KR20060097335A - 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터와 이의 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항생물질 발리다마이신(Validamycin)의 생합성 유전자 클러스터와 이를 검출할 수 있는 프라이머에 관한 것으로, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 KCTC1717(Streptomyces hygroscopicus var.limoneus KCTC1717)로부터 유래한 탈수소 효소 (Dehydrogenase) ValA, 아민 전이 효소 (Aminotransferase) ValB, 트레할로스 포스페이트 합성효소 (Trehalose-phosphate synthase) ValC, 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase) ValD, 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase) ValE, 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase) ValF의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 결정하여 제공하는 효과가 있다. 또한, 발리다마이신 생합성의 중간물질인 발리엔아민(Valienamine) 구조를 포함하는 생리활성물질이 주로 알파 글루코시데이즈 저해 (α-glucosidase inhibition) 효과가 있으며 이러한 이유로 비만치료제로의 개발 및 농업분야의 pesticide로 개발되고 있는 중요한 화합물이므로, 상기의 발리엔아민 구조를 생합성 하는 효소들, 즉 탈수소 효소 (Dehydrogenase) ValA, 아민 전이 효소 (Aminotransferase) ValB, 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase) ValD, 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase) ValE의 유전자 염기서열과 아미노산 서열은, 이후 발리엔아민 구조를 지니는 생리활성물질 생산균주를 screening하는 primer 제작 및 DNA chip 제작 뿐만아니라 발리다마이신 또는 발리 엔아민의 보다 효과적인 생산을 위해 유용하게 응용가능함으로 산업적으로도 많은 효과를 기대할 수 있다.

스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스, 발리다마이신, 발리엔아민

Description

발리다마이신 생합성 유전자 클러스터와 이의 프라이머{Validamycin biosynthesis gene cluster and it’s primer}

도 1은 8.6 kb 상당의 발리다마이신과 발리엔아민 생합성 유전자 클러스터에서 ValA ∼ValF의 위치를 나타낸 유전자지도,

도 2는 본 발명의 ValE를 공지된 데이터베이스(NCBI)를 통해 상동성을 검색한 자료.

본 발명은 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발리다마이신의 생합성 과정에서 중간물질인 발리엔아민 생합성을 위한 탈수소 효소 (Dehydrogenase) ValA, 아민 전이 효소 (Aminotransferase) ValB, 트레할로스 포스페이트 합성효소 (Trehalose-phosphate synthase) ValC, 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase) ValD, 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase) ValE 및 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase) ValF의 유전자를 포함하는 유전자 클러스터의 염기서열과 아미노산 서열, 이를 분리, 검출, 분리할 수 있는 프라이머 및 그 산업적 응용성에 관한 것이다.

생리활성물질로 발리엔아민 구조를 가지고 있는 발리다마이신(Validamycin), 살보스타틴(Salbostatin), 아카비오신(acarviosin), 아카보오스(Acarbose), 아디포신(Adiposin), 트레스타틴(Trestatin) 등이 있으며, 상기의 화합물들은 트레할라아제(Trehalase) 등은 알파 글루코시다아제 저해제(α-glucosidase inhibitor)의 중요 화합물로 작용하여, 농업용 항생제나 인류건강 증진을 위한 비만치료제로 널리 이용되고 있으며, 이의 상업적인 개발이 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

그러므로 이러한 발리엔아민 구조를 생합성하는 유전자원을 분리, 확보하는 것은 상기의 유전정보를 이용하여 발리엔아민의 효율적인 생산 뿐만아니라 PCR primer나 DNA chip의 탐침으로 응용하여, 미생물을 대상으로 발리엔아민 구조를 지니는 생리활성물질을 생산하는 미생물을 분리하고, 그 화합물의 구조를 분석하여 확보할 수 있는 기회를 제공할 수 있으므로 중요한 가치를 가질 수 있을 것으로 판단된다.

따라서, 발리엔아민 생합성에 공통적으로 관여하는 중요한 신규 효소를 개발한 다면, 그 산업적인 응용도 클 것으로 예상된다.

이에, 본 발명자는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스(Streptomyces hygroscopicus var.limoneus KCTC1717)로부터 발리다마이신의 생합성을 담당하는 유전자들을 클로닝하기 위해 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스의 게놈과 특정 프라이머인 ValC-F, ValC-R를 이용하여 PCR 증폭한 후 PCR 증폭산물 중 예상되는 크기의 DNA 단편을 탐침으로 제작하고, 제한효소로 절단한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 게놈의 단편들 중 탐침과 일치하는 염기서열이 존재하는 단편을 서던 교잡 반응(Southern hybridization)을 실시하여 선별하고, 상기 서던 교잡 반응 결과를 바탕으로 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스의 게놈에서 선별된 소규모 유전자 도서관(DNA library)을 특정 프라이머인 ValC-F, ValC-R를 이용하여 PCR 증폭한 후 PCR 산물 중 예상되는 크기의 밴드로 양성반응을 보이는 플라스미스를 분리하고, 이들의 플라스미드 유전자를 적당한 제한효소를 이용하여 절단한 후 상기 절단된 절편들을 플라스미드 pUC18에 서브클로닝하여 M13-47과 M13R 프라이머를 이용하여 염기서열 결정을 하여 약 8.6 kb의 염기서열을 결정하였으며 그 결과 6개의 코딩지역이 존재함을 확인하고 이 유전자의 아미노산 서열을 비교 분석하여, 본 발명에서 명명한 ValA는 탈수소 효소 (Dehydrogenase), ValB는 아민 전이 효소 (Aminotransferase), ValC는 트레할로스 포스페이트 합성효소 (Trehalose-phosphate synthase), ValD는 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase), ValE는 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase), ValF는 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)와 상동성이 있음을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스KCTC 유래의 발리다마이신과 발리엔아민 생합성 유전자 집단이 삽입된 플라스미드 클론 안에 일부분으로 삽입된 탈수소 효소 활성을 갖는 ValA, 아민 전이 효소활성 을 갖는 ValB, 트레할로스 포스페이트 합성효소의 활성을 갖는 ValC, 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제의 활성을 갖는 ValD, 발리오론 합성 효소의 활성을 갖는 ValE 및 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소의 활성을 갖는 ValF의 유전자를 포함하는 유전자 클러스터를 제공하는 것이다.

