CN103740734B - 厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株。所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,全长为5189个碱基。本发明还涉及厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5670及其突变菌株;同时,本发明还涉及利用所述菌株生产厦门霉素的方法。本发明为利用厦门链霉菌及其突变菌株或携带有上述生物合成基因簇的基因工程菌通过生物合成来发酵生产苯并吡喃类化合物提供了菌种来源,且其突变菌株可用于工业生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株。
背景技术
Streptomyces xiamenensis的模式菌株是分离自中国福建省红树林沉积物的一株链霉菌,在此菌株的发酵液中,发现了一苯并吡喃衍生物:
N-[[3,4-dihydro-3S-hydroxy-2S-methyl-2-(4′R-methyl-3′S-pentenyl)-2H-1-benzopyran-6-yl]carbonyl]-threonine,结构式如下:
此化合物由3个结构单元构成:L-苏氨酸、4-羟基苯甲酸和香叶草基。这类化合物有较低的细胞毒性、良好的细胞膜穿透性。据报道此化合物具有抑制ICAM-1(细胞间粘附分子-1)/LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)介导的细胞粘附作用,具有开发为抗炎和抗纤维化药物的潜力。异戊烯基取代的苯并吡喃类化合物,主要来源有:植物提取、全化学合成和化学酶学合成,本发明涉及利用微生物培养生物合成此类化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株,具体为从厦门链霉菌中克隆并获得苯并吡喃类生物碱(厦门霉素)的生物合成方法及通过异源表达在其它链霉菌中生物合成该化合物,并通过引入抗生素抗性提高该化合物产量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的,
第一方面,本发明涉及一种厦门霉素的生物合成基因簇,所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,全长为5189个碱基。
优选的,所述基因簇包含基因ximA,ximB,ximC,ximD和ximE;具体为:
ximA:位于SEQ ID NO.1第1-1563碱基处,编码520个氨基酸;
ximB:位于SEQ ID NO.1第1788-2729碱基处,编码313个氨基酸;
ximC:位于SEQ ID NO.1第2795-3385碱基处,编码196个氨基酸;
ximD:位于SEQ ID NO.1第3394-4815碱基处,编码473个氨基酸;
ximE:位于SEQ ID NO.1第4815-5189碱基处,编码124个氨基酸。
第二方面,本发明涉及前述生物合成基因簇在生产厦门霉素中的用途。
第三方面,本发明涉及一种厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5670。
第四方面,本发明涉及如前述的厦门链霉菌的突变菌株,通过将突变型rpsL基因转入所述厦门链霉菌而得。
优选地,所述突变菌株为厦门链霉菌(Strep tomyces xiamenensis)CGMCC No.5674、厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5675或厦门链霉菌(Streptomycesxiamenensis)CGMCC No.5676。
第五方面,本发明涉及一种厦门霉素的生产方法,取前述的厦门链霉菌或其突变菌株或携带前述的厦门霉素生物合成基因簇的基因工程菌株,发酵,可得厦门霉素。
本发明的厦门霉素生物合成基因簇的克隆及其异源表达的方法具体为:
步骤一,提取该链霉菌的基因组DNA,建立Fosmid文库;
步骤二,根据该基因组扫描的结果,用针对异戊烯基转移酶设计的引物对待选菌株基因组文库进行PCR扩增,筛选到阳性克隆p9A11;
步骤三,以p9A11为模板设计引物,该PCR产物大小为7.5K,覆盖整个基因簇,将此PCR产物连接在pMD18-T载体上。筛选到阳性克隆子后,酶切,将插入片段再与载体pJTU1278相连,构建载体pLM009403。
步骤四,使用PCR Targeting技术,敲除该基因簇中的ximA、ximB、ximC、ximD、ximE,再将突变质粒导入出发菌株中,敲除相应的基因;
步骤五,经HPLC分析后,ximB、ximC、ximD、ximE突变株发酵液上清中,该苯并吡喃化合物均消失,而ximA突变株中产生了一个中间代谢产物(厦门霉素B),从而证实该基因簇为此苯并吡喃化合物的生物合成基因簇;
