CN1253177A

CN1253177A - 生产微生物转谷氨酰胺酶的方法

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Publication number: CN1253177A
Application number: CN98103375.XA
Authority: CN
Inventors: 横山敬一; 中村奈已; 三轮哲也; 脊黑胜也
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-07-04
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2000-05-17
Anticipated expiration: 2018-07-03
Also published as: DK0889133T3; BR9802403A; CA2237041A1; CN1151252C; EP0889133B1; DE69822251T2; US6538122B1; EP0889133A3; DE69822251D1; EP0889133A2; US6013498A

Abstract

公开了具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质,它包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基范围内的序列,其中蛋白质的N－末端氨基酸对应于SEQIDNo.1的第二位的丝氨酸残基,公开了编码该蛋白质的DNA,具有该DNA的转化体,和用于生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法,该方法包括在培养基中培养转化体的步骤,利用例如大肠杆菌的宿主的转化体能够大量地生产所述的蛋白质。

Description

生产微生物转谷氨酰胺酶的方法

本发明涉及具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，编码该蛋白质的DNA，和生产该蛋白质的方法。具体地说，本发明涉及采用遗传工程技术生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法。

转谷氨酰胺酶是催化蛋白质的肽链的γ-羧酰氨基基团的酰基转移反应的一种酶。当所述酶与蛋白质反应时，通过谷氨酸的脱酰氨基发生了形成ε-(γ-谷氨酸)-赖氨酸的反应或发生了谷氨酸替代谷氨酰胺的反应。

转谷氨酰胺酶被用于生产胶化的食物例如果冻，酸奶，奶酪，胶状化妆品等等，也可用于改善肉类的品质[参见用于相反目的的日本专利公开(下文中称作为“日本特许公告公报”)No.平1-50382]。转谷氨酰胺酶也可用于生产用作具有高热稳定性的微胶囊的材料和用于固定化酶的载体。因此，转谷氨酰胺酶在工业上是非常有用的。

就转谷氨酰胺酶而言，来源于动物的转谷氨酰胺酶和来源于微生物(微生物转谷氨酰胺酶；下文中称作为“MTG”)的转谷氨酰胺酶至今已是已知的。来源于动物的转谷氨酰胺酶是依赖于钙离子的酶，该酶分布于动物的器官，皮肤和血液。例如它们是豚鼠肝转谷氨酰胺酶(K.Ikura等人，生物化学27，2898(1988))，人表皮角蛋白细胞转谷氨酰胺酶[M.A.Philips等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990)]和人血液凝固因子XIII(A.Ichinose等人，生物化学25，6900(1990))。

就来源于微生物的转谷氨酰胺酶而言，不依赖于钙的这些酶是从链轮丝菌属的微生物获得的。例如它们是灰肉色链轮丝菌IFO12776，肉桂色链轮丝菌肉桂亚种IFO12852和Streptoverticillium(链轮丝菌)mobaraense IFO 13819[参见日本专利未审查公开(本申请下文中称作为“日本特许公开公报”)No.昭和64-27471]。

根据肽绘图和基因结构分析结果，发现由微生物产生的转谷氨酰胺酶的一级结构与来源于动物的转谷氨酰胺酶完全不同源(欧洲专利公开No.0481504A1)。

由于来源于微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)是通过培养上面描述的微生物，随后纯化产生的，它们在供应量，效率等等方面都存在问题。还试图通过遗传工程技术生产这些酶。该技术包括通过微生物例如大肠杆菌，酵母等等的分泌表达进行的方法(日本特许公开公报平5-199883)，包括其中以大肠杆菌中的失活的融合蛋白质包含体的形式表达MTG的方法，所述包含体溶解于蛋白质变性剂，去除所述变性剂，然后使MTG再活化以获得活性的MTG(日本特许公开公报平6-30771)。

但是，当以工业规模实际操作时这些方法产生了问题。即，当使用微生物例如大肠杆菌和酵母分泌时，生产的量是非常小的；和当获得大肠杆菌中的失活的融合蛋白质包含体的形式的MTG时，需要用于裂解的酶是昂贵的。

已知当采用遗传工程方法分泌外源蛋白质时，由此获得的酶的量通常是小的。相反，还已知当外源蛋白质在大肠杆菌细胞中产生时，在许多情况下产物是惰性蛋白质包含体的形式，虽然表达量是高的。蛋白质包含体必须是溶解于变性剂，必须去除变性剂，然后必须使MTG再活化。