또한, 상기 바리다마이신 생합성 유전자 클러스터에서 합성에 관여하는 효소 각각의 유전자를 분리, 검출 및 증폭할 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자를 포함하는 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터를 제공하는 것이다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2와 3으로 표시되는 상기 유전자를 분리, 검출 및 증폭하는 프라이머를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서 사용한 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 KCTC1717(S. hygrosco- picus var. limoneus KCTC1717)를 분양 받은 것을 사용한 것이다.

본 발명에 의한 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터의 클로닝 방법을 다음과 같이 수행한다.

(1)스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 KCTC1717(S. hygrosco- picus var. limoneus KCTC1717)의 게놈을 이용하여 소규모 유전자 도서관을 작성 한 후, 발리다마이신의 발리에아민(Valienamine) 생합성을 위해 반드시 존재하는 발리오론 합성효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase)를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 특정 프라이머(forward: 5'- GTACGTCCGCATACCCACGACCCTGAT C -3', reverse: 5'- CATCTCCACGCTGGGTGAGAAGGAGTG -3')을 이용하여 PCR증폭하고, 상기 증폭물로부터 예상되는 크기의 밴드로 양성반응을 보이는 두 개의 플라스미스 pB44, pH9 클론을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 플라스미드 유전자를 적당한 제한효소를 이용하여 절단한 후 플라스미드 pUC18에 서브클로닝하여 [M13-47과 M13R 프라이머(상업명이라면 실시예에서 제조사와 제조국을 기재하고, 여기에서는 삭제하는 것이 좋을 듯 합니다)를 이용하여] 염기서열 결정을 하여 약 8.6 kb의 염기서열을 결정하는 단계; (3) 상기 유전자 집단 중 6개의 코딩하는 지역이 존재함을 확인하는 단계(본 발명에서는 이를 각각 유전자 클러스터의 염기서열 순서에 따라 Val A, B, C, D, E 및 F로 명명하였다.) 및 염기서열 결정으로부터 번역된 아미노산 서열을 비교하여 ValA은 탈수소 효소 (Dehydrogenase), ValB는 아민 전이 효소 (Aminotransferase), ValC는 트레할로스 포스페이트 합성효소 (Trehalose-phosphate synthase), ValD는 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase), ValE는 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase), ValF 는 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)와 상동성이 있음을 확인하는 단계로 구성된다.

그리고, 본 발명의 서열목록에서 서열번호1은 8.6 kb 상당의 발리다마이신과 발리엔아민 생합성 유전자 클러스터의 염기서열과 ValA ~ ValF 유전자의 위치, 그리고 아미노산서열을 표시한 것이다.

이때, ValE, ValF와 같이 정방향으로 존재하는 유전자는 서열번호1에 표기한 염기서열과 일치하지만, ValA, ValB, ValC, ValD와 같이 반대방향으로 존재하는 유전자의 경우 서열번호1에 표기한 염기서열의 상보적인 염기서열을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

실시예 1: 발리오론 합성효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase)의 활성을 갖는 유전자를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머의 제작

발리다마이신 생합성 유전자를 클로닝하기위하여 발리다마이신과 같이 화합물 구조에 발리엔아민(valienamine) 구조를 가지고 있는 아카르보스(acarbose) 생합성 유전자 중 acbC(2-epi-5-epi-valiolone synthase), 그리고 상기의 유전자와 생화학적 기작이 유사할 것으로 여겨지는 3-디드로퀴네아트 합성효소(3-dehydroquinate synthase)유전자와의 비교 분석(comparative analysis)으로 프라이머(F:5'-GGSGGSGTSCTSATGGACGTSGCSGG-3', R:5'-GCCATGTCSACGCASACSGCCTCSCCGTG-3') 를 개발하였고, 상기 프라이머와 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우 KCTC1717의 게놈을 PCR하여, 예상되는 크기의 PCR 산물을 프로메가(Promega)사의 pGEM-T 이지 벡터(pGEM-T Easy vector)에 클로닝한 후 염기서열을 결정하였다.

