CN102517242A - 一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法及其专用工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法及其专用工程菌。该工程菌是将含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Branden-MTG-001 CGMCC No.5497。本发明通过对茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因优化，更改了起始密码子下游序列，使局部二级结构的自由能满足高表达要求，使表达量占全菌蛋白的43％，明显高于天然基因29％的表达，使MTG实现了高效表达。本发明为高效、大量、低成本生产谷氨酰胺转胺酶提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

Description

一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法及其专用工程菌

技术领域

本发明涉及微生物工程领域中的发酵表达方法及其工程菌，特别是涉及一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法及其专用工程菌。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶(Microbial Transglutaminase，MTG，E2.3.2.13)是一种催化多肽链中谷氨酰胺的γ-酰基转移至另一底物中的氨基，形成γ-谷氨酰化合物的转移酶，如底物为蛋白质，它能催化两个蛋白质之间的交联反应，底物包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等(Zhu Y，Rinzema A，.TramperJ，Bol J.Microbal transglutaminase-a review of its production and applicationin food processing.Appl.Microbiol.Biotechnol，1995.44：277-282)。通过催化蛋白质或多肽之间的交联反应，可提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等功能，从而使蛋白质类食品的质构、外观和风味等方面得到改善，并提高蛋白质的商业价值。目前，MTG已广泛应用于食品工业(Ye DY(叶丹英)，Peng ZY(彭志英)，Zhao MM(赵谋明)，Transglutaminase and its application in food processing.Journal of Zhongzhou Grain College(郑州粮食学院学报)，2000.21(2)：46-49)。谷氨酰胺转移酶广泛存在于多种动物组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子具有依赖性等因素，较难对其进行工业化生产。上世纪80年代末，Ando等发现茂原链轮丝菌、肉桂链轮丝菌和灰肉链轮丝菌等均能分泌MTG，且这些微生物所分泌的MTG具有热稳定性高、不需要钙离子，产物交联程度高等特点(Ando H，AdachiM，Umeda K，et al.Purification and characteristics of a novel transgloutaminasederived from microorganism.Agric Biol.Chem，1989.53：2613-2617.)。虽然MTG现已可以进行工业化生产，但天然酶表达量较低，生产成本较高，限制了它的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的工程菌。

本发明所提供的可提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的工程菌，是将含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的；所述经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

在所述经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的核苷酸序列中，与天然的基因序列相比，序列1自5’端第583位碱基由c突变为g，第586位碱基由a突变为c，第589位碱基由c突变为g。

用于构建所述含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体的出发载体可为pET-22b、pET-28或pET-15等，优选为pET-22b。

以pET-22b为出发载体，构建的含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体为pET-MTG。

所述大肠杆菌为适于蛋白表达的大肠杆菌菌株，优选为E.coli Rosetta(DE3)。

将含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体转化大肠杆菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法、PEG介导的原生质体转化法等。

具体来讲，转化含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因(序列1)表达载体pET-MTG的大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)的菌株为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Branden-MTG-001，该菌株已于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5497。

本发明的第二个目的是提供一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法。

本发明所提供的提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法，是发酵上述茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的工程菌，表达的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶以包涵体的形式存在于菌体细胞中，收集包涵体，对其进行纯化、变性、复性、离子交换层析和真空冷冻干燥后得到茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。

发酵上述工程菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.6-1.2mmol/L，优选为0.8mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。

对包涵体进行纯化包括以下步骤：将所得菌体用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA)缓冲液重悬，在低温下匀浆破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，将沉淀部分(包涵体)用含有TritonX-100的pH8.0的20mmol/LTris-HCl(0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％TritonX-100)缓冲液洗涤三次，然后再用适量的pH8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液处理三次。

对包涵体进行变性、复性包括以下步骤：将经洗涤纯化的包涵体(蛋白浓度约为20mg/mL)溶于pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，100mmol/Lβ-巯基乙醇)缓冲液中进行变性，室温搅拌过夜，离心去除沉淀后，将上清液用pH8.0的50mmol/L Tris-HCl(0.3mmol/L GSSG、3mmol/L GSH、1mmol/L的DTT、2mmol/L的尿素、50mmol/L甘氨酸、0.05％的TritonX-100)缓冲液稀释50倍，4℃搅拌过夜，导致包涵体复性。用0.5mol/L的醋酸调pH值至6.0，离心去除沉淀。

