CN104099350A - 一种利用重组大肠杆菌合成d-苯基乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组乳酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，是在序列的第52位由酪氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸中的任意一种。本发明还涉及含有上述的重组乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌以及利用重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法。本发明通过对D-LDH的底物识别位点处的酪氨酸通过定点突变技术替换成较小的疏水氨基酸残基-缬氨酸，提高D-LDH对底物苯丙酮酸的亲和力及催化效率，转化表达宿主后，苯乳酸产量相比未突变菌株均有显著提高，经6h全细胞转化，苯乳酸产量从18g/L提高到24.6g/L。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种利用重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法。
背景技术
苯基乳酸（phenyllactic acid, PLA），也称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸，因其对细菌，真菌和霉菌都有很好的抑制效果，可以作为理想的食品防腐剂而获得广泛的关注。目前，苯乳酸主要由化学合成或微生物转化两种方式获得，化学合成因其生产条件要求高，反应过程复杂，副产物且工业染污严重等缺点使得微生物转化合成有价值的化合物更有利于建设绿色可持续发展经济。用于苯乳酸研究的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等，目前报道主要集中在利用这些野生菌转化苯丙酮酸合成苯乳酸，其产量从数毫摩尔到约200mM。自然界的微生物胞内的转化苯丙酮酸生成苯乳酸的乳酸脱氢酶含量是受到基因调控的，低水平的酶含量和活力限制了微生物的催化活力。乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸转化生成苯乳酸的化学反应式如下：
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
因此，采用定点突变技术对乳酸脱氢酶基因进行改造，并将该基因导入微生物胞内，也许能够为提高苯乳酸的产量提供一条新思路。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种重组乳酸脱氢酶基因，解决现有的乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸转化生成苯乳酸产量有限的问题。
本发明的第二个目的是含有上述重组乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌
本发明的第三个目的是利用重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种重组乳酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列的第52位由酪氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸中的任意一种。
二、含有上述的重组乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌。
三、一种利用上述重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法，该方法包括以下步骤：
（1）乳酸脱氢酶基因的获取，以植物乳杆菌CGMCC（1.2437）的全基因组为模板，PCR扩增获得乳酸脱氢酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，扩增所用引物序列如下：
上游引物（含BamHI酶切位点）：CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC（SEQ ID NO:9）
下游引物（含HindIII酶切位点）：CCCAAGCTTTTAATCAAACTTAACTTGTG（SEQ ID NO:10）
（2）乳酸脱氢酶基因构建入表达载体pET-28a得到重组质粒pET-28a-ldh；
（3）以重组质粒pET-28a-ldh为模板，P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物进行PCR扩增，将乳酸脱氢酶的底物识别位点处的酪氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，获得带有突变位点的目的片段，并将目的片段构建入表达载体获得重组质粒pET-28a-ldhY52A、pET-28a-ldhY52V、pET-28a-ldhY52L，P1/P2、P3/P4、P5/P6引物序列如下：
P1：5-CCTTTTGTTGAACTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:3）
P2：5-TGCCGATGTAGTTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:4）
P3：5-CCTTTTGTTGAAGTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:5）
P4：5-TGCCGATGTACTTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:6）
P5：5-CCTTTTGTTGAGCTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:7）
P6：5-TGCCGATGTAGCTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:8）
（4）重组质粒pET-28a-ldhY52V转化入大肠杆菌，IPTG诱导表达；
（5）以苯丙酮酸为反应底物，重组大肠杆菌发酵产生苯基乳酸。
进一步的，步骤（5）中起始底物浓度为9g/L，重组大肠杆菌干重为20 g/L，pH为7.0，反应温度为37℃，反应时间为6h。
进一步的，在反应的前2小时，每20 min添加一次底物，每次添加0.4 g。
采用上述技术方案的积极效果：本发明通过对D-LDH的底物识别位点处的酪氨酸通过定点突变技术替换成较小的疏水氨基酸残基，如丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，提高D-LDH对底物苯丙酮酸的亲和力及催化效率，转化表达宿主后，苯乳酸产量相比未突变菌株均有显著提高，其中以缬氨酸效果为最佳。
附图说明
图1是载体构建流程示意图；
图2是乳酸脱氢酶PCR产物电泳图；
图3是克隆质粒BamHI和HindIII双酶切电泳图；
图4是表达质粒BamHI和HindIII酶切电泳图；
图5是乳酸脱氢酶SDS-PAGE蛋白电泳图；