상기 염기서열을 바탕으로 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스KCTC1717의 발리오론 합성효소의 활성을 갖는 유전자를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 ValC-F (5'- GTACGTCCGCATACCCACGACCCTGAT C -3')와 ValC-R (5'- CATCTCCACGCTGGGTGAGAAGGAGTG -3') 프라이머를 개발하였고, 상기 프라이머와 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 KCTC1717 게놈의 PCR 산물을 서던 교잡반응(Southern hybridization)을 위한 탐침(probe)으로 사용하였다.

실시예 2: 발리다마이신 생산균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스( Streptomyces hygroscopicus var . limoneus KCTC 1717)의 소규모 유전자도서관 작성

발리다마이신 생산균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스(S. hygroscopicus var. limoneus KCTC1717)를 R2YE배지에서 배양하고, 홉우드(Hopwood)의 방법에 따라 염색체 DNA를 순수 분리한 다음, 분리한 염색체 DNA를 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단하고, 상기 실시예 1에서 개발한 ValC-F (5'- GTACGTCCGCATACCCACGACCCTGATC-3'), ValC-R(5'-CATCTCCACGCTGGGTGAGAAGGAGTG -3') 프라이머와 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스(S. hygroscopicus var. limoneus KCTC1717)의 게놈의 PCR 증폭산물을 탐침으로 사용하여 서던 교잡반응을 실시하였다.

이의 결과, 제한효소 BamHI으로 절단된 단편중 약 4 kb 크기의 단편과 HindIII로 절단된 단편 중 약 9 kb 크기의 단편에 발리오론 합성효소의 활성을 가지는 유전자가 존재하는 것을 확인하였고, 이들 단편을 클로닝하기위해 각각 BamHI과 HindIII 제한효소로 절단한 pUC18 vector를 사용하였다.

그런 다음, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 KCTC1717의 게놈을 BamHI과 HindIII 제한효소로 각각 완전하게 절단한 후 각각 4 kb와 9 kb 크기의 DNA 단편을 회수하였고, 이들을 각각 BamHI과 HindIII 제한효소로 절단한 pUC18 vector와 T4 DNA 연결효소로 연결한 후 Meniatis방법에 따라 대장균을 형질전환시킴으로서 소규모 유전자 도서관(DNA libray)을 작성하였다.

실시예 3: 발리다마이신 및 발리엔아민 생합성 유전자의 클로닝

상기 실시예 2에서 작성한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스 소규모 유전자 도서관중 각각 200개의 콜로니를 700 ml의 LBA 액체 배지가 들어있는 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 엘로우 팁(yellow tip)을 이용하여 접종한 후 하루 동안 배양기에서 배양한 다음 이 배양액을 100 ul씩 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 결국 10개의 시료가 하나의 에펜도르푸 튜브에 옮겨져 새 튜브에 옮긴 시료의 수는 처음의 200개에서 20개로 줄어들었다. 모아진 20개 시료에서 플라스미드를 추출하고, 20개 시료의 DNA를 가지고 상기 실시예 1에서 개발한 ValC-F와 ValC-R 프라이머를 이용하여 PCR반응을 수행하였다. 이 PCR 반응결과 20개의 시료 중 각 1개의 시료에서 예상 크기인 PCR 밴드를 확인하였고, 2개의 시료를 제작하는데 사용한 20개의 시료(600 ul)에서 플라스미드를 추출하고 재차 PCR를 수행하여 각각 1개 씩, 최종 2개의 재조합 플라스미드 클론을 선별하였다.

실시예 4: 플라스미드 단편에서 2-epi-5-epi-valiolone synthase 유전자를 포함하는 8.6kb 단편의 유전자와 아미노산 서열결정 및 유사성 검색

본 실시예에서는 생리활성물질의 생합성에 관여하는 효소들이 일반적으로 게놈의 일정지역에 모여서 존재하므로 발리다마이신 생합성 유전자 집단이 존재하는 두 개의 플라스미드 클론 각각 4 kb와 9 kb가 삽입된 단편에도 발리다마이신 생합성에 관여하는 대부분의 효소 유전자가 존재할 것으로 보고, 다까라 코리아(TaKaRa Korea)사에 염기서열분석을 의뢰하여 2개 플라스미드의 염기서열을 결정하였다.

이때, 염기서열이 결정된 6개의 유전자 및 이 유전자 염기서열부터 번역되는 아미노산 서열을 서열목록에 나타내었다.

그리고, FramePlot 2.3.2 프로그램(ishikawa, J. and Hotta, K. FEMS Microbiol. Lett. 174:251-253, 1999)을 이용하여 일차적인 DNA염기서열 결과를 기초로 단백질을 코드 하는 부분을 검색하였다. 실험결과 이 지역에 단백질을 코드하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 존재함을 확인하였다.

이의 결과, ValA이라 명명한 단백질은 시작코돈 GTG로 시작하여 정지코돈 TGA로 끝나는 333개의 아미노산으로 구성되어 있고, ValB는 ATG로 시작하여 정지코톤 TGA로 끝나는 430개의 아미노산으로 구성되어 있고, ValC는 GTG로 시작하여 정지코돈 TGA로 끝나는 497개의 아미노산으로 구성되어있고, ValD는 ATG 로시작하여 정지코돈 TGA로 끝나는 414개의 아미노산으로 구성되어있고, ValE는 ATG로 시작하여 정지코톤 TGA로 끝나는 414개의 아미노산으로 구성되어 있고, ValF는 GTG로 시 작하는 282개 이상의 아미노산으로 구성됨을 알 수 있었다.