对复性产物进行纯化的方法可为强阳离子交换层析法、弱阳离子交换层析法等，优选为强阳离子交换层析法。

本发明提供了一种茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的原核高效表达方法。该方法是将初始密码子已优化的茂原链轮丝菌的谷氨酰胺转胺酶基因借助大肠杆菌表达载体导入大肠杆菌中，经发酵获得茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。其中p-ET22b为优选的大肠杆菌表达载体，该载体含有pelB信号肽的编码序列，使用限制性内切酶Nde I切除该序列后，表达产物便不含信号肽。所克隆的茂原链轮丝菌的谷氨酰胺转胺酶基因序列1G+C含量为66.66％，并含有大量的稀有密码子，其中AGA和AGG占编码精基酸密码子中的37.8％(11/29)，表明谷氨酰胺转胺酶的合成需要带有稀有密码子的tRNA^arg(AGG/AGA)。但在所有大肠杆菌含稀有密码子的tRNA中，tRNA^arg(AGG/AGA)含量最少，因此在使用E.Coli BL-21(DE3)和E.Coli BL-21(DE3)PLys作为宿主菌时，经IPTG诱导后未看到重组谷氨酰胺转胺酶的表达带，可能是这两株宿主菌中稀有密码子的tRNA^arg(AGG/AGA)含量不足所致。为提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶在大肠杆菌的表达水平，而使用能够表达稀有密码子的E.Coli Rosetta(DE3)宿主菌，E.Coli Rosetta(DE3)宿主菌含有稀有密码子的tRNA，使得大量tRNA^arg(AGG/AGA)基因得到表达，最终使重组谷氨酰胺转胺酶获得高效表达。实验证明经摇瓶培养可获得湿菌体6.3g/L培养基，得到纯化的包涵体0.62g，最终获得重组谷氨酰胺转胺酶纯酶117.4mg；若使用高密度发酵方法，每升培养基可获得超过116g湿菌体，最终得到2.3g纯酶，远高于现有的143mg天然酶/L培养基(可以)的表达水平(Yokoyama KI，Nakamura N，SeguroK，Kubota K.Overproduction of microbial transglutaminase in Escherichia coli，in vitro refolding，and characterization of the refolded form.BiosciBiotechnol Biochem.2000，64：1263-70.)，并且优化后，在重组菌中谷氨酰胺转胺酶基因表达量占全菌蛋白的43％，明显高于天然基因29％的表达率。本发明为高效、大量、低成本生产谷氨酰胺转胺酶提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

生物材料说明：

本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Branden-MTG-001已于2011年11月30日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5497。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为PCR扩增的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为阳性克隆质粒的Nde I和Xho I双酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为经IPTG诱导前、后的三种重组菌的全菌蛋白的15％SDS-PAGE检测结果

图4为本发明重组菌MTG/Rosetta(DE3)与天然基因重组菌15％SDS-PAGE检测结果

图5为经纯化的重组茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的15％SDS-PAGE检测结果

图6为SP-Sepharose FF离子交换层析纯化复性后的MTG

图7为检测重组茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶对牛血清白蛋白交联作用的实验结果

图8为重组菌MTG/Rosetta(DE3)的菌体生长曲线

图9为重组菌MTG/Rosetta(DE3)的高密度发酵产物的15％SDS-PAGE检测结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实验材料：

大肠肝菌BL21(DE3)PLysS、Rosetta(DE3)和质粒pET-22b购自Novagen公司；限制性内切酶Nde I、Xho I和T4 DNA连接酶购自大连TaKaRa公司、高保真Pfu聚合酶购自上海生工；质粒少量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司；引物合成及DNA测序工作均由上海博亚公司完成；SP-Sepharose购自Amersham公司；蛋白分子量标准购自Gibco公司；IPTG、尿素、EDTA等其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

实施例1、茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的获得

一、茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的专用表达工程菌的构建

1、经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的克隆

根据本发明所列序列1设计引物，引物序列如下：

P1(正向引物)：5’-TCGCACTTCTTCCCGCCTCC-3’；

P2(反向引物)：5’-TCCCGCTGCTCCTCGGTCAT-3’。

以1μg茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的基因组DNA为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增经优化的谷氨酰胺转胺酶基因(所克隆的茂原链轮丝菌的谷氨酰胺转胺酶基因序列1G+C含量为66.66％，并含有大量的稀有密码子，其中AGA和AGG占编码精基酸密码子中的37.8％(11/29)，表明谷氨酰胺转胺酶的合成需要带有稀有密码子的tRNA^arg(AGG/AGA)。)。100μl PCR反应体系为：