已经已知在大肠杆菌中表达时，可用甲硫氨酸氨基肽酶有效地裂解在基因转译后获得的天然蛋白质中的N-末端甲硫氨酸残基。但是，在外源蛋白质中不总是裂解N-末端甲硫氨酸残基。

至今建议的用于获得没有N-末端甲硫氨酸残基的蛋白质的方法包括化学方法，其中产生了在N-末端具有甲硫氨酸残基的蛋白质或具有借助于甲硫氨酸残基加到其上的肽的融合蛋白，然后在甲硫氨酸残基的位置用溴化氰特异性地分解产物；酶解方法，其中在合适的肽和预期的肽之间插入一种位点特异性蛋白酶的识别序列以获得融合肽，用该酶进行位点特异性水解。

但是，当蛋白质序列含有甲硫氨酸残基，预期的蛋白质可能在反应过程中发生变性时，不能使用前一方法。当易于裂解的序列包含于蛋白质序列时，后一方法不能使用，因为预期蛋白质的产量被降低。另外，从考虑成本的观点，这样的蛋白酶的使用不适于以工业规模生产蛋白质。

用于生产MTG的常规的方法有许多问题例如供应量和成本。即，由大肠杆菌，酵母等等进行分泌表达时，不利的是，表达量非常低。在大肠杆菌的融合蛋白质的包含体中生产时，为了获得成熟的MTG，在表达后，用限制性蛋白酶裂解融合部分是必要的。再者，已经发现，由于MTG不依赖于钙，活性MTG在微生物细胞中的表达是致命的，因为该酶作用于内蛋白。

因此，对于以工业规模，由基因重组生产的MTG的利用，要求生产增加没有融合部分的成熟MTG。本发明完成了该目的。本发明的目的之一是大规模地在微生物例如大肠杆菌中生产MTG。

当用本发明的重组DNA表达MTG时，在MTG的N-末端加上甲硫氨酸残基。但是，通过将甲硫氨酸残基加到MTG的N-末端，可能会出现一些问题，其中出现了安全性问题例如给予了MTG免疫原性。由本发明解决的另一个问题是产生没有相应于起始密码子的甲硫氨酸残基的MTG。

本发明的一个目的是提供了具有转谷氨酰胺酶活性的新的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供了编码具有转谷氨酰胺酶活性的新的蛋白质的DNA。

本发明的另一个目的是提供了编码具有转谷氨酰胺酶活性的新的蛋白质的重组DNA。

本发明的另一个目的是提供了通过由重组DNA转化获得的转化体。

本发明的另一个目的是提供了用于生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法。

根据下面的说明书和实施例，本发明的这些和其它目的是显而易见的。

为了解决上述问题，本发明人通过将密码子改变为适用于大肠杆菌的密码子，或优选的是通过利用多拷贝载体(pUC19)和强启动子(trp启动子)，已经构建了具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的大规模的表达系统。

由于从放线菌微生物表达和分泌前原形式的MTG，MTG在N-末端没有对应于起始密码子的甲硫氨酸残基，但是由上面描述的表达方法表达的蛋白质在N-末端有甲硫氨酸残基。为了解决该问题，本发明人已经对大肠杆菌的甲硫氨酸氨基肽酶的底物特异性产生兴趣，并且通过表达没有天冬氨酸残基形式的蛋白质，成功地获得了具有转谷氨酰胺酶活性和在N-末端没有甲硫氨酸残基的蛋白质，其中所述天冬氨酸残基是MTG的N-末端氨基酸。由此，完成了本发明。

就是说，本发明提供了具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，所述蛋白质包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的序列，其中该蛋白质的N-末端氨基酸对应于SEQ ID No.1的第二位的丝氨酸残基。

提供了由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的氨基酸序列组成的蛋白质。

提供了编码所述蛋白质的DNA。

提供了具有所述DNA的重组DNA，特别是表达所述DNA的重组DNA。

提供了通过用重组DNA转化获得的重组体。

提供了用于生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法，该方法包括在培养基中培养转化体以生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质以及回收该蛋白质的步骤。

