CN105950528A - 一种产直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明实现了直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，方法安全、高效，水解活力达到36.6U/mL，产酶能力是原始菌种的10倍以上；获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，产品符合食品要求。利用纯化后的重组直链麦芽低聚糖生成酶水解淀粉，生成不含葡萄糖、含高比例麦芽五糖的直链麦芽低聚糖浆，这种直链麦芽低聚糖浆可直接用于生产功能性食品，也可用于生产高纯度的直链麦芽低聚糖等产品。

Description

一种产直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术
直链麦芽低聚糖通常是指由3—10个葡萄糖单元以α-1,4糖苷键连接而成的聚合体，是一种集营养与功能于一体的新糖源，具有甜度低、口感好、保湿性强等特性，在食品中能起到降甜和改善质构的作用。
特别重要的是，直链麦芽低聚糖具有许多独特的生理保健功能，可作为功能性食品的原料，主要表现为：1)易消化吸收，其不必经过唾液淀酶和胰淀粉酶的消化，可直接由肠上皮细胞中的麦芽糖酶快速水解吸收，能急剧加速肝糖原和肌糖原的恢复，因此适用于婴幼儿食品、老年食品及特殊患者的流质营养食品中；2)渗透压低，食用后可延长供能时间，增强运动员的肌体耐力，抗疲劳，因此适用于运动型饮料的生产；3)保持血糖和胰岛素平衡，食用直链麦芽低聚糖后，其被吸收利用的速度较单、双糖慢，不会导致血糖值急剧升高，减少血乳酸的产生，同时能保持胰岛素平衡，克服了服用单、双糖引起的回跃性低血糖反应，因此适用于胰脏切除病人的饮食治疗和肾病患者的能量来源等；4)改善肠道内环境，其可选择性地促进肠道有益菌的生长，抑制腐败菌的生长，特别是抑制梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)和产气荚膜梭菌的增殖；5)可促进人体对Ca2+的吸收，有效预防中老年骨质疏松；6)不易被细菌所发酵利用，同时可阻止部分高分子糖在牙齿表面结垢，有利于预防龋齿；7)促进人体内双糖酶的成熟和转运，诱导小肠上皮细胞分化。
直链麦芽低聚糖的工业化生产主要采用酶法工艺，即通过直链麦芽低聚糖生成酶从淀粉非还原末端切下多个葡萄糖单元而成。在日本、美国等发达国家已开始批量生产直链麦芽低聚糖，而国内的淀粉糖生产主要集中于麦芽糖和葡萄糖，未见有直链麦芽低聚糖的生产。其中，最重要的原因是直链麦芽低聚糖生成酶被国外所垄断，国内尚未实现其工业化生产，造成直链麦芽低聚糖的生产成本过高。随着直链麦芽低聚糖在各个领域中的应用前景越来越广泛，在国内开发具有工业应用价值的直链麦芽低聚糖生成酶、打破国外对该酶的垄断势在必行。
近年来，国内外研究者一直在尝试对直链麦芽低聚糖生成酶的异源表达，以期大幅提高其产量，突破天然酶的分泌限制，而现有的研究主要集中于直链麦芽低聚糖生成酶在大肠杆 菌中的克隆表达，且主要定位于其细胞质或周质空间，不利于酶的分离纯化及其在食品、医药等领域中的应用。即使是在枯草芽孢杆菌中分泌表达，分泌量也相对较低，因此，有必要建立并优化更安全、高效的直链麦芽低聚糖生成酶食品级枯草芽孢杆菌分泌表达体系。
发明内容
本发明的目的首先是获得一种表达直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌，是将编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因导入枯草芽孢杆菌中进行分泌表达。
所述基因工程菌，是将编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因连接到大肠-枯草穿梭分泌型载体pST，并转化B.subtilis WB600，得到基因工程菌。
编码所述直链麦芽低聚糖生成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述直链麦芽低聚糖生成酶，能够以淀粉为底物生成不含葡萄糖、含高比例麦芽五糖的直链麦芽低聚糖浆，这种直链麦芽低聚糖浆可直接用于生产功能性食品，也可用于生产高纯度的直链麦芽低聚糖等产品。
本发明还提供一种生产直链麦芽低聚糖浆的方法，是以所述直链麦芽低聚糖生成酶为催化剂，以pH 6.5～7.5的淀粉溶液为底物，按1～2U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在40～50℃下反应24小时，制得直链麦芽低聚糖浆。
所述直链麦芽低聚糖生成酶以粗酶液或者纯化的酶制剂的形式添加到底物中。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂是粉末状的。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂是以所述基因工程菌发酵生产并分离纯化得到的纯酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉溶液的质量浓度为2％～5％。
本发明的有益效果在于：
1)实现了直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，方法安全、高效，水解活力达到36.6U/mL，产酶能力是原始菌种的10倍以上；获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，产品符合食品要求；