또한, 미국국립생물정보센터(NCBI)의 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/ 검색창)를 통하여 아미노산 상동성 검색을 하였다.

이때, 하기 e 값(e-value)는 입력한 신규 서열과 가장 유사한 염기서열이나 아미노산 서열을 기존에 공지된 염기서열이나 단백질의 데이타베이스를 통해 순서대로 출력하면서 신규 서열과 기존 서열과의 상동성을 객관적으로 수치화한 것으로e-X(X>0)는 e^-X를 의미하며, 이의 값이 0에 가까울수록 다른 단백질일 가능성이 거의 없다는 것을 의미한다(X값이 클수록 0에 가까워짐).

① ValA는 글로에오박터 비올라세우스 PCC 7421의 탈수소효소[Gloeobacter violaceus PCC 7421의 dehydrogenase; 상기 균주 게놈(AN:BA000045)에서 탈수소효소에 해당됨.]와 e 값(e-value)이 5e-11로 가장 높게 나타났으며, 두번째로 데할로코코이데스 에테노제네스 195(Dehalococcoides ethenogenes 195)의 알콜 탈수소효소(AN:CP000027)와 2e-10로 측정되었으며, 이하 상동성 목록으로 나타난 모든 단백질이 탈수소효소임을 나타내었다(미도시).

따라서, ValA는 탈수소효소의 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.

② ValB는 데이노코커스 라디오두란스 R1의 아민 전이 효소[Deinococcus radiodurans R1의 amiontransferase; 상기 균주의 염색체 2번 위치(AN:AE001862)에서 4-aminobutyrate aminotransferase에 해당됨.]와 e 값(e-value)이 e-59로 가장 높게 나타났으며, 두번째로 메타노사르시나 마제이 Go1(Methanosarcina mazei Go1) 의 아세틸오르니틴 아민전이효소(AN:AE013224)와 e-53으로 측정되었으며, 이하 상동성 목록으로 나타난 모든 단백질이 아민전이효소임을 나타내었다(미도시).

따라서, ValB는 아민전이효소의 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.

③ ValC는 스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)의 트레할로스 포스페이트 합성효소[Streptomyces coelicolor A3(2)의 trehalose-phosphate synthase; AN:AL939119]와 e 값(e-value)이 4e-37로 가장 높게 나타났으며, 두번째로 메타노사르시나 마제이 Go1(Streptomyces avermitilis MA-4680)의 트레할로스-6-포스페이트 합성효소[AN:BA000030)와 2e-36으로 측정되었으며, 이하 상동성 목록으로 나타난 모든 단백질이 트레할로스 포스페이트 합성효소나 트레할로스-6- 포스페이트 합성효소로 나타내었다(미도시).

따라서, ValC는 트레할로스 포스페이트 합성효소의 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.

④ ValD는 스트렙토마이세스 캐루레우스(Streptomyces caeruleus)의 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제(AN AF170880)와는 e-16, 스트렙토마이세스 리시리엔시스(Streptomyces rishiriensis: AN AF235050)와는 2e-16 정도의 상동성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

⑤ ValE는 도 2에 나타난 바와 같이, 악티노플라네스류 A40644(Actinoplanes sp.A40644)의 메발로네이트 경로 유전자(mevalonate pathway gene, AN: AB113568)의 발리오론 합성 효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase)와 e 값(e-value)이 e-101로 가장 높게 나타났으며, 두번째로 악티노플라네스류의 acbC(AN: Y18523)와 2e- 90, 세번째 e값은 9e-61로 첫번째와 두번째 값보다 많은 차이를 나타내었고, 상기 메발로네이트 경로 유전자와 acbC는 모두 발리오론 합성 효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase)임을 나타내었다.

⑥ ValF는 첫번째(AN AL935252)와 두번째(AN AE004399)가 각각 6e-27과 8e-27로 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소(Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)임을 나타내었다.

따라서, ValE는 발리오론 합성효소의 활성을 가지고 있다는 것을 입증하였다.

도 1은 8.6 kb 상당의 발리다마이신과 발리엔아민 생합성 유전자 클러스터에서 ValA ∼ValF의 위치를 유전자지도로 나타낸 것이다.

통상적으로, 발리다마이신 생합성 과정은 5탄당 인산회로에서 유래한 세도헵튤로스-7-포스페이트(sedoheptulose-7-phosphate)가 고리화반응(cyclization), 에피머화반응(epimerization), 국문명칭(dehadration), 환원(reduction)되어 7탄당인 발리에논(valienone) 및 발리돈(validone)이 만들어지고, 이들에 아민전이효소(aminotransferase)가 작용하여 각각 발리엔아민 및 발리다민이 만들어진 후 축합반응에 의하여 이탄당인 발리드옥실아민(validoxylamine)을 생합성되며, 이후 당전이효소(glycosyl transferase)에 의하여 글루코오스 한분자가 축합되어 최종적인 발리다마이신이 합성되는 것으로 보고되어 있다(참고문헌, Jounal of American Chemical Society. 123:2733-2742, 2001년).

