海藻糖的过程中，通过添加本发明中的普鲁兰酶，在接近中性pH值条件下，其海藻糖的转化效率提高50％。具有较广的应用价值。

附图说明

图1PMA0911-pulA SCK6蛋白电泳图。

图2海藻糖合酶与海藻糖水解酶SDS-PAGE电泳图,其中，1：SCK6/pMC68-ARS、2：SCK6/pMC68-ARH、3：SCK6/pHT43-C68-ARS、4：SCK6/pHT43-C68-ARH。

图3海藻糖转化率提高对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的简述，以期对本发明更好的理解，但不构成对本发明的限制。

实施例1普鲁兰酶表达质粒PMA0911-pulA的构建

以商用PMA0911质粒为模板，使用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切质粒PMA0911；以专利CN102120971 B中公开的普鲁兰酶(GeneBank号：HQ844266.1)序列为模板，设计引物：Pul-F：TTACATATGATGCCCCCAAAACAACAGTC

Pul-R：AGAGGATCCTCAACATTGAATTAATACCCACGCAC

PCR扩增普鲁兰酶序列并命名为pul-seq；使用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切目标序列pul-seq。将以上酶切完成的两个片段混合后，加入T4连接酶，16℃连接2-4h后，转化入大肠杆菌DH5α中。挑选测序正确的单克隆提取构建成功的质粒PMA0911-pulA，将该质粒转化入枯草芽孢杆菌SCK6(购于诺维信)中。

实施例2普鲁兰酶的表达及酶活测定

1、普鲁兰酶重组菌株的发酵培养

将实施例1中构建完成的菌接种至LB培养基中,37℃过夜培养12-15h，1％接种量转接至20ml发酵培养基(蛋白胨：10g/L酵母粉：15g/L K₂HPO₄：2g/L)37℃、220rpm培养48h，12000rpm离心10min取上清，即为普鲁兰酶粗酶液，其表达蛋白电泳图如图1所示。

2、普鲁兰酶酶活测定

DNS方法：在相应的温度下，取450μL反应缓冲液(5％的普鲁兰糖溶液和相应德pH缓冲液以1：8的比例混合均匀)，加入50μL适当稀释的普鲁兰酶粗酶液混合均匀，反应30min，加入500μL DNS溶液终止反应，100℃水浴锅10min，测定OD540值。

酶活力单位定义为：在特定的反应条件下，每分钟水解普鲁兰糖产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖，所需的酶量为1个活力单位(U)。根据以上方法测定PMA0911-pulA在枯草芽孢杆菌SCK6中表达的胞外粗酶液酶活为320U/ml。

根据中国专利申请CN201010576835.3记载的该I型普鲁兰酶的性质如下：该酶的最适反应温度为60℃，最适pH6.5，在60℃、pH6.5条件下80小时，仍具有50％以上的活性。

实施例3海藻糖合酶与海藻糖水解酶载体构建

1、质粒pMC68-ARS、pMC68-ARH、pHT43-C68-ARH、pHT43-C68-ARS的构建

以商用的PMA0911质粒为模板，设计引物

PMA-F：GACTGTTGTTTTGGGGGCATAtgtaaatcgctcctttttaggtg

PMA-R：gctagcttggtacgtacca

PCR扩增PMA0911载体骨架，命名为PMA。

以Genebank注释的普鲁兰酶seq_ID:HQ844266.1为模板，引物C68-F：ATGCCCCCAAAACAACAG,C68-R：AATAAGCTTTAATAGTACGTCTGTCG。PCR扩增CBM68结构域序列(402bp,如SEQ ID No：1所示)，命名为C68(C68仅是普鲁兰酶中一段结合结构域序列，并非全部普鲁兰酶，且该结合结构域可提高外源蛋白表达)。

以Genebank注释的海藻糖合成酶AB045141.1为模板，设计引物

ARS-F：GACGTACTATTAAAGCTTATTGTTCCGGCAAGCACATATAGACG

ARS-R：tctggtacgtaccaagctagcTTAGTGATGATGATGATGATGTGTTTCGACPCR扩增其中743bp-3016bp序列，命名为ARS。

以Genebank注释的海藻糖水解酶AB045141.1为模板，设计引物

ARH-F：ACGTACTATTAAAGCTTATTATGAATCGCAGATTTCCAGTTTG

ARH-R：tggtacgtaccaagctagcTTAGTGATGGTGATGATGATGTTCC

PCR扩增其中3013bp-4740bp序列，命名为ARH。

使用Genebuilder无缝克隆酶将以上PCR获得的片断PMA、C68与ARS混合，50℃条件下连接2h后转化入大肠杆菌DH5α中，涂布含氨苄的LB平板；将片断PMA、C68与ARH混合同样的处理方法转化入大肠杆菌DH5α中，涂布含氨苄的LB平板。