考虑到甲硫氨酸氨基肽酶的底物特异性，用于生产具有转谷氨酰胺酶活性和没有起始甲硫氨酸的蛋白质的方法不限于去除N-末端天冬氨酸。

附图简述

附图1显示了MTG表达质粒pTRPMTG-01的构建方案。

附图2显示了MTG表达质粒pTRPMTG-02的构建方案。

附图3是显示MTG被表达的SDS-聚丙烯酰胺电泳的扩展图。

附图4显示MTG表达质粒pTRPMTG-00的构建方案。

附图5显示质粒pUCN216D的构建方案。

附图6显示MTG表达质粒pUCTRPMTG(+)D2的构建方案。

附图7显示对应于天冬氨酸残基的GAT被缺失。

附图8显示N-末端的氨基酸是丝氨酸。

根据本发明的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质包括作为必要序列的由SEQID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的序列，但是该蛋白质在第331位的脯氨酸残基之后进一步具有一个氨基酸或几个氨基酸。其中，优选的是由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的序列组成的蛋白质。

在这些氨基酸序列中，本发明包括其中一个氨基酸或几个氨基酸被缺失，替代或插入的氨基酸序列，只要所述氨基酸序列具有转谷氨酰胺酶活性。

本发明的DNA编码上面提到的蛋白质。其中，优选的是其中编码从N-末端氨基酸计数第四位的Arg的碱基序列是CGT或CGC，编码从N-末端氨基酸计数第五位的Val的碱基序列是GTT或GAT的DNA。此外，优选的是其中编码N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之间的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的碱基序列具有下列序列的DNA。

Ser：TCT或TCC

Asp：GAC或GAT

Arg：CGT或CGC

Val：GTT或GTA在这种情况下，优选的是其中编码N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之间的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的碱基序列具有序列TCT-GAC-GAT-CGT-GTT的DNA。

此外，优选的是其中编码N-末端开始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之间的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的碱基序列具有下列序列的DNA。

Thr：ACT或ACC

Pro：CCA或CCG

Ala：GCT或GCA

此外，优选的是包括由SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基之间的序列的DNA。在这种情况下，更优选的是由SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基之间的序列组成的DNA。

对于上面提到的DNA序列，可以缺失，替代或插入编码一个氨基酸或几个氨基酸的核酸，只要所述DNA编码具有转谷氨酰胺酶活性的氨基酸序列。

本发明的重组DNA具有上面提到的DNA之一。在这种情况下，优选的是具有选自于下列组：trp，tac，lac，trc，λPL和T7的启动子的DNA。

通过用上面提到的重组DNA转化获得了本发明的转化体。其中优选的是通过利用多拷贝载体进行转化，以及转化体属于大肠杆菌。

用于生产本发明的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法包括在培养基中培养上面提到的转化体之一以生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质以及回收该蛋白质的步骤。

对本发明进一步作详细说明。

(1)已知MTG在微生物细胞中的表达是致命的。还已知在微生物例如大肠杆菌中高效率地表达该蛋白质时，所表达的蛋白质倾向于是惰性不溶性的蛋白质包含体的形式。在这样的情况下，本发明人对在大肠杆菌中获得高效率地表达惰性不溶性的蛋白质包含体的形式的MTG的目的进行了研究。

用于获得高表达的MTG的结构基因是含有SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基之间的序列的DNA。考虑到遗传密码的简并性，在编码N-末端部分的区域的简并密码子的第三个字母被转变为富含腺嘌呤和尿嘧啶的密码子，其余部分由常用于大肠杆菌的密码子组成以便抑制mRNA的高级结构的形成，虽然这样的编码具有相似的氨基酸序列的蛋白质的DNA可以具有不同的碱基序列。

通常用于生产外源蛋白质的强启动子可用于表达MTG结构基因，和将终止子插入到MTG结构基因的下游。例如，启动子是trp，tac，lac，trc，λPL和T7，和终止子是trpA，lpp和T4。

为了高效地转译，使SD序列的种类和数量，SD序列和起始密码子之间区域的碱基的组成，序列和长度最佳化以表达MTG。

位于启动子和终止子之间的区域是表达MTG必不可少的，通过已知的化学合成方法可生产该区域。所述碱基序列的一个例子显示于SEQ ID No.3。对于序列号为3的氨基酸序列，起始密码子后跟随天冬氨酸残基。但是，按照如下描述，优选的是去除该天冬氨酸残基。

