CN104845988B - 一种增强d-苯基乳酸产量的d-ldh-fdh融合基因的构建与表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增强D‑苯基乳酸产量的D‑LDH‑FDH融合基因的cDNA序列，由D‑LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成。本发明还提供了该融合基因的构建方法以及表达方法。本发明将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，并且融合蛋白中的乳酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，较乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶在同一细胞内分开表达时高，催化苯丙酮酸转化成苯基乳酸时表现出更强的催化效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的构建与表达。
背景技术
苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种新型的生物防腐剂，它具有抗革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等功能。此外，苯基乳酸还是中药提取物“丹参素”的类似物，具有一定的药用价值。因此苯基乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。目前，苯乳酸主要由化学合成或微生物转化两种方式获得，化学合成法在不同程度上存在污染环境、技术复杂、条件苛刻、副产物多等缺陷。因此，研究人员将研究方向转向了生物合成法。近几年用于苯乳酸研究的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。2000年，LAVERMICOCCA P等首次报道从酸面团中分离到的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)21B，苯乳酸产量达到56.44mg/L。随后研究相继获得多株产苯乳酸的乳酸菌，但菌株间产量差异较大，且苯乳酸产量相对都较低。
乳酸脱氢酶是自然界微生物细胞内转化苯丙酮酸生成苯基乳酸的关键酶，但由于该酶催化过程中需要消耗体系中的还原型辅酶，还原型辅酶的额外添加使反应成本显著增加。因此开发系统中还原型辅酶再生的方法亦是研究的关键。近年来，甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一，甲酸脱氢酶体系是最成功的再生体系。因此，如果能在乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸转化生成苯基乳酸的同时，结合甲酸脱氢酶应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统，可能能够大幅度提高苯乳酸产量。流程示意如下：
发明内容
本发明的第一目的是提供一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列。
本发明的第二目的是提供上述cDNA序列的构建方法。
本发明的第三目的是提供包含上述cDNA序列的载体。
本发明的第四目的是提供包含载体的宿主细胞。
本发明的第五目的是提供上述cDNA序列的表达方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列，由D-LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及经过取代、缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质。
所述乙酸脱氢酶来自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述甲酸脱氢酶来自于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。
进一步的，所述的核苷酸序列中1-996来自D-LDH基因，序列996bp；997-1041bp为连接肽的DNA序列，共45bp；1042-2133bp来自FDH基因，序列1092bp。
进一步的，所述的连接肽的DNA序列如SEQ ID No.3所示，编码的氨基酸序列如SEQID No.4所示，包括12个甘氨酸和3个丝氨酸。
二、上述的cDNA序列的构建方法，该方法包括以下步骤：
(1)设计PCR引物，使D-LDH的下游引物和FDH的上游引物具有一段重叠互补区域；
(2)分别通过PCR反应扩增两个基因；
(3)利用overlap extension PCR技术，将两个基因片段拼接起来，同时在两个基因之间添加柔性的连接肽序列。
进一步的，所述的PCR引物序列如下：
D-LDH引物：
上游引物：5’-CGC GGA TCC GAA AAT TAT TGC ATA TGC-3’(SEQ ID No.5)；
下游引物：5’-GTC AAA CTT AAC TTG TGTG-3’(SEQ ID No.6)；
FDH引物：
上游引物：5’-CAC ACA AGT TAA GTT TGA CGG CGG TGG CGG CAG CGG CGG AGGCGG AAG CGG AGG CGG AGG AAG CAT GAA GAT CGT TTT AGTC-3’(SEQ ID No.7)；
下游引物：5’-AAC TGC AGT TAT TTC TTA TCG TGT TTA CCG-3’(SEQ ID No.8)。
三、一种载体，包含上述的cDNA序列。
四、一种宿主细胞，含有上述的载体。
五、一种上述的cDNA序列的表达方法，包括用上述的载体，转化上述的宿主细胞，诱导表达得融合蛋白。
采用上述技术方案的积极效果：本发明将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，使两种酶在空间上更加靠近，功能辅助上更加便利，并且融合蛋白中的乳酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，较乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶在同一细胞内分开表达时高。催化苯丙酮酸转化成苯基乳酸时表现出更强的催化效果；融合基因构建方法简单、易操作；采用的连接肽利于两个基因所编码的蛋白质保持原来的构象，不影响蛋白的活性；本发明对于苯乳酸的生产具有非常重要的意义。
附图说明
图1为乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶基因分别PCR扩增的核酸电泳图；
图中：泳道L1,L2,L3为乳酸脱氢酶PCR扩增的核酸电泳图；泳道F1,F2,F3为甲酸脱氢酶PCR扩增的核酸电泳图；
图2为乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因片段进行融合PCR的核酸电泳图；
图中：泳道1、2、3为乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因融合产物电泳图；2000bp处条带为乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因融合产物，1000bp处条带为未参与基因融合的乳酸脱氢酶或者甲酸脱氢酶基因片段；
图3为质粒pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH双酶切核酸电泳图；
图中：泳道1、2、3为质粒pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH经BamHI和PstI双酶切；
图4为重组菌诱导表达SDS-PAGE分析结果；
图中：泳道M为标准蛋白Maker；泳道1、2为融合基因重组菌；泳道3为BL21(DE3)原始菌；
图5不同菌株全细胞合成苯基乳酸的产量。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC:1.2437，伊博丁假丝酵母(Candida boidinii)CGMCC 2.1647购于CGMCC；
2、E.coli BL21(DE3)，pETDuet-1购自于Novagen。
3、所有引物为自行设计并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。
下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明双酶共表达载体的构建。
1PCR引物设计
在保留D-LDH和FDH基因的功能区域基础上，设计PCR引物，在D-LDH的下游引物和FDH的上游引物设计一段重叠互补片段，并添加一段柔性的连接肽序列(linker)。