10×扩增缓冲液          10ul，

4种dNTP混合物           各200umol/L，

引物                    各10-100pmol，

模板DNA                 0.1-2ug，

Taq DNA聚合酶           2.5u，

Mg²⁺                    1.5mmol/L，

加双蒸水或三蒸水至      100ul。

反应条件为：首先94℃5min；然后94℃50s，58℃1.5min，72℃2min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道Marker为DNA Marker(bp)，泳道MTG为PCR扩增产物)，结果PCR扩增出了993bp的DNA片段，与预期结果相符。

2、含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的大肠杆菌表达载体的构建

用凝胶回收试剂盒回收并纯化步骤1用PCR方法扩增的993bp的DNA片段，对其用限制性内切酶Nde I、Xho I双酶切后，与经同样酶双酶切的载体pET-22b用T4DNA连接起来，16℃反应16h后，将连接产物转化大肠肝菌DH5α感受态细胞，经筛选后挑选阳性克隆，提质粒用限制性内切酶Nde I、Xho I进行双酶切分析验证，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道1为DNA Marker(bp)，泳道2为pET-MTG/Nde I+Xho I)，结果获得了993bp的酶切片段，表明目的片段正确地克隆入载体pET-22b中。然后对经酶切鉴定正确的阳性克隆质粒进行DNA测序鉴定，测序结果表明插入DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，与已知的MTG基因(GenBank号：AF531437)的核苷酸序列相比，自5’端第583位碱基由c突变为g，第586位碱基由a突变为c，第589位碱基由c突变为g。，编码序列表中序列2所示的氨基酸残基序列，表明构建的含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的大肠杆菌表达载体正确，将其命名为pET-MTG。

3、转化

将步骤2构建的含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的大肠杆菌表达载体pET-MTG分别转化大肠肝菌Rosetta(DE3)、BL21(DE3)PlysS和E.coli BL21(DE3)菌株，后两种菌株为对照，得到茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的专用表达工程菌。将上述三种重组菌分别命名为MTG/Rosetta(DE3)、MTG/BL21(DE3)PlysS和MTG/BL21(DE3)。

本领域技术人员按以上步骤操作，均能够获得茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的专用表达工程菌MTG/Rosetta(DE3)，该重组菌具有高度可重复性。重组菌的构建方法见非专利文献Francois Baneyx.Recombinant protein expression in Escherichiacoli.Current Opinion in Biotechnology.1999.10：411-421.，申请人承诺公众可从申请人处获得该重组菌MTG/Rosetta(DE3)。

二、MTG在大肠肝菌中的表达、包涵体的变性、复性及MTG的纯化

挑取步骤一获得的重组菌MTG/BL21(DE3)的单菌落，将其接种于含50mg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，将后两种重组菌MTG/Rosetta(DE3)和MTG/BL21(DE3)PlysS的单菌落分别接种于含有50mg/mL氨卞青霉素和30mg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，37℃诱导3小时。诱导结束后，对经IPTG诱导前、后的三种重组菌的全菌蛋白进行15％SDS-PAGE检测，检测结果如图3所示(泳道1、Molecular weight marker(KD)，泳道2-4IPTG诱导前：泳道2、E.coli BL 21(DE3)，泳道3、E.coli BL 21(DE3)PlysS，泳道4、E.coli Rosetta(DE3)；泳道5-7：IPTG诱导后：泳道5、E.coliBL21(DE3)，泳道6、E.coli BL21(DE3)PlysS，泳道7、E.coli Rosetta(D3E))，只有经IPTG诱导的MTG/Rosetta(DE3)出现分子量为36kDa的外源蛋白表达带，与MTG的分子量一致，表明茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因大肠杆菌中获得表达，而MTG/BL21(DE3)PlysS、MTG/BL21(DE3)以及未经IPTG诱导的重组菌株均未出现外源蛋白表达带。

选取含有表达基因的工程菌MTG/Rosetta(DE3)以及天然表达基因的工程菌，接入含有50mg/mL氨卞青霉素和30mg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，37℃诱导3小时。诱导结束后，对含表达序列1的工程菌MTG/Rosetta(DE3)以及天然表达基因的工程菌的全菌蛋白进行15％SDS-PAGE检测。检测结果如图4所示(泳道1、分子量标准(KD)，泳道2、表达序列1的工程菌MTG/Rosetta(DE3)，泳道3、天然表达基因的工程菌)，经计算，含经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的菌株蛋白表达量占全菌蛋白的43％，明显高于含天然基因菌株的表达率29％。