本发明还提供了可用于表达MTG的重组DNA。

通过将含有上面描述的MTG的结构基因的DNA插入到已知的表达载体中能够生产重组DNA，所述载体的选择依赖于所需的表达系统。本文使用的表达载体优选的是多拷贝载体。

可用于生产本发明的重组DNA的已知表达载体包括pUC19和pHSG299。通过将本发明的DNA整合到pUC19获得的本发明的重组DNA的一个例子是pUCTRPMTG-02(+)。

本发明还涉及通过导入重组DNA获得的各种转化体。

能够形成转化体的细胞包括大肠杆菌等等。

大肠杆菌的一个例子是菌株JM109(recA1，endA1，gyrA96，thi，hsdR17，supE44，relA1，Δ(lac-proAB)/F[traD36，proAB+，lacIq，lacZ ΔM15])。

通过培养转化体例如通过用本发明的一种载体pUCTRPMTG-02(+)转化大肠杆菌JM109获得的转化体生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。

用于生产的培养基的例子包括用于下面给出的实施例中的2xYT培养基，通常用于培养大肠杆菌的培养基例如LB培养基和M9酪氨酸培养基。

根据载体，启动子，宿主等等的种类适当地选择培养条件和诱导生产条件。例如，为了用trp启动子生产重组产物，可以利用化学药剂例如3-β-吲哚丙烯酸高效地操纵启动子。如果必要的话，在培养过程中可以加入葡萄糖，酪氨酸等等。此外，还可以加入抗化学药剂(氨苄霉素)的保持于质粒的基因(对化学药剂有抗性)以便选择性地繁殖重组大肠杆菌。

按如下所述从培养菌株中提取具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，所述蛋白质是通过上面描述的方法生产的。在培养完成之后，收集细胞，并且悬浮于缓冲溶液中。在用溶菌酶，冷冻/溶解，超声分裂等等处理之后，将由此获得的破碎细胞的悬浮液离心以分离为上清液和沉淀。

具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质以蛋白质包含体的形式获得并且包含于沉淀中。将该蛋白质用变性剂等等溶解，去除变性剂，分离和纯化该蛋白质。可用于溶解如上所述产生的蛋白质包含体的变性剂的例子包括脲(例如8M)和盐酸胍(例如6M)。在通过透析等等去除变性剂后，使具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质再生。用于透析的溶液是一种磷酸缓冲液，tris盐酸缓冲液等等。不仅可通过透析，而且可通过稀释，超滤等等去除变性剂。采用任何这些技术可预期活性的再生。

在活性再生之后，通过适当地将已知的分离和沉淀方法例如盐析，透析，超滤，凝胶过滤，SDS-聚丙烯酰胺电泳，离子交换层析，亲和层析，反相高效液相层析和等电点电泳结合可以分离和纯化活性蛋白质。

(2)本发明提供了具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，它具有从SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的序列。

通过对用具有SEQ ID No.3表示的DNA的重组DNA转化的产物生产的MTG的N-末端进行分析，发现其中大多数含有起始密码子的(甲酰)甲硫氨酸残基。

但是，当编码外源蛋白的一个基因在大肠杆菌中表达时，将该基因设计为所需的蛋白质定位于由ATG编码的甲硫氨酸残基之后，ATG是该基因的转译起始信号。已经已知用甲硫氨酸氨基肽酶可以更有效地裂解从基因转译获得的天然蛋白质的N-末端的甲硫氨酸残基。但是，不总是在外源蛋白质中的N-末端的甲硫氨酸残基被裂解。

已知甲硫氨酸氨基肽酶的底物特异性随着定位于邻接甲硫氨酸残基的氨基酸残基的种类而变化。当定位于邻接甲硫氨酸残基的氨基酸残基是丙氨酸残基，甘氨酸残基，丝氨酸残基等等时，甲硫氨酸残基易于被裂解，当前者是天冬氨酸，天冬酰胺，赖氨酸，精氨酸，亮氨酸等等时，后者难于被裂解(自然，326,315(1987))。

MTG的N-末端的氨基酸残基是天冬氨酸残基。当来源于起始密码子的甲硫氨酸残基直接定位于天冬氨酸残基之前时，甲硫氨酸氨基肽酶难于作用于获得的序列，通常不是去除而是保留N-末端的甲硫氨酸残基。但是，由于在MTG中丝氨酸残基被安排于邻接N-末端的天冬氨酸，可以将该序列设计为通过使天冬氨酸残基缺失，定位于邻接来源于起始密码子的甲硫氨酸残基的氨基酸残基是丝氨酸残基(甲硫氨酸氨基肽酶易于作用的一种氨基酸残基)。因此，可以高效地生产具有高转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，从该蛋白质裂解了N-末端的甲硫氨酸残基。