1.1D-LDH引物：上游引物(PL1)如下：
5’-CGC GGA TCC GAA AAT TAT TGC ATA TGC-3’(划线部分为BamHI酶切位点)
下游引物(PL2)如下：
5’-GTC AAA CTT AAC TTG TGTG-3’
1.2FDH引物：FDH上游引物中一段(下划线部分)与D-LDH的下游引物重叠互补，在进行融合PCR时用于连接两段基因。其中Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser为特定设计的连接肽序列。FDH上游引物(PF1)如下：
5’-CAC ACA AGT TAA GTT TGA CGG CGG TGG CGG CAG CGG CGG AGG CGG AAGCGG AGG CGG AGG AAG CAT GAA GAT CGT TTT AGTC-3’
FDH下游引物(PF2)如下：
5’-AAC TGC AGT TAT TTC TTA TCG TGT TTA CCG-3’(划线部分为PstI酶切位点)
2PCR扩增
2.1扩增D-LDH基因片段
PCR反应体系：植物乳杆菌基因组0.5-1.0μl(<200ng)，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上游引物(PL110pmol/μl)1-2μl，下游引物(PL210pmol/μl)1-2μl，加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为98°变性C 10sec，55°复性C 5sec或15sec.，72℃延伸30-60sec/kb，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。
2.2扩增FDH基因片段
PCR反应体系：伊博丁假丝酵母基因组0.5-1.0μl(<200ng)，PrimeSTAR MaxPremix(2×)25μl，上游引物(PF110pmol/μl)1-2μl，下游引物(PF210pmol/μl)1-2μl，加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为98°变性C 10sec，55°退火5sec或15sec.，72℃延伸30-60sec/kb，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。
2.3重组PCR反应体系和反应条件
将D-LDH和FDH的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳
回收纯化后(如图1所示)，以其为模板进行重叠延伸反应，获得D-LDH和FDH的融合基因片段。
PCR反应体系:D-LDH纯化产物和FDH纯化产物
按1：1混合作为模板，PL1、PF2(10pmol/L)各2.51μL(注:5个循环后加入)，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，补水至总体积50μL。
PCR反应条件:98℃预变性3min，前5个循环为98℃变性10s，45℃退火15s，72℃延伸lmin；后30个循环为98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，共35个循环。
3重组载体pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH的构建
将D-LDH和FDH融合PCR产物经凝胶电泳分离纯化，回收大约2154bp的融合基因(如图2所示)。将纯化产物用BamHI和PstI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的共表达载体pET-Duet-1连接，得到重组载体pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH，重组载体经双酶切验证如图3所示。
经过测序，该重组载体为将序列表中序列1插入表达载体pET-Duet-1的BamHI和PstI酶切位点间得到的载体。
实施例2
本实施例说明重组菌的构建及诱导表达融合蛋白。
1、重组菌的构建
将上述的重组载体pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，得到BL21(DE3)/pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH重组菌。
2、重组菌诱导表达融合蛋白
将转化好的BL21(DE3)/pET-Duet-D-LDH-Linker-FDH单菌落接种于含有50mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养(约9h)，按照1％接种于含有相同浓度氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃、200r/min培养至OD600约0.6-0.8时，添加IPTG浓度至0.6mmol/L，将诱导温度下调至25℃，200r/min条件下诱导5h后离心收集菌体，用PBS洗涤两次，用PBS重悬，将菌体沉淀超声破碎后8000r/min离心2min去上清，对蛋白成分进行SDS-PAGE分析。结果如图4所示。
实施例3
本实施例说明重组大肠杆菌全细胞转化合成苯基乳酸。
挑取重组菌单菌落接种于含有50mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养(约9h)，按照1％接种于含有相同浓度氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃、200r/min培养至OD600约0.6-0.8时，添加IPTG浓度至0.6mmol/L，将诱导温度下调至25℃，200r/min条件下诱导5h后离心收集菌体，PBS洗涤两次，制备好的菌泥用于全细胞转化。将收集的菌体重悬在含有20g/L葡萄糖，9g/L苯丙酮酸钠的pH7.0的转化培养基中，使重组大肠杆菌干重为20g/L，37℃、200r/min恒温震荡转化培养，定时取样。同样条件测定BL21(DE3)、BL21(DE3)/pET-Duet-D-LDH、BL21(DE3)/pET-Duet-D-LDH/FDH菌株对苯丙酮酸的转化。
取一定量转化液于4℃、12000r/min离心20分钟，将上清液稀释适当倍数，用0.22μm滤膜过滤，然后用高效液相(岛津，LC-20A)进行检测。色谱条件：色谱柱为Bio-Rad AminexHPX-87H有机酸分析柱；流动相为5mmol/L稀硫酸；流速0.6ml/min；柱温30℃；进样体积5μl；检测波长210nm。结果如图5所示。
由结果可以看出融合后的D-LDH-Linker-FDH对底物的催化活性均较LDH单独表达时，和LDH、FDH在细胞里分开表达时高，苯基乳酸的产量有显著提高。
本发明将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，使两种酶在空间上更加靠近，功能辅助上更加便利，并且融合蛋白中的乳酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，较乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶在同一细胞内分开表达时高。催化苯丙酮酸转化成苯基乳酸时表现出更强的催化效果；融合基因构建方法简单、易操作；采用的连接肽利于两个基因所编码的蛋白质保持原来的构象，不影响蛋白的活性；本发明对于苯乳酸的生产具有非常重要的意义。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FHD融合基因的构建与表达
<130> xb15051901
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2133
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> D-LDH-FHD融合基因的cDNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2133)
<400> 1
atg aaa att att gca tat gct gta cgt gat gac gaa cgt cca ttc ttc 48
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe
1 5 10 15
gat act tgg atg aaa gaa aac cca gat gtt gaa gtt aaa tta gtt cca 96
Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro
20 25 30
