CN114854657A - 一种产苯乳酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种产苯乳酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。本发明的双功能群体感应装置包括动态调控苯乳酸合成酶基因表达的群体感应激活系统和调控酪氨酸合成的群体感应抑制系统。本发明利用双功能群体感应装置调控苯乳酸的合成途径和竞争性酪氨酸合成途径，以提高大肠杆菌耐受苯乳酸和缺乏营养物质酪氨酸的能力，从而提高菌株合成苯乳酸的能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种产苯乳酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
苯乳酸又称为2-羟基-3-苯基丙酸，是合成聚苯乳酸的单体。因聚苯乳酸的单体含有苯基基团，具有比聚乳酸更强的热稳定性、机械强度和紫外吸收性能，从而成为继聚乳酸之后新兴的可降解生物基聚合物材料。除作为合成聚苯乳酸的单体之外，苯乳酸还是一种广谱的新型天然防腐剂，对多数革兰氏阳性、阴性菌和真菌都有明显的抑菌作用。在医学上，可作为丹参素替代品用于治疗冠心病，具有止血止痛疗效，抗血小板聚集和扩张冠状动脉等功能。在化妆品行业，具有除皱、亮肤的美容功效。作为新型的抑菌剂，特别对肠道致病菌具有良好的抑制作用，苯乳酸类化合物成功应用于畜禽养殖业，代替抗生素成分并提高鸡肉品质，提高蛋鸡的免疫能力以及鸡蛋的质量，减少猪的肠道致病菌并提高生产性能。
目前苯乳酸的合成主要通过化学法和生物法。化学法合成步骤复杂、需要使用有机溶剂、环境污染大。生物法又分为微生物发酵、酶法和全细胞催化法。酶法需要辅酶I，成本高，不适合工业化生产。全细胞催化是将合成苯乳酸的相关酶基因在底盘细胞中进行异源表达，通过添加前体物质，如苯丙氨酸、苯丙酮酸，催化目标产物的合成。但这些前体物质价格高，导致苯乳酸的利润值低，不适合工业化生产。微生物发酵法又有天然菌株和工程微生物发酵法。天然菌株发酵因菌株产率低难以满足工业生产需求。因此，合成生物学和代谢工程技术的发展，工程微生物发酵法已成为苯乳酸合成的最有前景的方法。
发明专利CN202010823789.6公开了一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌及其生产苯乳酸的方法，但受限于地衣芽孢杆菌的遗传改造技术，难以进一步提高苯乳酸的发酵产率，以满足工业化生产的需求。
日本学者在苯丙氨酸产生菌大肠杆菌NST37中质粒表达荧光威克汉酵母(Wickerhamia fluorescens TK-1)苯丙酮酸还原酶基因，实现了D-苯乳酸的以葡萄糖为原料的从头合成(Applied Microbiology&Biotechnology(2013)97:8887–8894)。
现有技术研究的苯乳酸合成酶基因都是静态调控，在加入诱导剂后基因的表达水平是恒定不变的。而苯乳酸是一种抑菌活性很强的化合物，会严重抑制宿主菌的生长，从而影响其合成。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种产苯乳酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
第一目的，本发明提供了一种产苯乳酸的双功能群体感应装置，包括动态调控苯乳酸合成酶基因表达的群体感应激活系统和调控酪氨酸合成的群体感应抑制系统；
群体感应激活系统或群体感应抑制系统包括用于插入细胞的基因组中的感应基因和用于转入所述细胞的响应基因表达元件，其中，所述感应基因包括介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因和所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白的编码基因的组合；所述响应基因表达元件含有受所述感应基因调控的启动子及由所述启动子启动转录表达的功能基因。
所述感应基因包括来自斯氏泛菌(Pantoea stewartii)的Esa系统的EsaI的编码基因esaI和转录调节因子EsaR170V的编码基因esaR170V的组合，其中EsaI介导自诱导物质的信号分子AHL合成，EsaR170V是AHL的受体结合蛋白。
针对现有技术的缺点及苯乳酸的高毒性，本发明采用群体感应激活系统对苯乳酸合成酶基因进行动态调控。在生长初期，EsaI合成的群体感应信号分子AHL少，EsaRI70V结合在启动子PeasR上，导致苯乳酸合成酶基因不表达；随着菌体的生长，EsaI合成的群体感应信号分子AHL越来越多，AHL与EsaRI70V结合、与启动子PeasR剥离，驱使苯乳酸合成酶基因开始表达、从而合成苯乳酸；也即苯乳酸的合成由菌体生长自动诱导，从而避免苯乳酸对菌体细胞生长的毒性。
常规的阻断竞争性代谢途径的方法是基因敲除，但是敲除酪氨酸合成途径会导致菌株为酪氨酸营养缺陷，培养时需要添加酪氨酸才能生长。为此，本发明，又将采用群体感应抑制系统对酪氨酸合成途径进行调控，在生长初期，EsaI合成的群体感应信号分子AHL少，EsaRI70V结合在启动子PeasS上，驱使下游基因tyrA的表达、合成酪氨酸，供细胞生长；随着菌体的生长，EsaI合成的群体感应信号分子AHL越来越多，AHL与EsaRI70V结合、抑制启动子PeasS，使下游基因tyrA不表达，驱使碳代谢流合成苯乳酸。