图中：M：标准蛋白Marker；1：未诱导的重组菌；2：经诱导的重组菌；3：空质粒菌株；4：原始菌株；
图6是不同乳酸脱氢酶突变菌对转化苯基乳酸影响；
图7是底物流加合成苯基乳酸。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、植物乳杆菌CGMCC：1.2437购于CGMCC。
下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明pET-28a-ldh的构建。
挑取植物乳杆菌单菌落于10 ml的液体培养基中30℃，200 rpm过夜培养(约10 h)，按1%将种子培养液接种于10 ml新鲜液体培养基培养至对数后期，使用基因组DNA提取试剂盒（上海生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒）提取基因组。液体培养基 (g/L)：酪蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸钠5，柠檬酸二胺2，Tween 80 1，KHPO4 2，MgHPO47H2O 0.2，MnSO4H2O 0.05，CaCO3 20，pH 6.8，补蒸馏水至1L。
构建表达载体所用的引物序列如下：
上游引物（含BamHI酶切位点）：CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC
下游引物（含HindIII酶切位点）：CCCAAGCTTTTAATCAAACTTAACTTGTG
乳酸脱氢酶基因PCR条件如下：98℃变性10 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
凝胶电泳分离纯化PCR产物，胶回收大约996bp乳酸脱氢酶基因（如图2所示），将目的片段连接PMD19-T-Simple vector，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含有100 ng/ml氨苄青霉素的LB培养基平板。转化子分别经菌落PCR验证、质粒酶切验证（如图3所示）和测序验证确保获得正确质粒。大肠杆菌培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10。
用BamHI和HindIII对表达载体pET-28a进行双酶切，胶回收线性目的片段（如图4所示）。
表达质粒pET-28a经双酶切线性片段分别于测序正确的乳酸脱氢酶基因用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，菌落PCR和质粒双酶切电泳鉴定阳性克隆，再提取构建成功的重组质粒pET-28a-ldh，转化表达宿主BL21(DE3)感受态，筛选阳性克隆，表达重组菌株BL21(DE3) pET-28a-ldh构建完成。IPTG诱导表达结果如图5所示。
实施例2
本实施例说明pET-28a-ldhY52V的构建。
以提取构建好的重组质粒pET-28a-ldh为模板，P1/P2为引物，按照定点突变试剂盒说明书进行PCR，反应产物转化大肠杆菌JM109感受态，菌落PCR和质粒双酶切电泳鉴定阳性克隆，再提取构建成功的重组质粒pET-28a-ldhY52A送去生工测序，准确无误后转化表达宿主BL21(DE3)感受态，筛选阳性克隆，表达重组菌株BL21(DE3) pET-28a-ldhY52A构建完成。
以提取构建好的重组质粒pET-28a-ldh为模板，P3/P4为引物，按照定点突变试剂盒说明书进行PCR，反应产物转化大肠杆菌JM109感受态，菌落PCR和质粒双酶切电泳鉴定阳性克隆，再提取构建成功的重组质粒pET-28a-ldhY52V送去生工测序，准确无误后转化表达宿主BL21(DE3)感受态，筛选阳性克隆，表达重组菌株BL21(DE3) pET-28a-ldhY52V构建完成。
以提取构建好的重组质粒pET-28a-ldh为模板，P5/P6为引物，按照定点突变试剂盒说明书进行PCR，反应产物转化大肠杆菌JM109感受态，菌落PCR和质粒双酶切电泳鉴定阳性克隆，再提取构建成功的重组质粒pET-28a-ldhY52L送去生工测序，准确无误后转化表达宿主BL21(DE3)感受态，筛选阳性克隆，表达重组菌株BL21(DE3) pET-28a-ldhY52L构建完成。
实施例3
本实施例说明重组大肠杆菌全细胞转化合成苯乳酸。
挑取重组菌单菌落接种于含有50 mg/L的硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min过夜培养(约9 h)，按照1%接种于含有相同浓度卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600约0.6～0.8时，添加IPTG浓度至0.6 mmol/L,将诱导温度下调至25℃，200 r/min条件下诱导5 h后离心收集菌体，用预冷pH 7.0磷酸缓冲液洗涤两次，制备好的菌泥用于全细胞转化。
实施例4
将收集的菌体重悬在含有20 g/L葡萄糖，9 g/L 苯丙酮酸钠和pH7.0的转化培养基中，使重组大肠杆菌干重为20 g/L，37℃、200 r/min恒温震荡转化培养，定时取样。同时测试在相同的条件下大肠杆菌BL21(DE3)，BL21(DE3) pET-28a-ldh，BL21(DE3) pET-28a-ldhY52A，BL21(DE3) pET-28a-ldhY52V，BL21(DE3) pET-28a-ldhY52L。
苯丙酮酸钠，苯基乳酸检测：取一定量转化液于4℃、12000 r/min离心20分钟，上清液稀释适当倍数，经0.22 μm滤膜过滤后高效液相(岛津，LC-20A)检测。色谱条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H有机酸分析柱；流动相为5 mmol/L稀硫酸；流速0.6 ml/min；柱温30℃；进样体积5 μl，检测波长210 nm。结果如图6所示。可见，经过定点突变后，三种乳酸脱氢酶基因的催化效率具有一定程度的提高，其中，以突变成缬氨酸的效果为最好。
实施例5
参照实施例3和实施例4转化条件，通过流加培养重组大肠杆菌BL21(DE3) pET-28a-ldhY52A，BL21(DE3) pET-28a-ldhY52V，BL21(DE3) pET-28a-ldhY52L全细胞转化苯丙酮酸钠合成苯基乳酸。起始转化条件参照实施例4，50 ml的转化体系中，在反应的前2小时，每20 min添加一次底物，每次添加0.4 g。反应6 h后取样检测。结果如图7所示，效果同实施例4，仍然是三种乳酸脱氢酶基因的催化效率具有一定程度的提高，其中，以突变成缬氨酸的效果为最好。
综上，本发明通过对D-LDH的底物识别位点处的酪氨酸通过定点突变技术替换成较小的疏水氨基酸残基，如丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，提高D-LDH对底物苯丙酮酸的亲和力及催化效率，转化表达宿主后，苯乳酸产量相比未突变菌株均有显著提高，其中以缬氨酸效果为最佳。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一种利用重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法
<130> xb14071001