2)本发明的直链麦芽低聚糖生成酶与其它所报道的同类酶相比，最大的优势是其可以水解淀粉生成麦芽五糖含量达到50％的直链麦芽低聚糖浆，且即使延长反应时间也不会导致葡萄糖的生成。这种不含葡萄糖的直链麦芽低聚糖浆可用于生产功能性饮料及流质食品或生产高纯度的直链麦芽低聚糖，避免了直链麦芽低聚糖浆中葡萄糖对生产加工的影响，有利于直链麦芽低聚糖浆的深加工，从而更具有市场竞争力；
3)本发明的直链麦芽低聚糖生成酶的淀粉转化率和产物纯度较高，分别达到75％和 50％，可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，从而更具有工业应用价值。
附图说明
图1纯化重组直链麦芽低聚糖生成酶的SDS-PAGE分析。
图2温度对重组直链麦芽低聚糖生成酶水解产物的影响。
图3 pH对重组直链麦芽低聚糖生成酶水解产物的影响。
图4加酶量对重组直链麦芽低聚糖生成酶水解产物的影响。
图5重组直链麦芽低聚糖生成酶水解产物的HPAEC-PAD曲线。
具体实施方式
实施例1枯草芽孢杆菌分泌表达系统的构建
根据直链麦芽低聚糖生成酶的基因设计上游引物(包含EcoR I酶切位点)：5’-GTATAACGAATTCCAACCGCGAACCG-3’；下游引物(包含BamH I酶切位点)：5’-CCTTAGGATCCAAAGCTTCCCGTTGGG-3’。
克隆出含编码信号肽序列的目的基因SEQ ID NO.1，PCR体系为：10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTPs(各2.5mM)5μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；再进行35个循环(94℃30s，55℃30s，72℃2min)；最后72℃保温10min。
将PCR产物和质粒pMD 18-T simple分别进行双酶切后切胶回收，于16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109，涂布具有氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板，测序、双酶切验证阳性转化子，获取克隆载体mfa1/pMD 18-T simple。
以质粒mfa1/pMD 18-T simple为模板，采用一步PCR法突变mtg基因中的EcoR I酶切位点，不改变其氨基酸类型，设计上游引物(下划线碱基为突变碱基)：5’-GCAACGAATTTGCCAGCATGG-3’：设计下游引物(下划线碱基为突变碱基)：5’-CCATGCTGGCAAATTCGTTGC-3’。PCR反应体系及条件同上。将PCR产物用Dpn I处理后转化E.coli JM109，涂布具有氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板，测序、双酶切验证阳性转化子，获取克隆载体mfa2/pMD 18-T simple。
将已消除mtg基因中EcoR I酶切位点的载体mfa2/pMD 18-T simple和大肠-枯草穿梭分泌型载体pST分别进行双酶切，切胶回收目的片段，连接并转化E.coli JM109，涂布具有5μg/mL卡那霉素和霉素抗性的LB平板，挑取转化子进行测序、双酶切验证，获取表达载体mfa/pST。将表达载体mfa/pST转化B.subtilis WB600，得到基因工程菌。
实施例2重组直链麦芽低聚糖生成酶的发酵生产
从保藏平板挑取含表达载体mfa/pST的枯草芽孢杆菌单菌落接种于50mL含有5μg/mL卡那霉素和赤霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH 7.0)中，37℃、200rpm下摇瓶培养过夜；按1％的接种量转接至50mL含有5μg/mL卡那霉素和赤霉素的TB培养基(1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4，pH 6.0)中，25℃、200rpm下摇瓶培养60h；将获得的发酵液在10000rpm下离心10min除菌体，获得的发酵上清液即为粗酶液。测定粗酶液的水解活力达到36.6U/mL。
实施例3重组直链麦芽低聚糖生成酶水解活力的测定
以柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(20mM,pH 6.5)配制1％(w/v)的可溶性淀粉溶液为底物，在1.8mL底物中加入0.2mL适当稀释的酶液，45℃下反应15min，加入2mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液终止酶促反应，沸水浴5min后冰浴冷却，540nm下测定吸光值，与葡萄糖标准曲线比较。定义每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
实施例4重组直链麦芽低聚糖生成酶的分离纯化
发酵粗酶液在20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中透析48h，用5个柱体积的含1M(NH4)2SO4的磷酸缓冲液(10mM，pH 6.5)平衡疏水Phenyl FF柱；上样，流速为1mL/min，用超纯水进行洗脱，流速为5mL/min；收集含有目的蛋白的组分后，经Superdex 75凝胶柱层析，在ddH20洗脱液中得到目的蛋白，在20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中透析48h，通过测定酶活力和SDS-PAGE(图1)进行鉴定，纯化酶超滤浓缩后，-80℃保存。