이에, 본 발명에 의해 입증된 상기 ValA∼ValF는 발리다마이신 생합성 과정 에 관여하는 유전자 클러스터로 판단된다.

한편, 발리다마이신의 생합성 유전자는 지금까지 보고된 적이 없으며 중간체인 발리엔아민 구조를 갖는 당뇨병 치료제 아카르보스(acarbose) 생합성 유전자만이 클로닝되어 연구되고 있으며, 출발물질인 세도헵튤로스-7-포스페이트(sedoheptulose-7-phosphate)로부터 고리화반응(cyclization)을 매개하여 발리오론(2-epi-5-epi-valiolone)을 합성하는 발리오론 합성효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase;AcbC) 유전자 주위에 생합성 관련 유전자가 클러스터로 존재하는 것으로 보고되어 있다 (참고문헌, Applied Microbiology and Biotechnology. 63:613-625, 2004년).

그리고, acbC 유전자는 일반적인 미생물에서는 보고된 적이 없고 발리엔아민 생합성에만 관련된 특수한 유전자로 알려져 있다.

그러므로, 본 발명의 발리다미이신 생합성 관련 유전자 클루스터를 산업적인 용도에 적용한다면, 산업적 가치로 인하여 파급효과가 매우 클 것으로 예상된다.

이상과 같이, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 리모네우스(Streptomyces hygroscopicus var. limoneus KCTC 1717)로부터 유래한 발리다마이신을 생합성하는 유전자 집단을 분리하였고, 8.6 kb 상당의 염기서열분석으로 탈수소 효소 (Dehydrogenase), 아민 전이 효소 (Aminotransferase), 트레할로스 포스페이트 합성효소 (Trehalose-phosphate synthase), 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase), 발리오론 합성 효소 (2-epi-5- epi-valiolone synthase), 글루코오스 포스페이트 아데니릴 전이 효소 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase) 유전자의 염기서열과 유도되는 단백질의 서열을 찾아내었다. 이 효소들 중 탈수소 효소 (Dehydrogenase) ValA, 아민 전이 효소 (Aminotransferase) ValB, 디티디피 케토 디옥시헥소오스 리덕타아제 (dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase) ValD, 발리오론 합성 효소 (2-epi-5-epi-valiolone synthase) ValE는 발리엔아민 생합성에 공통적으로 관여하는 중요한 효소이다. 그러므로 이러한 유전정보는 발리엔아민 구조를 지니는 생리활성물질 생산균주를 screening하는 primer 제작 및 DNA chip 제작 뿐만아니라 발리다마이신 또는 발리엔아민의 보다 효과적인 생산을 위해 유용하게 응용 가능함으로 그 가치가 높다 하겠다.