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 突变后的乳酸脱氢酶基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(996)
<220>
<221> mutation
<222> (154)..(156)
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(156)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
atg aaa att att gca tat gct gta cgt gat gac gaa cgt cca ttc ttc 48
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe
1 5 10 15
gat act tgg atg aaa gaa aac cca gat gtt gaa gtt aaa tta gtt cca 96
Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro
20 25 30
gaa tta ctt act gaa gac aac gtt gac tta gct aaa ggc ttc gac ggt 144
Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly
35 40 45
gcc gat gta nnn caa caa aag gac tat act gct gaa gta ttg aac aag 192
Ala Asp Val Xaa Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys
50 55 60
tta gcc gac gaa ggg gtt aag aac atc tct ctt cgt aac gtt ggt gtt 240
Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val
65 70 75 80
gat aac ttg gac gtt cct act gtt aaa gca cgt ggc tta aac att tct 288
Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser
85 90 95
aac gta cct gca tac tca cca aat gcg att gct gaa tta tca gta acg 336
Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr
100 105 110
caa ttg atg caa tta tta cgt caa acc cca ttg ttc aac aag aag tta 384
Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu
115 120 125
gct aag caa gac ttc cgt tgg gca cca gat att gcc aag gaa tta aac 432
Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn
130 135 140
acc atg act gtt ggt gtt atc ggt act ggt cgg att ggc cgt gct gcc 480
Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
atc gat att ttc aaa ggc ttc ggc gct aag gtt atc ggt tac gat gtt 528
Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val
165 170 175
tac cgg aat gct gaa ctt gaa aag gaa ggc atg tac gtt gac acc ttg 576
Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
gac gaa tta tac gcc caa gct gat gtt atc acg tta cac gtt cct gca 624
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala
195 200 205
ttg aag gat aac tac cac atg ttg aat gcg gat gcc ttc agc aag atg 672
Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met
210 215 220
aaa gat ggc gcc tac atc ttg aac ttt gct cgt ggg aca ctc atc gat 720
Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp
225 230 235 240
tca gaa gac ttg atc aaa gcc tta gac agt ggc aaa gtt gcc ggt gcc 768
Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala
245 250 255
gct ctt gat acg tat gaa tac gaa act aaa atc ttc aac aaa gac ctt 816
Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu
260 265 270
gaa ggt caa acg att gat gac aag gtc ttc atg aac ttg ttc aac cgc 864
Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg
275 280 285
gac aat gtt ttg att aca cca cat acg gct ttc tac act gaa act gcc 912
Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala
290 295 300
gtt cac aac atg gtg cac gtt tca atg aac agt aac aaa caa ttc atc 960
Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile
305 310 315 320
gaa act ggt aaa gct gac aca caa gtt aag ttt gat 996
Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp
325 330
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> The 'Xaa' at location 52 stands for Val, Ala or Leu.