步骤六,从ximA突变株发酵液中,利用制备型高效液相色谱,将厦门霉素B分离纯化并进行结构鉴定,化学结构如附图1(G);
步骤七,将整个基因簇与载体pSET152相连接,构建新载体pLM009404,转入变铅青链霉菌中,在发酵液中检测厦门霉素的存在;
步骤八,克隆厦门链霉菌中核糖体蛋白S12的编码基因,针对第43位赖氨酸残基、第88位赖氨酸残基、第90位的亮氨酸残基进行体外PCR定点诱变,分别获得K43R、K88E、L90K三个突变类型的rpsL基因;
步骤九,将突变型rpsL基因克隆至链霉菌整合性表达载体pIB139中,将突变型rpsL基因转入大肠杆菌ET12567::pUZ8002中,然后通过大肠杆菌-链霉菌接合转移转入到厦门链霉菌中,获得苯并吡喃产量提高的突变菌株。
本发明涉及的突变株,所述突变株为前述的厦门链霉菌的链霉素抗性突变株,所述突变株的突变特征在于携带有突变型rpsL基因的质粒,且突变rpsL基因编码的氨基酸分别存在K43R、K88E、L90K三个突变类型。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从微生物基因组中得到苯并吡喃化合物抗生素生物合成基因簇。
本发明还提供了从微生物基因组文库中分离苯并吡喃化合物生物合成基因的方法。
本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。
包含本发明的序列或至少部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到对应的产物。这些外源宿主包括链霉菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物以及动物细胞等。
本发明中,所述产生菌-厦门链霉菌(Streptomycesxiamenensis)已于2011年12月29日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,菌种保藏编号为CGMCC No.5670。
所述突变株为该厦门链霉菌的三种抗性突变菌株,也已于2011年12月29日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,菌种保藏编号分别为CGMCC No.5674、CGMCC No.5675、CGMCC No.5676;生物材料样品分类命名均为Streptomycesxiamenensis。
本发明具有的有益效果为:本发明为利用厦门链霉菌及其突变菌株或携带有上述生物合成基因簇的基因工程菌株通过生物合成来发酵生产苯并吡喃类化合物提供了菌种来源,且其突变菌株可用于工业生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为突变菌株与野生型菌株发酵产物的高效液相色谱分析图;
其中:A为野生型菌株发酵产物的高效液相色谱分析图;B为ximA突变株发酵产物的高效液相色谱分析图;C为ximB突变株发酵产物的高效液相色谱分析图;D为ximC突变株发酵产物的高效液相色谱分析图;E为ximD突变株发酵产物的高效液相色谱分析图;F为ximE突变株发酵产物的高效液相色谱分析图;G为厦门霉素B结构式;
图2为厦门霉素生物合成基因簇在变铅青链霉菌中异源表达示意图;其中,A为载体pLM009404导入野生型变铅青链霉菌后的HPLC图谱;B为野生型变铅青链霉菌的HPLC图谱;
图3为三个突变型rpsL基因插入链霉菌表达载体pIB139的酶切验证示意图;
图4为PCR定点诱变提供厦门霉素产量示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及从厦门链霉菌中克隆并获得苯并吡喃类生物碱(厦门霉素)的生物合成方法及通过异源表达在其它链霉菌中生物合成该化合物,并通过引入抗生素抗性提高该化合物产量的方法。
具体为:根据目标化合物结构特点和C13标记的羟基苯甲酸(4-HBA)喂养证实4-HBA为苯并吡喃类化合物生物合成的前体分子之一。针对苯并吡喃类化合物生物合成途径中存在的异戊烯基转移酶,通过生物信息学分析从厦门链霉菌318基因组中确定包含异戊烯基转移酶的候选生物合成基因簇。依据该基因簇中异戊烯基转移酶基因序列设计引物进行PCR扩增筛选,从厦门链霉菌318基因组文库中获得携带上述基因簇的黏粒p9A11。以该黏粒p9A11上5188bp片段为基础进行基因中断实验,证实删除厦门链霉菌318基因组中异戊烯基转移酶基因可以阻断目标化合物苯并吡喃的生物合成。将该基因簇与载体pSET152相连接,转入变铅青链霉菌中进行异源表达,在宿主的发酵上清液中可检测出厦门霉素。克隆厦门链霉菌中核糖体蛋白S12的编码基因rpsL进行体外PCR定点诱变,将突变型rpsL基因克隆至链霉菌整合性表达载体上,通过大肠杆菌-链霉菌接合转移转入到厦门链霉菌中,获得苯并吡喃产量提高的突变菌株。具体过程见以下各实施例:
实施例1、厦门霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达
步骤一,取厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5670,提取该链霉菌的基因组DNA,建立Fosmid文库;
用500μL溶菌酶溶液悬浮5mg菌丝体,在37℃温育直至细胞成为半透明状;
加入50%体积的2%SDS,混合振荡约1min直到溶液的粘度显著下降,然后加入1倍体积的中性苯酚/氯仿,混合振荡均匀后,12000rpm离心5min,移取上清液,弃去白色中间层;
用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见(或非常少)中间层为止,最后,加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(自然pH)和1倍体积的异丙醇,上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团,用玻棒挑出DNA沉淀团,用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次,最后弃去所有上清液,待乙醇挥发后,用一定量TE缓冲液溶解DNA沉淀待用;
使用EPICENTRE Biotechnologies公司的试剂盒CopyControlTM Fosmid LibraryProduction Kit,按照其说明书的流程,建立该菌的Fosmid文库;
步骤二,根据该基因组扫描的结果,用针对异戊烯基转移酶设计的引物对待选菌株基因组文库进行PCR扩增,筛选到阳性克隆p9A11;
以Fosmid质粒为PCR模板,利用引物YY-318-5313筛选异戊烯基转移酶的阳性克隆,其中引物序列为
正向:5’-TGGCTGGGGATGGTCTTCG-3’(SEQ ID NO.2);
反向:5’-CCTTGTCCTGGTGGGCGTA-3’(SEQ ID NO.3)。
20μL扩增反应体系为包含9μL ddH2O、2μL10×PCR Bμffer、1μL DMSO、引物(20μM)各1μL、4μL dNTP(each2.5mM)、1μL Taq酶(lμnit/μL)、1μL总DNA。PCR扩增条件为:95℃预变性3min,然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min共30个循环,再72℃后延伸10min。
PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,大小约为200bp。
步骤三,以p9A11为模板设计引物,该PCR产物大小为7.5K,覆盖整个基因簇,将此PCR产物连接在pMD18-T载体上。筛选到阳性克隆子后,酶切,将插入片段再与载体pJTU1278相连,构建载体pLM009403;
以p9A11为模板设计引物,
正向引物为:5‘-GCTCTAGACGGCTGGAGTGTAGCGAGTCTGGAATG-3’(SEQ ID NO.4),
反向引物为:5‘-GGAATTCCCCGGACGTGGGAGCGATAGGG-3’(SEQ ID NO.5)。
该PCR产物大小为7.5K,覆盖整个基因簇,使用KOD FX高成功率PCR酶。
PCR体系如下:2×PCR Bμffer25μl;2mM dNTP10μl;引物10pmol/μl各1.5μl;模板150ng/μl1μl;KOD FX1μl;水为10μl。
PCR循环条件为94℃预变性2min,然后98℃变性10sec,68℃延伸8min共40个循环,再4℃保温。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,胶回收约7.5K片段,此片段与pMD18-T载体相连,连接体系及条件:插入片段2μl(158ng/μl);载体3μl(50ng/μl),solμtionI5μl,16℃,15h。
连接产物经化学转化至E.coli DH5α中,经菌落PCR以及酶切验证,筛选到阳性克隆子后,XbaI和hindIII双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,胶回收约7.5K片段,此片段再与已两次单酶切的pJTU1278载体相连,连接体系及条件:插入片段3μl(134ng/μl);载体2μl(114ng/μl),solμtion I5μl,16℃,15h。
连接产物经化学转化至E.coli DH5α中,经菌落PCR以及酶切验证,筛选到阳性克隆子后,再经XbaI和HindIII双酶切验证,载体和插入片段大小都符合理论大小;
步骤四,使用PCR Targeting技术,敲除该基因簇中的ximA、ximB、ximC、ximD、ximE,再将突变质粒导入出发菌株中,敲除相应的基因。
将构建好的pLM009403质粒,化学转化至E.coli BW25113中,备用;