<110> DyneBio Inc. <120> Validamycin biosynthesis gene cluster and it's primer <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8598 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus var.limoneus KCTC1717 <220> <221> gene <222> (235)..(1236) <223> ValA(R) <220> <221> gene <222> (1233)..(2525) <223> ValB(R) <220> <221> gene <222> (2531)..(4024) <223> valC(R) <220> <221> gene <222> (4094)..(5338) <223> valD(R) <220> <221> gene <222> (6526)..(7770) <223> valE <220> <221> gene <222> (7748)..(8596) <223> valF <400> 1 aagcttctcg attcttgtgt tccgagttga ttaatgtgcc gtccaggtcg aaaagtgcaa 60 ccttgtgcat caatcgaacc tcaccattac tctcgcatgg aaacgctgaa ttaggggatc 120 aattcccacc ctccatccgg ccggacggag ggtgaagaag aattgagcgt tcgtggtgcg 180 ggtcgacgcc gttcgtgccg cgacacccag gccgtcggag tcatgggcgt cgcgtcagga 240 gggttcgggg tggacaatga tcttgccggg tcccagggcg tccggggtcc gcagcagtcc 300 gagcaagcct ggcaggtcca cttcagcggc caccagggct tcggcgcgca gaggtgacgc 360 cgcgtcagtg aggtcaccga tcgcggcggc gaaatcctcc gcggtcgtgc cgtagctgcc 420 ggccacatgg agtgagtggc cctgccaggt gcaggcggcg acggtctcgg tgcgccgcac 480 ttgatcgagg tcacattcca gcccggggtg ccggtcacct ggtgcggtgc caccgtagag 540 cagcaccaga ccacctggcg cgaccaggcg tagcgcctcg tccagcacgg tgggcgtcac 600 gaagctggtg gcgaccacca ccacgtcggc cctgtctccg gccagttcac cgaagagcag 660 tgtgggtaca tcgagcaggt ccgccttgcg ggccgcgtcc atccgagcgc ggctccgatt 720 gcagaccgac acctgggcgc ccgcacgctc ggcgagcgcc gcgatgaaga gcccggcggt 780 cccggcaccg agcaccacga cttgtgcacc ccgcaggctg ccgacctgcc tcttgatggc 840 gctcagacag tgctgggcgc aggcgatcgg ctcggcgaag accaggcgac gggcggccgg 900 gccgtgcggt accggttgca gggcgtgccg cagcaggtcg tccgggcccg ccgcccacat 960 gtgatcggcg aacccggtgc cccgctccac cttcacgttc gggtccagga cgacgcgagt 1020 gccttcggcg aacgcagagg tggtggactc gcggacgaca ccgacgagtt cgtgcccgaa 1080 ctggctgggg ccgtgacggg tgccggctac ctccttgagg tcggagcggc acagcgcggc 1140 cagttcgatg ccgacgagta cggcgggatc ttcacgcggg cgcggcggcg gcgagcggtg 1200 cagacgaggc ccgccctcct ccagagtcac tctcacgcga tgccctccag cgcctcgccg 1260 aagcggtcgg cgaccatgtg ggcgtctgcg ggcgtcagga tgagaggggg gcgtagctcg 1320 atcgtgctgc cctctccgtg ctcggagacg cgcgtgagga tgccatggtc ctggagcgac 1380 cgctggtagg cgtgggcgcg ggcgacggcc ttggaaccgt cgggctccac cagttccacc 1440 ccgagcatca gcccgacccc tcggacgtcg ccgatcacgg ggttgtcctt ctggaggtct 1500 cgcagccggc cgaggagcac atcgccgctg gctcgtacgt tctccaggaa gccgggtcgc 1560 tggacgatct ccagcgtggc cagggcggcc gcggccgaca gggtgtggct gccataggtg 1620 aaactgtgca ggctacggtc ccagtcggcc atacgttctt cggtgaggat ggcggccatc 1680 ggaaggccac tgccggtgag tcccttggcg agggtcatca tgtgtggctg cacaccgaag 1740 tggtcggcag cgaacatctg tccagtgcgg cccagcccgg tctggatctc gtcgaagatg 1800 aggacgatct cgcgctcgtc gcagaaccgg cgcagctcct gaaggtaacc ggcgggtggg 1860 acgatgttac cgccggcacc gctgatcggc tcgatcacta cgcaggccac gctgccggag 1920 ctggcatagg tgatgaagtc ctcgatgcgg tcgacacaga gcatcccgca ggtctcggga 1980 gtctggcggt agaagcagcg gaagcagtaa gggcctggca cgtgaaggcc gccgggatag 2040 cggtgcggga agggtgcgcg catcttcgtg gtgccgttga ggctggccgt cgcgaggctc 2100 tgaccgaggt gggcgcggaa cggcacgatg acatcgcggc gaccggtgtg gagctgggcc 2160 atcttgatgg cgccttcgtt ggcggtggag ccaccggagc tgcgcaggtt gacccgcgtg 2220 aggttgggcg ggctgatggc ggccagttct tggatgaccc ggctggtggg ttcggtctgg 2280 aaggacgagc tggcgaagac gagccgctcg gtctgctccc gtacggcggc catcacctct 2340 gggtggttgt gtccgagcag taggttgaag gtgcccgaga cgcagtcgag aaactctcgc 2400 ccctcggcat cccaggcacg gatgccttcg ccgcgcacca gcgtgatatc gccgagctgg 2460 tactgagccg cgtcctgcgg cgcagggagg cgtttcgtcg ttgccataga gcgctccttg 2520 gtcatggcgg tcagaggtct gctcgtgtcg agactgccgg tgcggtgtcg aagcgctcag 2580 cggttgccgt gcgggcggcg tggtccgcag cgagtccgtc cagttgtgcc tgcacccagg 2640 cttcgagcgt ccaggggcgg gcagcgtcgc gacggcgggc agcggcttct gcccgctgcc 