离心收集经IPTG诱导的MTG/Rosetta(DE3)菌体，得到湿菌体6.3g/L培养基。用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA)缓冲液重悬菌体，在低温下匀浆破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，将沉淀部分(包涵体)用含有TritonX-100的pH 8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％TritonX-100)缓冲液洗涤三次，然后再用适量的pH 8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液处理三次，得到纯化的包涵体，湿重0.62g。然后将纯化的包涵体(蛋白浓度约为20mg/mL)溶于pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，100mmol/L

β-巯基乙醇)缓冲液中进行变性，室温搅拌过夜，离心去除沉淀后，将上清液用pH8.0的50mmol/L Tri s-HCl(0.3mmol/L GSSG、3mmol/L GSH、1mmol/L DTT、2mmol/L尿素、50mmol/L甘氨酸、0.05％TritonX-100)缓冲液稀释50倍，4℃搅拌过夜，导致包涵体复性。用0.5mol/L的醋酸调pH值至6.0，离心去除沉淀。最后将复性产物上SP-Sepharose强阳离子交换柱层析纯化，用20mmol、pH6.0的乙酸缓冲液洗去未结合的成分，再用含0.5M NaCl的20mmol、pH6.0的乙酸缓冲液溶液洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，获得MTG蛋白117.4mg。将浓缩获得的重组MTG蛋白样品进行15％SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示(泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为包涵体，泳道3为为经纯化的重组MTG蛋白)，SP-Sepharose FF离子交换层析纯化复性后的MTG如图6所示(Sample(1)：Refolded MTG in Ac-OH，EluentA(2)：Ac-OH+20mmol/LNaCl，EluentB(3)：Ac-OH+500mmol/L NaCl)，表明获得了高纯度的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。将上述转化有含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pET-MTG的大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)的菌株(即MTG/Rosetta(DE3))命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coil)Branden-MTG-001，该菌株已于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5497。

实施例2、茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的活性测定和对牛血清白蛋白(BSA)的交联作用

一、茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的活性测定

用比色法测定实施例1表达并纯化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的活性(Pasternack R，Dorsch S，Otterbach J，Robenek Is，et al.Bacterialpro-transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense.Purification，characterization and sequence of the zymogen.Eur J Biochem，1998.257：570-576)。一个MTG的酶活单位为：37℃时，催化底物CBZ-Gln-Gly生成1μmol L-谷氨酰γ-单异羟基肟酸。L-谷氨酰γ-单异羟基肟酸在波长520nm处有吸收峰，结果所表达的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的比活为21.6u/mg，与文献报道的天然酶活性(天然酶的比活为23u/mg)相比，重组MTG的比活稍低(Kikuchi Y，Date M，Yokoyama K，Umezawa Y，Matsui H.Secretion of active-form Streptoverticilliummobaraense transglutaminase by Corynebacterium glutamicum：processing of thepro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-Like protease fromStreptomyces albogriseolus.Appl Environ.Microbiol，2003，69：358-66.).

二、检测茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶对牛血清白蛋白(BSA)的交联作用

将BSA溶解于含2mmol DTT的磷酸缓冲液-生理盐水(PBS)中，使蛋白浓度为1mg/mL，反应总体积为1mL，先在50℃保温10min，然后加入1u实施例1表达并纯化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶，37℃保温，对照组为未加入重组MTG的反应体系，于10、20、30和60min取样进行15％SDS-PAGE，检测BSA交联情况。

结果如图7所示，BSA在用DTT处理后未出现沉淀，结果未用MTG组无明显的多聚体出现(泳道1、6-10)；重组MTG处理组(泳道2-5)形成了分子量更大的多聚体，由于分子量太大，多聚体未能进入浓缩胶(浓缩胶的孔径比分离胶小)而附着于上样孔浓缩胶表面，表明茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶对牛血清白蛋白具有较强的交联作用。