将测序正确的质粒分别命名为pMC68-ARS、pMC68-ARH。

以商用质粒pHT43为模板，引物pHT43-F：AGCCCGCCTAATGAGC,pHT43-R：TGATCCTTCCTCCTTTAATTGGGAAT。PCR扩增pHT43。

以pMC68-ARS为模板，设计引物

C68-ARS-F：TTCCCAATTAAAGGAGGAAGGATCAATGCCCCCAAAACAACAGT

C68-ARS-R：CGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTAGTGATGATGATGATGATGTGTTTCGAC。

PCR扩增C68-ARS。

以pMC68-ARH为模板，设计引物

C68-ARH-F：TTCCCAATTAAAGGAGGAAGGATCAATGCCCCCAAAACAACAGT

C68-ARH-R：CGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTAGTGATGGTGATGATGATGTTCCAG。

PCR扩增C68-ARH。

使用genebuilder将pHT43分别与C68-ARS和C68-ARH混合后50℃条件下连接2h后转化入大肠杆菌DH5α中，涂布含氨苄的LB平板。将测序正确的质粒命名为pHT43-C68-ARH、pHT43-C68-ARS。

2、海藻糖合成重组菌株的构建

上述步骤中构建完成的四个质粒pMC68-ARS、pMC68-ARH、pHT43-C68-ARH、pHT43-C68-ARS分别转化至SCK6，涂布于含有卡纳抗性的LB平板，挑选转化正确的单克隆，分别命名为SCK6/pMC68-ARS、SCK6/pMC68-ARH、SCK6/pHT43-C68-ARS、SCK6/pHT43-C68-ARH。

实施例4海藻糖合酶重组菌株与海藻糖水解酶重组菌的发酵培养、酶活测定

1、海藻糖合酶重组菌株与海藻糖水解酶重组菌的发酵培养

将实施例3中构建完成的菌接种至LB培养基中，37℃过夜培养12-15h，1％接种量转接至400ml发酵培养基(蛋白胨：10g/L酵母粉：15g/L K₂HPO₄：2g/L)37℃、220rpm培养48h，12000rpm离心10min取上清，即为MTSase和MTHase粗酶液。

2、MTSase酶活测定方法

将50μL MTSase已稀释的粗酶液添加至50℃预热的450μL的浓度为1g/L的麦芽糊精溶液中(以10mM pH6的PBS缓冲液溶解)，50℃反应10min，加入500μL DNS溶液，100℃煮沸10min，待反应液冷却后，测定A540值。MTSase的酶活单位定义为：在50℃时，其它条件恒定，单位时间内每消耗1μM麦芽寡糖所需的酶量(麦芽寡糖的还原性按葡萄糖计算)。

3、MTHase酶活测定方法

将1mLMTSase未稀释的粗酶液添加至50℃预热的8mL的浓度为1g/L的麦芽糊精溶液中(以10mM pH6的PBS缓冲液溶解)，50℃反应2h使其完全反应，煮沸10min灭活作为麦芽寡糖基海藻糖备用。

将50μL MTHase已稀释的粗酶液添加至50℃预热的450μL麦芽寡糖基海藻糖合酶中，50℃反应10min，加入500μL DNS溶液，100℃煮沸10min，待反应液冷却后，测定A540值。MTSase的酶活单位定义为：在50℃时，其它条件恒定，单位时间内每水解1μM麦芽寡糖基海藻糖所需的酶量(麦芽寡糖的还原性按葡萄糖计算)。

将发酵培养的SCK6/pMC68-ARS、SCK6/pMC68-ARH、SCK6/pHT43-C68-ARS、SCK6/pHT43-C68-ARH四株菌的粗酶液,其表达的蛋白SDS-PAGE电泳图如图2所示,PMC68的表达量明显高于pHT43-C68。按照上述方法测定海藻糖合成酶和海藻糖水解酶的酶活，测定结果如表1所示。结果表明PMA0911载体表达的MTSase和MTHase的酶活均比pHT43载体来表达要高。

表1不同质粒表达海藻糖合成酶和海藻糖水解酶的酶活

酶名称	pMC68-ARS	pHT43-C68-ARS	pMC68-ARH	pHT43-C68-ARH
					酶活U/ml	21.6	2.8	14.1	3.4

实施例5海藻糖合成体系及转化率计算方法

1、海藻糖合成方法

反应体系：

将pMC68-ARS SCK6和pMC68-ARH SCK6发酵制备的海藻糖合酶和海藻糖水解酶粗酶液前处理：发酵液离心10min，分离得到上清，通过0.22μm的水系滤膜除菌，备用。

底物：配置100g/L的麦芽糊精溶液。

反应：900μL海藻糖合酶和海藻糖水解酶混合粗酶液20U/ml与100μL底物溶液混匀，60℃温度水浴反应24-72小时后，100℃煮沸10min终止反应。

2、海藻糖转化率计算方法

转化产物检测方法：高效液相色谱法

色谱柱：氨基柱(Hypersil NH₂-S色谱柱)