本发明的核心是利用双功能群体感应装置调控苯乳酸的合成途径和竞争性酪氨酸合成途径，以提高大肠杆菌耐受苯乳酸和缺乏营养物质酪氨酸的能力，从而提高菌株合成苯乳酸的能力。
优选地，响应基因表达元件转入所述细胞中的是通过化学转化法或电击转化法。
所述响应基因表达元件是线性的核酸片段、病毒载体、质粒，或者其组合。
所述基因组包括存在细胞核中的染色体，或存在于细胞的亚细胞组分(线粒体)中的细胞器DNA。
优选地，受所述感应基因调控的启动子是PeasS或PeasR。
启动子PeasS特异性响应AHL与EsaRI70V复合物，能够在该复合物的调控下激活下游功能基因表达。
作为本发明所述产苯乳酸的双功能群体感应装置的优选实施方式，在群体感应抑制系统中，大肠杆菌的tyrA基因序列插入群体感应抑制系统中，调控tyrA基因的表达；P37启动子控制的aroGD146N和pheA1-300整合在大肠杆菌的染色体上。
作为本发明所述产苯乳酸的双功能群体感应装置的优选实施方式，所述群体感应激活系统包括Esa-PesaR激活系统或LuxI/LuxR系统；所述群体感应抑制系统包括Esa-PeasS抑制系统。
作为本发明所述产苯乳酸的双功能群体感应装置的优选实施方式，所述Esa-PesaR激活系统包括EsaI-EsaRI70V-PesaR；所述LuxI/LuxR系统包括LuxI-LuxR-Plux；所述Esa-PeasS抑制系统包括EsaI-EsaRI70V-PesaS。
作为本发明所述产苯乳酸的双功能群体感应装置的优选实施方式，苯乳酸合成酶(乳酸脱氢酶)基因为钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator H16)CnldhA(GenBank:CAJ91827.1)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)LdhdhA(GenBank:CR954253.1)、戊糖乳酸杆菌(Lactobacillus pentosus)LpD-ldh(GenBank:FR874854.1)、荧光威克汉酵母(Wickerhamia fluorescens TK-1)WfpprA(GenBank:AB621792.1)、嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)PaldhA(GenBank:AB776697)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Lpldh(GenBank:ACGZ02000027.1)或乳酸杆菌(Lactobacillus sp.CGMCC 9967)ppr(GenBank:KP735960.1)。
第二目的，本发明提供了上述双功能群体感应装置在制备苯乳酸中的应用。
第三目的，本发明提供了上述双功能群体感应装置的重组大肠杆菌。
第四目的，本发明提供了上述重组大肠杆菌的构建方法，所述构建方法包括基因置换法，将群体感应抑制系统和P37启动子控制的aroGD146N和pheA1-300整合在大肠杆菌的染色体上。所述基因置换法包括CRISPR法，基因置换法不仅包括上述方法，还包括本领域常规的基因置换法。
优选地，将苯乳酸合成酶基因酶切连接到群体感应质粒pZBK-PesaSIC-PesaRAS的激活启动子PesaR后的多克隆位点，得到pZBK-PesaRAS-CnldhA，群体感应激活表达载体pZBK-PesaSIC-PesaRAS过表达苯乳酸合成酶基因。
第五目的，本发明提供的上述重组大肠杆菌在制备苯乳酸中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述大肠杆菌选自大肠杆菌K12衍生菌、BL21(DE3)及其衍生菌、B REL606菌株、E.coli W菌株或DH1菌株。优选地，K12衍生菌包括BW25113、MG1665、W3110、DH10B、BW2952、MDS42及其衍生菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的核心利用双功能群体感应装置调控苯乳酸的合成途径和竞争性酪氨酸合成途径，以提高大肠杆菌耐受苯乳酸和缺乏营养物质酪氨酸的能力，从而提高菌株合成苯乳酸的能力。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如本文所用的，“自诱导物质的信号分子”是指可诱导自身或相关分子激活的生物分子。
实施例中使用的菌种和质粒：
苯丙氨酸产生菌：大肠杆菌NST74，也即ATCC 31884。
莽草酸产生菌：大肠杆菌SA110(含去反馈抑制aroGD146N,Microbial CellFactories 2014,13:21)。
含P37启动子的表达载体：pZACBP(Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology(2015)42:627–636)。
群体感应质粒：pZBK-PesaSIC-PesaRAS(Biotechnology Biofuels 2019,12:94)。
基因敲除用CRISPR质粒：pCas(Applied and Environmental Microbiology2015,81(7):2506-2514)、pTargetB(Frontiers Microbiology 2018,9:1623)。