gaa tta ctt act gaa gac aac gtt gac tta gct aaa ggc ttc gac ggt 144
Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly
35 40 45
gcc gat gta gtt caa caa aag gac tat act gct gaa gta ttg aac aag 192
Ala Asp Val Val Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys
50 55 60
tta gcc gac gaa ggg gtt aag aac atc tct ctt cgt aac gtt ggt gtt 240
Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val
65 70 75 80
gat aac ttg gac gtt cct act gtt aaa gca cgt ggc tta aac att tct 288
Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser
85 90 95
aac gta cct gca tac tca cca aat gcg att gct gaa tta tca gta acg 336
Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr
100 105 110
caa ttg atg caa tta tta cgt caa acc cca ttg ttc aac aag aag tta 384
Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu
115 120 125
gct aag caa gac ttc cgt tgg gca cca gat att gcc aag gaa tta aac 432
Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn
130 135 140
acc atg act gtt ggt gtt atc ggt act ggt cgg att ggc cgt gct gcc 480
Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
atc gat att ttc aaa ggc ttc ggc gct aag gtt atc ggt tac gat gtt 528
Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val
165 170 175
tac cgg aat gct gaa ctt gaa aag gaa ggc atg tac gtt gac acc ttg 576
Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
gac gaa tta tac gcc caa gct gat gtt atc acg tta cac gtt cct gca 624
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala
195 200 205
ttg aag gat aac tac cac atg ttg aat gcg gat gcc ttc agc aag atg 672
Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met
210 215 220
aaa gat ggc gcc tac atc ttg aac ttt gct cgt ggg aca ctc atc gat 720
Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp
225 230 235 240
tca gaa gac ttg atc aaa gcc tta gac agt ggc aaa gtt gcc ggt gcc 768
Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala
245 250 255
gct ctt gat acg tat gaa tac gaa act aag atc ttc aac aaa gac ctt 816
Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu
260 265 270
gaa ggt caa acg att gat gac aag gtc ttc atg aac ttg ttc aac cgc 864
Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg
275 280 285
gac aat gtt ttg att aca cca cat acg gct ttc tac act gaa act gcc 912
Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala
290 295 300
gtt cac aac atg gtg cac gtt tca atg aac agt aac aaa caa ttc atc 960
Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile
305 310 315 320
gaa act ggt aaa gct gac aca caa gtt aag ttt gac ggc ggt ggc ggc 1008
Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp Gly Gly Gly Gly
325 330 335
agc ggc gga ggc gga agc gga ggc gga gga agc atg aag atc gtt tta 1056
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ile Val Leu
340 345 350
gtc tta tat gat gct ggt aag cac gct gct gat gaa gaa aaa tta tat 1104
Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp Glu Glu Lys Leu Tyr
355 360 365
ggt tgt act gaa aat aaa tta ggt att gct aat tgg tta aaa gat caa 1152
Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn Trp Leu Lys Asp Gln
370 375 380
ggt cat gaa cta att act act tct gat aaa gaa ggt gaa aca agt gaa 1200
Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu Gly Glu Thr Ser Glu
385 390 395 400
ttg gat aaa cat atc cca gat gct gat att atc atc acc act cct ttc 1248
Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile Ile Thr Thr Pro Phe
405 410 415
cat cct gct tat atc act aag gaa aga ctt gac aag gct aag aac tta 1296
His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp Lys Ala Lys Asn Leu
420 425 430
aaa tta gtc gtg gtc gct ggt gtt ggt tct gat cac att gat tta gat 1344
Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp His Ile Asp Leu Asp
435 440 445
tat att aat caa aca ggt aag aaa atc tca gtc ttg gaa gtt aca ggt 1392
Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val Leu Glu Val Thr Gly
450 455 460
tct aat gtt gtc tct gtt gct gaa cac gtt gtc atg acc atg ctt gtc 1440
Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Met Leu Val
465 470 475 480
ttg gtt aga aat ttc gtt cca gca cat gaa caa att att aac cac gat 1488
Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln Ile Ile Asn His Asp
485 490 495
tgg gag gtt gct gct atc gct aag gat gct tac gat atc gaa ggt aaa 1536
Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr Asp Ile Glu Gly Lys
500 505 510
act att gct acc att ggt gct ggt aga att ggt tac aga gtc tta gaa 1584
Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly Tyr Arg Val Leu Glu
515 520 525
aga tta ctc cca ttt aat cca aaa gaa tta tta tac tac gat tat caa 1632
Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gln
530 535 540
gct tta cca aaa gaa gct gaa gaa aaa gtt ggt gct aga aga gtt gaa 1680
Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly Ala Arg Arg Val Glu
545 550 555 560
aat att gaa gaa tta gtt gct caa gct gat atc gtt aca gtt aat gct 1728
Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Thr Val Asn Ala
565 570 575
cca tta cac gca ggt aca aaa ggt tta att aat aag gaa tta tta tct 1776
Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn Lys Glu Leu Leu Ser
580 585 590
aaa ttt aaa aaa ggt gct tgg tta gtc aat acc gca aga ggt gct att 1824
Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Ala Ile
595 600 605
tgt gtt gct gaa gat gtt gca gca gct tta gaa tct ggt caa tta aga 1872
Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Arg
610 615 620
ggt tac ggt ggt gat gtt tgg ttc cca caa cca gct cca aag gat cac 1920
Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His
625 630 635 640
cca tgg aga gat atg aga aat aaa tat ggt gct ggt aat gcc atg act 1968
Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala Gly Asn Ala Met Thr
645 650 655
cct cac tac tct ggt act act tta gat gct caa aca aga tac gct gaa 2016
Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Glu
660 665 670
ggt act aaa aat atc ttg gaa tca ttc ttt acc ggt aaa ttt gat tac 2064
Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr Gly Lys Phe Asp Tyr
675 680 685
aga cca caa gat att atc tta tta aat ggt gaa tac gtt act aaa gct 2112
Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu Tyr Val Thr Lys Ala
690 695 700
tac ggt aaa cac gat aag aaa 2133
Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
705 710
<210> 2
<211> 711
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe
1 5 10 15
Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly
35 40 45
Ala Asp Val Val Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys
50 55 60
Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val
65 70 75 80
Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr
100 105 110
Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu
115 120 125
Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn
130 135 140
Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val
165 170 175
Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala
195 200 205
Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp
225 230 235 240
Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala
245 250 255
Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu
260 265 270
Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg
275 280 285
Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala
290 295 300
Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile
305 310 315 320
Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp Gly Gly Gly Gly
325 330 335
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ile Val Leu
340 345 350
Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp Glu Glu Lys Leu Tyr
355 360 365
Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn Trp Leu Lys Asp Gln
370 375 380
Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu Gly Glu Thr Ser Glu
385 390 395 400
Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile Ile Thr Thr Pro Phe
405 410 415
His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp Lys Ala Lys Asn Leu