实施例3、高密度发酵及表达

将表达高纯度的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的重组菌MTG/Rosetta(DE3)进行高密度发酵。重组菌体生长的OD值曲线如图8所示(PO₂：溶解氧.OD：细胞密度.Hour：发酵时间(小时))，表明OD值在接种2小时开始上升，3小时后上升速度加快，26小时后上升速度减慢，此时的OD值为56。溶氧曲线显示：接种4h后溶氧开始下降，6小时后直线下降。8h后溶氧下降到28％，同时碱泵间歇运转，表明细菌在产酸，约在10小时，溶氧开始上升，说明发酵罐里养料逐渐消耗，在15h时开始补料，补料过程中，通过补料速度控制发酵液中的溶氧，使其保持在20％以上(范围在20％-35％)。待菌体密度的OD值达64-70时，停止补料半小时，让葡萄糖充分耗尽后，进行IPTG诱导。IPTG诱导后MTG表达逐渐增高，在3小时达到最高，4小时后表达量下降(如图9所示，泳道1.Marker，泳道2.IPTG诱导前，泳道3-6.IPTG诱导后1h、2h、3h、4h.)。在诱导3小时时，表达带与它相近的一条带已融合起来，无法判断MTG占全菌蛋白的百分含量。在随后的高密度发酵中，确定诱导时间为3小时，离心得湿菌体116g/L培养基。按上述方法分离纯化包涵体，并进行复性纯化，共获得MTG蛋白2.3g。

以上描述可以总结出本发明的突出特点：

1、pET22b为分泌型表达载体，含有pelB信号肽的编码序列，本发明使用NdeI酶切祛除该序列，因此，表达产物不含信号肽。当外源目的基因在大肠杆菌表达时，由于密码子的偏爱性不同，会因为缺乏某种和几种tRNA，直接导致翻译中止或错误。而本发明所用专用重组菌Rosetta(DE3)是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的外源蛋白表达的菌株，故使MTG实现了表达。当对茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因优化后，更改了起始密码子下游序列，使局部二级结构的自由能满足高表达要求，使表达率得到明显提高。本发明序列1的表达量占全菌蛋白的43％，明显高于天然基因29％的表达率。通过上述方式本发明使MTG实现了高效表达。

2、在包涵体复性过程中，本发明使用了稀释复性，迅速调节pH值至4.0，该技术简单且容易放大，适合工业化生产。本发明在包涵体纯化复性过程中添加Triton及其尿素，使复性率提高了40％。使用高密度发酵方法，每升培养基获得116g湿菌体，获得了近2.3g的纯酶，远高于目前报道的最高的表达水平(132mg/每升培养基)，同时也高于天然基因重组菌(每升培养基获得105g湿菌体，获得了近1.85g的纯酶)。活性试验表明：与文献报道天然酶活性相比，本发明重组MTG的比活几乎相同(重组MTG的比活为21.5u/mg，天然酶的比活为23u/mg)。

总之，本发明实现了MTG的原核高效表达，并建立了高密度发酵工艺和简便有效的包涵体复性方法，为进一步利用大肠杆菌工业化生产更廉价的微生物转谷氨酰胺酶提供了保证。

Claims (8)

1.可提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的工程菌，是将含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的；所述经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：用于构建所述含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体的出发载体为pET-22b，以pET-22b为出发载体，构建的含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体为pET-MTG。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：转化含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pET-MTG的大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)的菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Branden-MTG-001 CGMCC No.5497。

4.一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法，是发酵权利要求1或2或3所述茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的工程菌，表达的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶以包涵体的形式存在于菌体细胞中，收集包涵体，对其进行纯化、变性、复性、离子交换层析和真空冷冻干燥后得到茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵上述工程菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.6-1.2mmol/L，优选为0.8mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对包涵体进行纯化包括以下步骤：将所得菌体用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA)缓冲液重悬，在低温下匀浆破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，将沉淀部分(包涵体)用含有TritonX-100的pH 8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％TritonX-100)缓冲液洗涤三次，然后再用适量的pH 8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液处理三次。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对包涵体进行变性、复性包括以下步骤：将经洗涤纯化的包涵体(蛋白浓度约为20mg/mL)溶于pH8.0的20mmol/LTris-HCl(0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，100mmol/L β-巯基乙醇)缓冲液中进行变性，室温搅拌过夜，离心去除沉淀后，将上清液用pH8.0的50mmol/L Tris-HCl(0.3mmol/L GSSG、3mmol/L GSH、1mmol/L的DTT、2mmol/L的尿素、50mmol/L甘氨酸、0.05％的TritonX-100)缓冲液稀释50倍，4℃搅拌过夜，导致包涵体复性。用0.5mol/L的醋酸调pH值至6.0，离心去除沉淀。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对复性产物进行纯化的方法为强阳离子交换层析法。

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