设计引物用以置换相应的阅读框。
置换ximA,
正向引物(SEQ ID NO.6):
5’-ATGAGACAGGAGCATCGGGTGGACATACCCGAGAACTTGTGGTTCATGTGCAGCTCCATC-3’,
反向引物(SEQ ID NO.7)
5’-TCACGTTCGAGGCGCATTCGACGCCGGATAGTGACGATG TGAGCTCAGCCAATCGACTG-3’,
置换ximB,
正向引物(SEQ ID NO.8):
5’-GTGATCGATATTTCCGCTCAACCCTCGCAGCAGAGCACGTGGTTCATGTGCAGCTCCATC-3’,
反向引物(SEQ ID NO.9):
5‘-TCAAAAGACTCTCCCCGCAACGATGGCGACGAGCACGAGTGAGCTCAGCCAATCGACTG-3’,
置换ximC,
正向引物(SEQ ID NO.10):
5’-GTGCGCACGGAGTCGCGCAGCCTGGCCCAGTTCGTGGCGTGGTTCATGTGCAGCTCCATC-3’,
反向引物(SEQ ID NO.11):
5‘-TCATGCGTCGTGGACGGCGTCTCGATCGAGGAGACACGGTGAGCTCAGCCAATCGACTG-3’,
置换ximD,
正向引物(SEQ ID NO.12):
5‘-ATGCCGAACTCTCCCGCCGCGGTCTTCGAGCGGCTCACCTGGTTCATGTGCAGCTCCATC,
反向引物(SEQ ID NO.13):
5’-TCACGTCGTCTCCATCATCGTGTACTCCTGCCGGATCCG TGAGCTCAGCCAATCGACTG-3’,
置换ximE,
正向引物(SEQ ID NO.14):
5‘-ATGGGCCAGACGACGCACACAGCACTCGACCGCTACATGTGGTTCATGTGCAGCTCCATC-3’,
反向引物(SEQ ID NO.15):
5’-TCAGCCCGGCGTACGGGTGTACCGGTTGCGCAGGTTCGTTGAGCTCAGCCAATCGACTG-3’。
以载体pSET152为模板,20μL扩增反应体系为包含9μL ddH2O、2μL10×PCRBμffer、1μL DMSO、引物(20μM)各1μL、4μL dNTP(each2.5mM)、1μL Taq酶(lμnit/μL)、1μL pSET152。
PCR扩增条件为:95℃预变性3min,然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min共30个循环,再72℃后延伸10min。
PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,大小约为1000bp。
分别胶回收此5个PCR产物,并分别电转至E.coli BW25113/pJTU318-3中,涂布于LB固体培养基中,培养12h~16h,菌落PCR及酶切验证阳性克隆子。
将得到的置换载体,转入E.coli ET12567中,与野生型的厦门链霉菌孢子进行接合转移。
得到的抗药性的克隆经2次稀释培养后,分别涂布于阿泊拉抗性和硫链丝菌素抗性的SFM固体平板上。挑取在阿泊拉抗性平板上生长,而在硫链丝菌素抗性平板上不生长的菌落。提取其总DNA,见步骤一,利用PCR的方法,筛选双交换子。
步骤五,经HPLC分析后,ximB、ximC、ximD、ximE突变株发酵液上清中,该苯并吡喃化合物均消失,而ximA突变株中产生了一个中间代谢产物(厦门霉素B),从而证实该基因簇为此苯并吡喃化合物的生物合成基因簇。
将原始菌株和突变菌株相同条件接种发酵培养基进行摇瓶发酵,将它们的孢子悬浮液分别接种于50ml TSB培养基中,30℃,220rpm,培养48h。
第三天分别转接于100ml ISP2培养基中,30℃,220rpm,培养5天。
第六天取发酵液,离心,取上清液,70℃水浴蒸干,残渣溶于1ml甲醇中,用0.45mm纤维素膜过滤后使用高效液相色谱分析。
色谱分析工作条件为:色谱柱:Aglilent zorbax-C18,5μm,4.6*250mm。利用高效液相色谱分析野生型菌株和突变菌株产苯并吡喃化合物。
流动相组成:乙腈和0.1%甲酸水,以梯度洗脱方式进行分离,线性梯度程序为8分钟内乙腈浓度从15%增加至40%,8至19分钟由40%增加至55%,19至26分钟由55%增加至85%保持4分钟后2分钟内降至15%,平衡3分钟。流速0.5ml/min,紫外单波长检测设定为254nm,DAD波长扫描范围190~400nm,间隔2nm,分析进样量10μl。