由此获得的重组蛋白质比天然的MTG短一个氨基酸残基，但是该蛋白质的功能与天然MTG相类似。即，通过缺失一个氨基酸没有失去MTG活性。虽然，没有从其上裂解N-末端的甲硫氨酸残基的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质可能获得了新的免疫原性，但是通常会明白缩短了几个残基的序列不会获得天然MTG没有的新的免疫原性。因此，安全性没有问题。

事实上，通过从来源于微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)缺失N-末端天冬氨酸残基设计序列Met-Ser-Asp-Asp-Arg-……，该序列可以在大肠杆菌中产生。结果是，有效地去除甲硫氨酸残基，从而获得了具有Ser-Asp-Asp-Arg-……序列的蛋白质。证实由此获得的蛋白质的比活性不同于天然的MTG。

下文将描述用于生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法，所述蛋白质具有SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基范围内的序列。

就是说，以编码具有转谷氨酰胺酶活性和具有SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基范围内的序列蛋白质的DNA用作为存在于适用于表达MTG的重组DNA的MTG结构基因。具体地说，使用具有SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基范围内的序列的DNA。

通过普通的DNA重组技术或特异性的定位诱变技术，其中对MTG基因的整个或部分长度使用PCR的技术，或其中通过限制性酶处理用合成的DNA片段交换待改变的序列的一部分的技术，可以改变N-末端的序列。

在培养基中培养由此用重组DNA转化获得的转化体以生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，并且回收所述蛋白质。用于制备转化体和用于生产蛋白质的方法相同于上面描述的方法。

由于由此生产的蛋白质具有Met-Ser-.....的序列，用甲硫氨酸氨基肽酶易于从该蛋白质上裂解甲硫氨酸残基，因此在大肠杆菌细胞中裂解了甲硫氨酸残基以获得以丝氨酸残基起始的蛋白质。

虽然，自然界中不存在具有N-末端甲硫氨酸残基的蛋白质，本发明人已经发现，在某些天然MTG中，缺失了天冬氨酸残基从而具有N-末端丝氨酸。虽然具有N-末端甲硫氨酸残基的蛋白质因此不同于天然MTG的序列，但是具有N-末端丝氨酸残基的蛋白质包含于天然的MTG的序列中，另外，具有这样的序列的蛋白质实际上存在于自然界。因此，可以说，这样的MTG相等于天然的MTG。就是说，在被用作为食品的酶，例如MTG的生产中，其中蛋白质的抗原性是严重的问题，生产具有转谷氨酰胺酶活性和也具有相等于天然MTG的序列的蛋白质是重要的，或换句话说，生产切除了N-末端的甲硫氨酸残基的序列是重要的。

下面的实施例将进一步描述本发明，它决不限制本发明。

实施例

在大肠杆菌中大量生产MTG

(1)MTG表达质粒pTRPMTG-01的构建

在考虑大肠杆菌和酵母使用的密码子的频率的情况下，已经完全地合成了MTG基因(日本特许公开公报平5-199883)。但是，该基因序列对于在大肠杆菌中表达不是最佳的。就是说，所有的三十个精氨酸残基的密码子是AGA(最小密码子)。在这些条件下，重新合成了MTG基因的N-末端的约200个碱基以变为最适用于大肠杆菌表达的序列。

对于转录MTG基因的启动子，使用能够在缺少色氨酸的培养基中容易地启动转录的trp启动子。用trp启动子获得用于高效表达Pagrus major的转谷氨酰胺酶(TG)基因的质粒pTTG2-22(日本特许公开公报No.平6-225775)。将位于Pagrus major的TG基因的上游的序列设计为在大肠杆菌中高效地表达外源蛋白质。

对于pTRPMTG-01的构建，用合成DNA基因的ClaI/HpaI片段和pGEM15BTG(日本特许公开公报平6-30771)的HpaI/BamHI片段(小)替代从trp启动子的下游的ClaI位点到Pagrus major的TG表达质粒pTTG2-22(日本特许公开公报平6-225775)的下游的BglII位点之间的DNA片段。