实施例1、Esa-PeasS群体感应抑制系统调控竞争性酪氨酸合成途径
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以F1/F2为引物、大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增tyrA上游片段，AvrII/MluI酶切连接到实验室之前报道的群体感应质粒pZBK-PesaSIC-PesaRAS(Biotechnology Biofuels(2019)12:94)的AvrII/MluI间，得到pZBK-UHtyrA-PesaSIC；以F3/F4为引物、大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增tyrA下游片段，EcoRII/BamHI酶切连接到pZBK-UHtyrA-PesaSIC的EcoRII/BamHI间，得到pZBK-UHtyrA-PesaSIC-DHtyrA。用AvrⅡ/BamHⅡ双酶切pZBK-UHtyrA-PesaSIC-DHtyrA得到含群体感应抑制模块的打靶片段UHtyrA-PesaSIC-DHtyrA。
以F5/F6为引物、pTargetB为模板进行反向PCR构建sgRNA表达质粒pTargetB-PtyrA。基因置换/敲除采用文献介绍的CRISPR-Cas方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology 2015,81(7):2506-2514)。具体如下：将Cas9表达质粒pCas转化到大肠杆菌NST74的化学感受态细胞中。挑选含pCas的大肠杆菌NST74单克隆于5mL含25μg/mL卡那霉素的LB试管液体培养基中，30℃、200rpm下培养过夜；按1％接种量接到50mL含50μg/mL卡那霉素和30mM L-阿拉伯糖的LB摇瓶培养基中，30℃、200rpm下培养至OD600为0.6左右时，制备电激感受态细胞；取100ng pTargetB-PtyrA和100ng打靶片段UHtyrA-PesaSIC-DHtyrA，加入50μL电激感受态细胞于点击杯中，于1.25kV下电激；涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的LB平板上，于30℃培养24h；挑选菌落PCR验证正确的菌落，按文献介绍方法(Appliedand Environmental Microbiology 2015,81(7):2506-2514)去除pTargetB-PtyrA和pCas，获得tyrA受群体感应抑制系统控制的大肠杆菌PHE01。
实施例2、整合P37控制的去反馈抑制aroG和pheA
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以F7/F8为引物、大肠杆菌SA110基因组为模板，PCR扩增aroGD146N，连接到pMD19T载体上，得到pMD19T-aroGfbr；以F9/F10为引物、大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增截短pheA1 -300，BglII/KpnI酶切连接到pMD19T-aroGfbr的BglII/KpnI上，得到pMD19T-aroGfbr-pheAfbr；用NheI/KpnI酶切到pZAC-BP表达载体的NheI/KpnI上，得到pZAC-aroGfbr-pheAfbr。以F11/F12为引物、大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增dinB上游片段，EcoRI/BglII酶切PCR片段，连接到pZAC-aroGfbr-pheAfbr的BglII，得到pZAC-UHdinB-P37-aroGfbr-pheAfbr；以F13/F14为引物、大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增dinB下游片段，BamHI/SalI酶切PCR片段，连接到pZAC-UHdinB-P37-aroGfbr-pheAfbr的BamHI/SalI，得到pZAC-UHdinB-P37-aroGfbr-pheAfbr-DHdinB；用EcoRI/SalI酶切该载体得到打靶片段UHdinB-P37-aroGfbr-pheAfbr-DHdinB。
以F15/F16为引物、pTargetB为模板进行反向PCR构建sgRNA表达质粒pTargetB-dinB。将打靶片段UHdinB-P37-aroGfbr-pheAfbr-DHdinB和sgRNA表达质粒pTargetB-dinB电转到含pCas的大肠杆菌PHE01中，按实施例1的方法将大肠杆菌PHE01的dinB基因置换成P37-aroGfbr-pheAfbr，得到大肠杆菌PHE01ΔdinB:P37-aroGfbr-pheAfbr，命名为大肠杆菌PHE02。
实施例3、表达苯乳酸合成酶(乳酸脱氢酶)的群体感应质粒及产苯乳酸重组大肠杆菌的构建
钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator H16)乳酸脱氢酶基因(CnldhA)(GenBank:CAJ91827.1)委托商业公司进行全基因合成，用KpnI/XbaI酶切连接到群体感应质粒pZBK-PesaSIC-PesaRAS的激活启动子PesaR后的KpnI/XbaI上，得到pZBK-PesaRAS-CnldhA。