流动相为乙腈：水＝75：25

标准品：海藻糖(纯度＝98％)标准品20mg，加入200μL超纯水溶解，摇匀。使用时用超纯水稀释10倍，并用0.22μm水系滤膜过滤，收集滤液供测定用。

样品制备：将反应结束后的溶液离心10min，取用0.22μ水系滤膜过滤，收集滤液供测定用。

试样的测定：首先用流动相以1.0mL/min的流速冲洗管路30分钟，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相清洗参比池40分钟，走基线，待基线走稳后,将标准溶液和制备好的试样分别进样10uL。根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以外标法计算糖组分的浓度。

结果计算：

式中：Cm—海藻糖浓度，单位为(g/L)；

Am—样品峰面积；

As—标准品峰面积；

Cs—标准品质量，g；

海藻糖转化率的计算：

式中：X₁—海藻糖转化率，单位为(％)；

C_m—海藻糖浓度，单位为(g/L)；

C₀—麦芽糊精浓度，单位为(g/L)。

实施例6海藻糖转化率提高方法

在实施例5中的海藻糖合成反应的体系中，额外添加实施例2制备的普鲁兰酶粗酶液，添加量为0U/ml、1U/ml、3U/ml、6U/ml、8U/ml。pH6.0，60℃恒温摇床中，反应48h后，沸水浴终止反应，根据实施例5的方法HPLC检测转化产物，计算海藻糖转化率。结果如图3所示，添加普鲁兰糖其海藻糖转化率提高23％-50％，其中添加3U/ml普鲁兰糖海藻糖的转化率提高幅度最大，可达50％，转化率高达86％。

在实施例5中的海藻糖合成反应的体系中，额外添加实施例2制备的普鲁兰酶粗酶液3U/ml，选择反应温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH6.0，反应48h，结果如表2所示。结果表明其反应温度在55至65℃转化率高，最佳为60℃。

表2不同反应温度的结果

温度

40℃

45℃

50℃

55℃

60℃

65℃

转化率％

52％

57％

64％

78％

85％

83％

在实施例5中的海藻糖合成反应的体系中，额外添加实施例2制备的普鲁兰酶粗酶液3U/ml，选择反应pH4、pH5、pH6、pH 7、pH 8，反应温度60℃，反应时间48h，结果如表3所示。结果表明pH值在6至7之间转化率超过80％，最佳pH值为pH6.5。

表3不同pH下反应结果

pH

pH4

pH5

pH6

pH6.5

pH 7

pH8

转化率％

39％

58％

85％

89％

81％

70％

在实施例5中的海藻糖合成反应的体系中，额外添加实施例2制备的普鲁兰酶粗酶液3U/ml，选择反应时间24h、36h、48h、60h、72h，反应温度60℃，pH6.5，结果如表4所示。

表4不同反应时间的结果

时间	24h	36h	48h	60h	72h
						转化率％	92％	88％	89％	79％	74％

结果表明反应24h，转化率可达92％。而海藻糖合成酶和水解酶同时添加的反应体系中，海藻糖水解酶在长时间反应中会有副反应，水解1-4糖苷键而影响海藻糖的转化率。

Claims (10)

1.一种提高海藻糖转化率的方法，其特征在于，在海藻糖合酶和海藻糖水解酶双酶法合成海藻糖的过程中，添加普鲁兰酶来提高海藻糖转化率。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶是中性Ⅰ型普鲁兰酶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶是GeneBank号为HQ844266.1所示的普鲁兰酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合成酶的GenBank登录号为AB045141.1的743bp-3016bp之间的序列，所述海藻糖水解酶的GenBank登录号为AB045141.1的3013bp-4740bp之间的序列。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶通过枯草芽孢杆菌（更具体是枯草芽孢杆菌SCK6）中分泌表达得到。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶通过枯草芽孢杆菌（更具体是枯草芽孢杆菌SCK6）中分泌表达得到。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达通过与普鲁兰酶的结合结构域序列CBM68串联表达。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应体系为采用表达获得的海藻糖合酶和海藻糖水解酶混合酶液，底物（优选为麦芽糊精），并添加所述普鲁兰酶，于40-65℃反应温度水浴反应12-72小时，任选地于100℃煮沸10min终止反应。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶酶活浓度为15-25 U/ml，所述普鲁兰酶的添加量为1-8 U/ml；反应温为55至65℃；反应体系的pH值为5-9；反应时间为24-48h。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶和海藻糖水解酶酶活浓度为20U/ml，所述普鲁兰酶的添加量为为3-6 U/ml；反应温为60℃；反应体系的pH值为6-7；反应时间为24h。