实施例5温度对直链麦芽低聚糖酶法生产的影响
配制pH 7.0的浓度为2.0％(w/v)的玉米淀粉溶液作为底物，按2.0U/g加酶量加入纯化重组直链麦芽低聚糖生成酶，分别在30、40、45、50、55和60℃下反应24h，反应结束后于沸水浴30min灭酶，在10000r/min条件下离心5min，稀释一定倍数后用0.22μm针头式滤器过滤，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量。HPAEC-PAD分析条件：色谱柱CarboPac PA2003×250mm；流动相0.25M NaOH、1.0M NaOAc、水；脉冲安培检测器；流速0.5mL/min，柱温30℃，糖四电位波形。产物分析结果如图2所示。
从图2中可以看出，当反应温度高于45℃时，转化率出现降低；在一定的温度范围内(30℃～50℃)，麦芽五糖的比例随温度的升高而增大，综合考虑，酶法生产直链麦芽低聚糖的反应温度以40～50℃为宜。
实施例6 pH对直链麦芽低聚糖酶法生产的影响
配制pH 5.0～9.0的浓度为2.0％(w/v)玉米淀粉溶液作为底物，按2.0U/g加酶量加入纯化重 组直链麦芽低聚糖生成酶，在45℃下反应24h，按照实施例5中提及的方法进行样品处理与组分分析，产物分析结果如图3所示。
从图3中可以看出，在中性条件下(pH 6.5～7.5)，转化率较高，可达到55％以上；pH对产物组成的影响较小，综合考虑，酶法生产直链麦芽低聚糖以中性pH条件为宜。
实施例7加酶量对直链麦芽低聚糖酶法生产的影响
配制pH 7.0的浓度为2.0％(w/v)的玉米淀粉溶液作为底物，按1.0～8.0U/g加酶量加入纯化重组直链麦芽低聚糖生成酶，在45℃下反应24h，按照实施例5中提及的方法进行样品处理与组分分析，产物分析结果如图5所示。
从图4中可以看出，在一定范围内(1.0～2.0U/g)，增加重组直链麦芽低聚糖生成酶的加酶量可以提高转化率，但过高的加酶量会导致过度水解，产生过多的小分子糖，从而降低麦芽五糖的比例。综合考虑，酶法生产直链麦芽低聚糖以1～2U/g加酶量为宜。
实施例8反应时间对直链麦芽低聚糖酶法生产的影响
配制pH 7.0的浓度为2.0％(w/v)的玉米淀粉溶液作为底物，按2.0U/g加酶量加入纯化重组直链麦芽低聚糖生成酶，在45℃下反应4、12、24和48h，按照实施例5中提及的方法进行样品处理与组分分析，反应24h的水解产物色谱图及产物分析结果分别如图5和表1所示。从图5中可以看出，重组直链麦芽低聚糖生成酶对玉米淀粉的水解产物以麦芽五糖为主，且无葡萄糖生成；由表1可知，随着反应时间的延长，转化率持续增加，水解产物中的麦芽六糖和麦芽七糖比例减少，小分子糖的比例增加。反应至24h时，转化率可达到75.2％，麦芽五糖的比例可达到50.2％；反应24h后，转化率缓慢上升，麦芽五糖比例逐渐降低，水解产物中出现较多的麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖，但仍然没有葡萄糖生成，故反应时间以24h为宜。
表1不同反应时间下重组直链麦芽低聚糖生成酶水解玉米淀粉的产物组成及转化率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种表达直链麦芽低聚糖生成酶的基因工程菌，其特征在于，是将编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因导入枯草芽孢杆菌中进行分泌表达。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是将编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因连接到大肠-枯草穿梭分泌型载体pST，并转化B.subtilis WB600；所述编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.应用权利要求1或2所述的重组直链麦芽低聚糖生成酶生产直链麦芽低聚糖浆的方法，其特征在于，以淀粉为底物生成不含葡萄糖、含高比例麦芽五糖的直链麦芽低聚糖浆。
4.应用权利要求1或2所述的重组直链麦芽低聚糖生成酶生产功能性食品的方法，其特征在于，以淀粉为底物生成不含葡萄糖、含高比例麦芽五糖的直链麦芽低聚糖浆，以所得直链麦芽低聚糖浆直接生产功能性食品。
5.一种生产直链麦芽低聚糖浆的方法，其特征在于，是以直链麦芽低聚糖生成酶为催化剂，以pH 6.5～7.5的淀粉溶液为底物，按1～2U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在40～50℃下反应24小时，制得麦芽低聚糖浆；编码直链麦芽低聚糖生成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述直链麦芽低聚糖生成酶以粗酶液或者纯化的酶制剂的形式添加到底物中。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶制剂是粉末状的。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶制剂是以权利要求1或2所述基因工程菌发酵生产并分离纯化得到的纯酶。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，淀粉溶液的质量浓度为2％～5％。
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