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe
1 5 10 15
Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly
35 40 45
Ala Asp Val Xaa Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys
50 55 60
Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val
65 70 75 80
Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr
100 105 110
Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu
115 120 125
Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn
130 135 140
Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val
165 170 175
Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala
195 200 205
Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp
225 230 235 240
Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala
245 250 255
Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu
260 265 270
Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg
275 280 285
Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala
290 295 300
Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile
305 310 315 320
Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp
325 330
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P1
<400> 3
ccttttgttg aactacatcg gcaccgtcga agc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P2
<400> 4
tgccgatgta gttcaacaaa aggactatac tgc 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P3
<400> 5
ccttttgttg aagtacatcg gcaccgtcga agc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P4
<400> 6
tgccgatgta cttcaacaaa aggactatac tgc 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P5
<400> 7
ccttttgttg agctacatcg gcaccgtcga agc 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P6
<400> 8
tgccgatgta gctcaacaaa aggactatac tgc 33
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增乳酸脱氢酶基因的上游引物
<400> 9
cgcggatcca tgaaaattat tgcatatgc 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增乳酸脱氢酶基因的下游引物
<400> 10
cccaagcttt taatcaaact taacttgtg 29
Claims (5)
1.一种重组乳酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列的第52位由酪氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸中的任意一种。
2.含有权利要求1所述的重组乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌。
3.一种利用权利要求2所述的重组大肠杆菌合成D-苯基乳酸的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）乳酸脱氢酶基因的获取；
（2）乳酸脱氢酶基因构建入表达载体pET-28a得到重组质粒pET-28a-ldh；
（3）以重组质粒pET-28a-ldh为模板，P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物进行PCR扩增，将乳酸脱氢酶的底物识别位点处的酪氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，获得带有突变位点的目的片段，并将目的片段构建入表达载体获得重组质粒pET-28a-ldhY52A、pET-28a-ldhY52V、pET-28a-ldhY52L，P1/P2、P3/P4、P5/P6引物序列如下：
P1：5-CCTTTTGTTGAACTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:3）
P2：5-TGCCGATGTAGTTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:4）
P3：5-CCTTTTGTTGAAGTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:5）
P4：5-TGCCGATGTACTTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:6）
P5：5-CCTTTTGTTGAGCTACATCGGCACCGTCGAAGC（SEQ ID NO:7）
P6：5-TGCCGATGTAGCTCAACAAAAGGACTATACTGC（SEQ ID NO:8）
（4）重组质粒pET-28a-ldhY52V转化入大肠杆菌，IPTG诱导表达；
（5）以苯丙酮酸为反应底物，重组大肠杆菌发酵产生苯基乳酸。
4.根据权利要求书3所述的方法，其特征在于：步骤（5）中起始底物浓度为9g/L，重组大肠杆菌干重为20 g/L，pH为7.0，反应温度为37℃，反应时间为6h。
5.根据权利要求书4所述的方法，其特征在于：在反应的前2小时，每20 min添加一次底物，每次添加0.4 g。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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2014
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