420 425 430
Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp His Ile Asp Leu Asp
435 440 445
Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val Leu Glu Val Thr Gly
450 455 460
Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Met Leu Val
465 470 475 480
Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln Ile Ile Asn His Asp
485 490 495
Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr Asp Ile Glu Gly Lys
500 505 510
Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly Tyr Arg Val Leu Glu
515 520 525
Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gln
530 535 540
Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly Ala Arg Arg Val Glu
545 550 555 560
Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Thr Val Asn Ala
565 570 575
Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn Lys Glu Leu Leu Ser
580 585 590
Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Ala Ile
595 600 605
Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Arg
610 615 620
Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His
625 630 635 640
Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala Gly Asn Ala Met Thr
645 650 655
Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Glu
660 665 670
Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr Gly Lys Phe Asp Tyr
675 680 685
Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu Tyr Val Thr Lys Ala
690 695 700
Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
705 710
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽DNA
<400> 3
ggcggtggcg gcagcggcgg aggcggaagc ggaggcggag gaagc 45
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增D-LDH的上游引物
<400> 5
cgcggatccg atgaaaatta ttgcatatgc 30
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增D-LDH的下游引物
<400> 6
gtcaaactta acttgtgtg 19
<210> 7
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增FDH的上游引物
<400> 7
cacacaagtt aagtttgacg gcggtggcgg cagcggcgga ggcggaagcg gaggcggagg 60
aagcatgaag atcgttttag tc 82
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 扩增FDH的下游引物
<400> 8
aactgcagtt atttcttatc gtgtttaccg 30
Claims (8)
1.一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列，其特征在于：由D-LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQID No.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于：所述的核苷酸序列中1-996bp来自D-LDH基因，序列996bp；997-1041bp为连接肽的DNA序列，共45bp；1042-2133bp来自FDH基因，序列1092bp。
3.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于：所述的连接肽的DNA序列如SEQ IDNo.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，包括12个甘氨酸和3个丝氨酸。
4.权利要求1所述的cDNA序列的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)设计PCR引物，使D-LDH的下游引物和FDH的上游引物具有一段重叠互补区域；
(2)分别通过PCR反应扩增两个基因；
(3)利用overlap extension PCR技术，将两个基因片段拼接起来，同时在两个基因之间添加柔性的连接肽序列。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的PCR引物序列如下：
D-LDH引物：
上游引物：
下游引物：5’-GTC AAA CTT AAC TTG TGTG-3’(SEQ ID No.6)；
FDH引物：
上游引物：5’-CAC ACA AGT TAA GTT TGA CGG CGG TGG CGG CAG CGG CGG AGG CGGAAG CGG AGG CGG AGG AAG CAT GAA GAT CGT TTT AGTC-3’(SEQ ID No.7)；
下游引物：5’-AAC TGC AGT TAT TTC TTA TCG TGT TTA CCG-3’(SEQ ID No.8)。
6.一种载体，包含权利要求1所述的cDNA序列。
7.一种宿主细胞，含有权利要求6所述的载体。
8.一种权利要求1所述的cDNA序列的表达方法，包括用权利要求6所述的载体，转化权利要求7所述的宿主细胞，诱导表达得融合蛋白。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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ID=53845977
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260664A (zh) * | 2011-06-10 | 2011-11-30 | 尚科生物医药（上海）有限公司 | 固定化全细胞催化剂及其制备方法和应用 |
| CN102876737A (zh) * | 2012-09-13 | 2013-01-16 | 江苏梁丰食品集团有限公司 | 一种d-苯乳酸的酶催化合成方法 |
| CN104130967A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-05 | 南京林业大学 | 一株共表达l-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用 |
-
2015
- 2015-05-19 CN CN201510254279.0A patent/CN104845988B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| 重组大肠杆菌全细胞催化合成D-苯基乳酸的研究;赵明月等;《广东化工》;20150331;第42卷(第6期);摘要 * |
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