野生型菌株发酵产物、ximA突变株发酵产物、ximB突变株发酵产物、ximC突变株发酵产物、ximD突变株发酵产物、ximE突变株发酵产物、导入载体的变铅青链霉菌发酵产物、变铅青链霉菌野生株发酵产物的高效液相色谱分析图如图1所示,图1(A)为野生菌株的HPLC图谱,峰A标识的为厦门霉素;图1(B)为ximA突变株的HPLC图谱,峰B标识的为厦门霉素B;图1(C)为ximB突变株的HPLC图谱,峰A厦门霉素消失了;图1(D)为ximC突变株的HPLC图谱,峰A厦门霉素消失了;图1(E)为ximD突变株的HPLC图谱,峰A厦门霉素消失了;图1(F)为ximE突变株的HPLC图谱,峰A厦门霉素消失了。
步骤六,从ximA突变株发酵液中,利用制备型高效液相色谱,将厦门霉素B分离纯化并进行结构鉴定。
将突变菌株相同条件接种发酵培养基进行摇瓶发酵。将它们的孢子悬浮液分别接种于50ml TSB培养基中,30℃,220rpm,培养48h。第三天分别转接于100ml ISP2培养基中,共200个摇瓶,30℃,220rpm,培养5天。第六天取发酵液,离心,取上清液,70℃水浴蒸干,残渣溶于50%甲醇中,用0.45mm纤维素膜过滤后使用高效液相色谱制备。色谱分析工作条件为:色谱柱:,10×250mm,4.6μm。流动相组成:乙腈和0.1%甲酸水,以梯度洗脱方式进行分离,线性梯度程序为8分钟内乙腈浓度从15%增加至40%,8至19分钟由40%增加至55%,19至26分钟由55%增加至85%保持4分钟后2分钟内降至15%,平衡3分钟。流速0.5ml/min,紫外单波长检测设定为254nm,DAD波长扫描范围190~400nm,间隔2nm,进样量每次5ml。
得到的厦门霉素B为黄色粉末,经氢谱和碳谱分析,结构式如图1G所示。氢谱和碳谱的数据如下表:
1H NMR data of xiamenmycin B(in DMSO-d6)
13C NMR data of xiamenmycin B
Position | 厦门霉素B |
1 | - |
2 | 79.61 |
3 | 65.70 |
4 | 30.60 |
4a | 120.35 |
5 | 130.81 |
6 | 124.25 |
7 | 128.80 |
8 | 116.41 |
8a | 156.87 |
9 | 37.45 |
10 | 21.12 |
1 1 | 122.25 |
12 | 131.69 |
13 | 17.41 |
14 | 25.41 |
15 | 18.40 |
1’ | 167.08 |
2’ | - |
3’ | - |
4’ | - |
5’ | - |
6’ | - |
实施例2、如SEQ ID NO.1所示的整个基因簇的功能验证
本实施例采用将基因簇在变铅青链霉菌中异源表达进行基因簇的功能验证,将如SEQ ID NO.1所示的整个基因簇与载体pSET152相连接,构建新载体pLM009404,转入变铅青链霉菌中,在发酵液中检测厦门霉素的存在。
步骤一,以p9A11为模板设计引物,
正向引物为:5‘-GCTCTAGACGGCTGGAGTGTAGCGAGTCTGGAATG-3’(SEQ ID NO.16),
反向引物为:5‘-GGAATTCCCCGGACGTGGGAGCGATAGGG-3’(SEQ ID NO.17)。
该PCR产物大小为7.5K,覆盖整个基因簇,使用KOD FX高成功率PCR酶。
PCR体系如下:2×PCR Buffer 25μl;2mM dNTP 10μl;引物10pmol/μl各1.5μl;模板150ng/μl1μl;KOD FX1μl;水为10μl。
PCR循环条件为94℃预变性2min,然后98℃变性10sec,68℃延伸8min共40个循环,再4℃保温。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,胶回收约7.5K片段,此片段与pMD18-T载体相连,连接体系及条件:插入片段2μl(158ng/μl);载体3μl(50ng/μ l),solutionI5μ1,16℃,15h。
连接产物经化学转化至E.coli DH5α中,经菌落PCR以及酶切验证,筛选到阳性克隆子后,XbaI和HindIII双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,胶回收约7.5K片段,此片段再与已两次单酶切的pSET152载体相连,连接体系及条件:插入片段5μl(99ng/μl);载体1μl(50ng/μl),solution I6μl,16℃,15h。
连接产物经化学转化至E.coli DH5α中,经菌落PCR以及酶切验证,筛选到阳性克隆子后,再经XbaI和HindIII双酶切验证,载体和插入片段大小都符合理论大小。
步骤二、将该载体转入E.coli ET12567中,与野生型的变铅青链霉菌孢子进行接合转移。得到的抗药性的克隆利用PCR的方法,筛选突变株。
步骤三、突变株经发酵后,利用HPLC检测厦门霉素。厦门霉素生物合成基因簇在变铅青链霉菌中异源表达情况如图2所示,图2(A)为载体pLM009404导入野生型变铅青链霉菌后的HPLC图谱,峰A为厦门霉素;图2(B)为野生型变铅青链霉菌的HPLC图谱,无厦门霉素的峰出现。可见,通过本实施例确切证实了,如SEQ ID NO.1所示的整个基因簇具有生物合成厦门霉素的功能。