2700 gcggcccggc cgcgagcgcg gcggagatgg cctcggcctg ctcgacgagg tcgaaggggt 2760 tgacgctgcg gcagtactcg cccaggacct cggcggcacc gcaggtctcc gaaaggatga 2820 cgtcggcgtc gcgttcgttg accaggggcg cttcgaacgt gctcaggttt tgaccgtcga 2880 cagttgagtt gaagatgagc aggtcggccc ggcggaagca cgcgatggtg tggttcacgt 2940 cgttgtcgtt gtctatgcgc acggtgtcgg agcccagctc ggcgttggct tcggctacgg 3000 cggtctccac ccggtgcacg tagtcggcgt tggccggcac gtacagtcgg ttgggattca 3060 tccgcaccag catgcgggtc ttctccagcc cgccgccccg ggcggccagg acgaaggcgc 3120 gcaccgcacg ttcggcgttc ttgatcgggt cggtgcgccc gctgtgcacc accagccgat 3180 ggccgtccgc ccactcctcg atcccttcgg gcagttgcgg gttgcggccg tcgagggtga 3240 gcgggctgta gccgagcggc atggtgcgca gccgggtgcg gtggccgcgc cactcgacgg 3300 tcatcgcctc gcggtcgatc cgggcgtcgg gcaggagatc ggccacgctt tcgaggaagt 3360 tgcggcacca gcggtcggcg aagaagccga tcgtggtggc ggggagcatg ccgtggagga 3420 tgccggtgcg gatctccttg ggcaggatcc tccagtagtc ggccgacggc cacgggatgt 3480 ggacgaagag caggatcggc gcgtccggcc gctgttcgcg cagcagcgcg gggaccccga 3540 ccagctggta gtcgtggacg aggtagacag ggtctgccga ctgggccgag ctcttgagga 3600 tggcgtcggc gaagtcgcgc gtgaagcggc cgaagtccgc ccagccttcg cgggcgtcgg 3660 agccgaacga cggctgggtc cagcggtccc agccgtagtt gttcgccgcc cacatcaggt 3720 tggcggtcat gaagttctgc acgttgcgga agacagcggg gtcgtgcctg atgagccgga 3780 ccagtatctc ccggccggag tgcagttcca tggtcacgcc gtcagggttg agcgccgaag 3840 cgcgacggtc gtcctcggag tcggcactgg cgatccacga gatgttgagg acgccggcct 3900 gttcggcgac gacgttgccg gtaccgccag gagccagcca ggcgcgcggt tcgccggtgg 3960 cggggtcggt gtcgtaggtg atcgccgcgc gcttgctggc gaggaagatc tcagatccgg 4020 tcacgggtgc cccaatcttg ggttgagggc cggaagcggg ccggccggtg tgggcggact 4080 gtgcgtggtc ggttcagaaa ggtgcgagtg gtgtcaggag atgagggcat gggtggtttc 4140 gaggacgtcg gccgggcggt ggtgttgcag ttcgggcaac tgcgcggcca cctcgctgtg 4200 tagacaggcg ttgcgcggcc ggcaggcgta ggcggtgccg atacgcggcg tcggcacgat 4260 gagcatgggg tccacgccga gctgctcggc gatgtgtctg gcccaagtcg actcggccga 4320 tgcggcgcgg cccgccaagg tgcagcgttc cggtgcggcc ggaactcatc agtgtcgtcg 4380 cccacgcggc cacgtcctcg acgtgaacgg gggtgttcca gtggtcgtcg gggatccgta 4440 gctgctcctt gcgcatcagc gaacgaacca cactggtcag gaaattgggc cgcggaccgc 4500 gatcctccca gccgtagacc aggctcacac gcaggacaag agcggaggag gtgtcgagca 4560 gctcccgctc ggccgcgagc ttcgcccggc cgtaggcgtt gaccgggaag gtctgtgctg 4620 actccccgta gctctcgtcc tcgccggaga aaacgttgtc ggtcgacacc agcaggacgg 4680 ggcggccgtc cagtgcggct gcgatgttgc gggcaccgcc gtggtgggtg gcgtatgcct 4740 cctcgggatg cgactcgcac caagtgatgt cggaggggcc gtgcacggcc acgacggcat 4800 cgggctcgac ggcatccatc aaggcagcca cctgcgggcc cgaggtgaca tcgacctgct 4860 tccagcgcac acctcggctc tcggggagga ctggggcacg ccgggagctg agcactgtct 4920 cggcgccgag ccgggtgagg cgggcggcga tgtgcccggc aaggtagccg gaaccgagga 4980 tcaggatgcg gccaggcacg gcaggcgccg ccgtgcctgg ccggagtacg agtggcgacg 5040 agcgaaggtc agacatgtgt ttcctccggc tgatgtggcg ggctgacatg gcggaaacgt 5100 gtgccgatcg ggtgaacggg cgtccagtgc agtcgcacac gtgggttccc cggccggtgc 5160 cgccgttgag cgcgcctgat ggttcgtgat gccatgccac agtcacgggt gcggtactgg 5220 tgacggcgaa ggttcggcac cggctggatt cggtccgatg ctcgggcggg tcccgtgcgg 5280 cttggcgatg ccggcgaacc tttcggcgaa cgccgggttg cttcgagaat gagaccatat 5340 tgccctcgcg cccaattagg gcgatcggcc gatggccttg tccgtctccg ccgcttcttc 5400 aacagttccg tcgagccgga cgggttatgg cgtgaatccg ctactcgtgg acacgaccgc 5460 aacagcacgg tacggcgacg caggagaccc gtattttgtc gatgccgctc cactcaacgc 5520 cagtgaagcc ggcggcttat tgcggcaggg gctcacgcac ggcccgacgg gccgaaatcc 5580 tgggtacgcc tgggtgattt tatctcaagt cggcgcccga gcagcgatag tgcatgctac 5640 tgccgctctc gcgccaccct tgacggccat tgaatgcatc gatgcgggtc tggcagtgct 5700 gaggaatgtc acagaagtca gcatttccgc tccgagtggt cggcactgcg gagtgtgttc 5760 ctgtgcccag tcaaattcaa accgccacac gtacacaacc agccgggcag cagttgcgcg 