将表达乳酸脱氢酶的群体感应质粒分别转化到苯丙氨酸产生菌大肠杆菌NST74、PHE01和PHE02，分别得到产苯乳酸产生菌大肠杆菌NST74(pZBK-PesaRAS-CnldhA)、PHE01(pZBK-PesaRAS-CnldhA)和PHE02(pZBK-PesaRAS-CnldhA)。
实施例4、重组大肠杆菌合成苯乳酸
挑选单克隆接种于5mL LB试管培养液中，于37℃、200rpm下培养过夜，接种至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，使初始OD600为0.05。发酵培养基成份为：8g/L酵母提取物、14g/L(NH4)2SO4、2g/L柠檬酸钠、4g/L KH2PO4、20g/L葡萄糖、8mg/LFeSO4·7H2O、40mg/L硫胺素、2g/LMgSO4。于37℃、200rpm下发酵48h。取样HPLC分析苯乳酸浓度和菌体浓度OD600。HPLC条件如下：色谱条件：色谱柱Inertsil ODS-SP柱(5mm,
GL SciencesInc.)；流动相：A为0.05％TFA水溶液:0.05％TFA甲醇溶液＝8:2(v/v)；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长210nm。结果如下表。
表1不同重组大肠杆菌合成苯乳酸的量
群体感应激活系统控制的苯乳酸合成酶(乳酸脱氢酶)除了实施例介绍的质粒表达之外，还可整合到大肠杆菌的染色体上进行表达。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种产苯乳酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
<130> 2022-05-18
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.一种产苯乳酸的双功能群体感应装置，其特征在于，包括动态调控苯乳酸合成酶基因表达的群体感应激活系统和调控酪氨酸合成的群体感应抑制系统；
群体感应激活系统或群体感应抑制系统包括用于插入细胞的基因组中的感应基因和用于转入所述细胞的响应基因表达元件，其中，所述感应基因包括介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因和所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白的编码基因的组合；所述响应基因表达元件含有受所述感应基因调控的启动子及由所述启动子启动转录表达的功能基因。
2.如权利要求1所述的双功能群体感应装置，其特征在于，在群体感应抑制系统中，大肠杆菌的tyrA基因序列插入群体感应抑制系统中，调控tyrA基因的表达；P37启动子控制的aroGD146N和pheA1-300整合在大肠杆菌的染色体上。
3.如权利要求1所述的双功能群体感应装置，其特征在于，所述群体感应激活系统包括Esa-PesaR激活系统或LuxI/LuxR系统；所述群体感应抑制系统包括Esa-PeasS抑制系统。
4.如权利要求3所述的双功能群体感应装置，其特征在于，所述Esa-PesaR激活系统包括EsaI-EsaRI70V-PesaR；所述LuxI/LuxR系统包括LuxI-LuxR-Plux；所述Esa-PeasS抑制系统包括EsaI-EsaRI70V-PesaS。
5.如权利要求1所述的双功能群体感应装置，其特征在于，苯乳酸合成酶基因为钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator H16)CnldhA、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)LdhdhA、戊糖乳酸杆菌(Lactobacillus pentosus)LpD-ldh、荧光威克汉酵母(Wickerhamiafluorescens TK-1)WfpprA、嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)PaldhA、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Lpldh或乳酸杆菌(Lactobacillus sp.CGMCC 9967)ppr。
6.如权利要求1-5任一项所述的双功能群体感应装置在制备苯乳酸中的应用。
7.含权利要求1-5任一项所述的双功能群体感应装置的重组大肠杆菌。
8.一种如权利要求7所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括基因置换法，将群体感应抑制系统和P37启动子控制的aroGD146N和pheA1-300整合在大肠杆菌的染色体上。
9.如权利要求7所述的重组大肠杆菌在制备苯乳酸中的应用。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌选自大肠杆菌K12衍生菌、BL21(DE3)及其衍生菌、B REL606菌株、E.coli W菌株或DH1菌株。
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