实施例3、厦门链霉菌中rpsL基因定点突变提高厦门霉素的产量
步骤一、依据厦门链霉菌基因组中核糖体S12蛋白(大小为124aa)编码基因rpsL序列,针对第43位赖氨酸残基、第88位赖氨酸残基、第90位的亮氨酸残基设计PCR定点诱变引物:
K43R-F:CACCACCCCGAGGAAGCCGAACTC(SEQ ID NO.18)
K43R-R:GAGTTCGGCTTCCTCGGGGTGGTG(SEQ ID NO.19)
K88E-F:GGCCGTGTGGAGGACCTGCCGGGTG(SEQ ID NO.20)
K88E-R:CACCCGGCAGGTCCTCCACACGGCC(SEQ ID NO.21)
L90K-F:GTGTGAAGGACAAGCCGGGTGTCCG(SEQ ID NO.22)
L90K-R:CGGACACCCGGCTTGTCCTTCACAC(SEQ ID NO.23)
通过PCR定点诱变,可分别获得K43R、K88E、L90K三个突变类型的rpsL基因。
步骤二、将突变型rpsL基因克隆至链霉菌整合性表达载体pIB139中,在上述突变型rpsL基因翻译的起始子和终止子位点处分别设计包含NdeI和EcoRV位点的引物。
通过PCR扩增,先将突变型rpsL基因克隆至测序载体pMD-18中,得到过渡载体p820/K43R、p822/K88E、p827/L90K。
进一步利用NdeI和EcoRV双酶切,回收391bp的片段后,与5.7kb回收的pIB139-NdeI&EcoRV片段相连,获得载体827/pIB139(L90K)。
步骤三、将突变型rpsL基因转入大肠杆菌ET12567::pUZ8002中,然后通过大肠杆菌-链霉菌接合转移,进一步将突变型rpsL基因转入到厦门链霉菌中,得接合转移子,酶切验证结果如图3所示,由图3可知:酶切结果与预期一致;
本步骤得到的突变株均已进行保藏,具体为:所述突变株为该厦门链霉菌的三种抗性突变菌株,于2011年12月29日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,菌种保藏编号分别为CGMCC No.5674、CGMCC No.5675、CGMCC No.5676;分别对应K88E、L90K、K43R三个突变类型而得。
步骤三、培养上述突变株经发酵后,利用HPLC检测厦门霉素。PCR定点诱变提供厦门霉素产量情况如图4所示,由图4可知:3个突变株M5、M6、M7中峰A厦门霉素的产量极大的提高,约为野生型产量的10~20倍,另外峰B、C、D、E、F的产量也大大的极高。
综上所述,本发明为利用厦门链霉菌及其突变菌株或携带有上述生物合成基因簇的基因工程菌通过生物合成来发酵生产苯并吡喃类化合物提供了菌种来源,且其突变菌株可用于工业生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (5)
1.一种厦门霉素生物合成基因簇,其特征在于,所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,全长为5189个碱基。
2.如权利要求1所述的厦门霉素生物合成基因簇,其特征在于,所述基因簇包含基因ximA,ximB,ximC,ximD和ximE;具体为:
ximA:位于SEQ ID NO.1第1-1563碱基处,编码520个氨基酸;
ximB:位于SEQ ID NO.1第1788-2729碱基处,编码313个氨基酸;
ximC:位于SEQ ID NO.1第2795-3385碱基处,编码196个氨基酸;
ximD:位于SEQ ID NO.1第3394-4815碱基处,编码473个氨基酸;
ximE:位于SEQ ID NO.1第4815-5189碱基处,编码124个氨基酸。
3.一种如权利要求1或2所述的厦门霉素生物合成基因簇在生产厦门霉素中的用途。
4.一种厦门链霉菌的突变菌株,其特征在于,通过将突变型rpsL基因转入厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5670而得;所述突变菌株为厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5674、厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5675或厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5676。
5.一种厦门霉素的生产方法,其特征在于,取如权利要求4所述的菌株或携带如权利要求1所述的厦门霉素生物合成基因簇的基因工程菌株,发酵,可得厦门霉素。
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