5820 cttcaggcac tgcaagagca ttttcatccc cgcgttaccg tgggtgactc atgagcttac 5880 atcttgccca ttacaagcag ctggtaactc attgtcaagt acacggtttt tttggctcga 5940 tcagccctgt ggtgcttcat gtacgcgcac aacctcaatt gacatgccct ctatgacccg 6000 ttttgcaccg cgcatcgacg gccagaaacg gccttggcga cagccgtgat cgagcattcg 6060 cgcacgagac ggacatacgg gactgcatgt cccttgacaa ggtcatgtgc acggacttac 6120 atctacgatc tatagatcac tcaccagtga gtgatccgaa gccgccgagg gattgccgta 6180 ccggcagttc accgcttgac cgcttgacgc aggcgcggcg cgcgaagagc cagatcaggc 6240 agtggcgtcg cgtctgtggc tgaacgcctc catcaccgca atcgaacccc atcttccacc 6300 cgacgccgct gtgccctctc ctgtcacctg ctgtgggacg cacaacgccg ccggctcgcc 6360 accggtcgag ccgccgtcgc gccgtcacct cgtcaccacg accatcgcac gcgcccagtg 6420 cacatgcgag tgacgcaacg cgcgcgccac ggccgtaacc ggtggcntgc tccagcggct 6480 gcctcccccg tccccaccag tgctcctctt caccacgtga ggtcgatgac catgaccaag 6540 cagagttcct tatcccccgg tagccgcctg cacgactaca ccacgcagga cggcgcggcc 6600 tggcgggtga gcgcgctcaa ggaggtgagc tacgacgtca tggtgcagcc gcggctgctc 6660 gatccggcga atccggcgct cgccgacgcc ctctcgtccg ggacgacgcc tgcgcgccgg 6720 ctcatcgtga tagacgctac ggtgcgctcc ctctacggcg agcagcttgc cgcctacctg 6780 gcgggccacg acgtggagtt ccacctgtgc gtcatcgacg cacacgagtc ggcaaaggtc 6840 atggagaccg tcttcgaagt cgtggacgcg atggacgcct tcggtgtgcc acggcgccac 6900 gcaccggtgc tcgccatggg tggcggggtg ctcacggaca tcgtcggtct tgcggcgagc 6960 ctgtaccgca gggccacgcc gtacgtccgc atacccacga ccctgatcgg gatgatcgac 7020 gcgggcatcg gcgccaagac aggtgtcaac ttccgtgagc acaagaatcg gttgggcacg 7080 tatcacccct cctcgctgac cctcatcgat cccggcttcc tcgccacact cgacgcccga 7140 cacctgcgca acggtctggc ggaaatcctg aaggtggccc tggtcaagga tgccgaactg 7200 ttcgatctgc tggaggggca cggcgcgagc ctggtcgagc agcggatgca accgggcgag 7260 ggcgggacgg gcggtgcggc gctcacagtg ctgcgccggg cggtccaggg catgctggag 7320 gagctccagc ccaatctctg ggagcaccag ctgcggcgcc tggtggactt cggccactcc 7380 ttctcaccca gcgtggagat ggcggcgctg cccgagttgc tgcacggtga ggccgtctgc 7440 atcgacatgg cgctcagctc ggtgctcgcc catcaccgtg ggctactgac cgaggccgag 7500 ctcggccgtg tcctcgatgt catgcgtctg ctccacctgc ctgtgctcca cccggtgtgc 7560 acgccggacc tcatgcgcgc ggcgctcgcg gacacggtca aacaccggga cggctggcaa 7620 cacatgcccc ttccacgcgg gatcggcgac gccgtgttcg tgaacgacgt cactcaacgg 7680 gagatcgagg ccgcgcttct cacactcgcc gagcgggacc gggtgccgcg gtggcgggcg 7740 ctgcacggtg ccgtggacat gggggtgtga gcgcatggac ggagtgcgtg ccgtactgct 7800 ggcggggggc gaaggccggc gcatggggcc gctgggacgc ggcaggctca agccgctggt 7860 gccgttcggc ggcacctccc ggctcatcga tttcagcatc gccaacgttc accggtcggg 7920 cctgcgggac gtcctgctgc tgtcgcagta cgaggagcgc cgcctcatgg acgatctgca 7980 cctggtctgg aacgggcgcc accgcggctt ccggatagat ttcggcccct atgacgcggt 8040 gtaccggcgc tcaccgggca agcttcccga gcaactgccg gagcgtatct ggccgttgga 8100 acgcggcaca gccgacgcgc tgctcaccaa ggccgagtac gtcttcaggc agggtgacgc 8160 agaggcctcg gagatcctcg tgctccacgc ggaccacgtc taccgtttcg actacggcga 8220 catgatccgc gagcaccgcg cgtccaaggc cgcgctgaca gtgtcgtacc agcgcatcga 8280 gcggcggtac gtgcaccttt tcggcatggt cgagttcgac ggggacggcc tgctcacagc 8340 gttcgaggan aagcctgacg accccacgag ngacctggtg ttcgccgcct tctgcctctn 8400 nnacncggcg actctgcggc gttacctgga gcaactgcgc ggcanggatt ggcagcacga 8460 catcagcagg gacgtcatcc cggngatgct ggcgggcggc gaactcatcc acgggtatga 8520 ggtcaagagc tactgggagg acatcggcac cgtggaccgc taccaccgcg cccatcgcgg 8580 actgctgcgg ncggatcc 8598 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ValC-F(forword primer) <400> 2 gtacgtccgc atacccacga ccctgatc 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ValC-R(reverse primer) <400> 3 catctccacg ctgggtgaga aggagtg 27

Claims (2)

1. 서열번호 1로 표시되는 유전자를 포함하는 발리다마이신 생합성 유전자 클러스터.
2. 서열번호 2와 3으로 표시되는 제 1 항 기재의 유전자를 분리, 검출 및 증폭하는 프라이머.

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