合成DNA基因的ClaI/HpaI片段具有从pTTG2-22的trp启动子的下游的ClaI位点到转译起始密码子之间的序列，和来自MTG基因的N-末端的216个碱基。MTG结构基因的碱基序列由在大肠杆菌的使用密码子的频率决定的，以便在大肠杆菌中进行最佳表达。但是，为了避免mRNA的高级结构，将编码N-末端部分的区域的简并密码子的第三个字母转变为富含腺嘌呤和尿嘧啶的密码子以便尽可能地避免排列为相同的碱基。

这样设计合成DNA基因的ClaI/HpaI片段是便于其在末端具有EcoRI和HindIII位点。将所设计的基因划分为各含有约40-50个碱基的区段，以便+链和-链互相重叠。合成对应于各序列的12个DNA片段(SEQ ID Nos.4-15)。将合成的DNA的5’末端磷酸化。将这些序列与相配对的合成的DNA片段退火，它们互相连接。在聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，获取预期大小的DNA片段并且整合到pUC19的EcoRI/HindIII位点。确认该序列并且将正确的一个序列命名为pUCN216。从该pUCN216，获取ClaI/HpaI片段(小)并且用于构建pTRPMTG-01。

(2)MTG表达质粒pTRPMTG-02的构建

由于保持有pTRPMTG-01的大肠杆菌JM109没有高效表达MTG，将除了被改变的N-末端以外的MTG基因部分(777个碱基)进行改变以适用于大肠杆菌。由于在同时合成777个碱基是困难的，因此考虑大肠杆菌中密码子的使用频率来决定序列，然后合成其四个大区段(B1，2，3和4)，各包括约200个碱基。这样设计各个大区段便于在其末端具有EcoRI/HindIII位点。将所设计的基因划分为约40-50碱基的大区段，以便+链和-链互相重叠。合成与各个大区段具有相同序列的10个DNA片段，因此总共合成40个区段(SEQID Nos.16-55)。将合成的DNA的5’末端磷酸化。将这些序列与相配对的合成的DNA片段退火，它们互相连接。在聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，获取预期大小的DNA片段并且整合到pUC19的EcoRI/HindIII位点。确认其中各DNA的碱基序列并且将正确的序列命名为pUCB1和B2，B3和B4。如附图2所述，B1与B2连接，B3和B4连接。通过用其替代pTRPMTG-01的相应部分，构建了pTRPMTG-02。存在于pTRPMTG-02上的该高效表达MTG基因的序列显示于SEQ ID No.3。

(3)MTG表达质粒pUCTRPMTG-02(+)，(-)的构建：

由于保持有pTRPMTG-02的大肠杆菌JM109没有高效表达MTG，该质粒是多拷贝的。将含有pTRPMTG-02的trp启动子的Eco0109I片段(小)变为平齐末端，然后整合到pUC19的HincII位点，该质粒是多拷贝的。构建了其中lacZ启动子和trp启动子位于同方向的pUCTRPMTG-02(+)，其中两种启动子位于互相反方向的pUCTRPMTG-02(-)。

(4)MTG的表达：

通过在3毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中，37℃振荡10小时(预培养)培养用pUCTRPMTG-02(+)和pUC19转化的大肠杆菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中加入0.5毫升的培养悬浮液，在37℃振荡培养20小时。

从培养悬浮液收集细胞，通过超声分裂破碎。整个组分，通过离心获得的上清液和沉淀组分的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果显示于附图3。在pUCTRPMTG-02(+)/JM109细胞的整个组分和通过离心获得的沉淀组分中识别具有相当于MTG的分子量的蛋白质的高效表达。通过Western印迹分析证实了蛋白质与小鼠抗MTG的抗体的反应。该蛋白质的表达是500-600毫克/升。当生产培养基中没有加入3-β吲哚丙烯酸时，获得了足够的，高效的表达。

再者，用抗小鼠的MTG抗体进行Western印迹分析发现仅在通过离心获得的上清液组分中微量地表达了MTG，发现所表达的MTG实质上都是不溶性的蛋白质包含体形式。

(5)MTG表达质粒pTRPMTG-00的构建：

为了证明MTG基因密码子的改变导致表达显著地增加，构建了对应于pTRPMTG-02，但是其中MTG基因被改变为前面完整合成的基因序列(日本特许公开公报No.平6-30771)的pTRPMTG-00。

通过将来自于Pagrus major的TG表达质粒pTRPMTG-02的PvuII/PstI片段(小)与pGEM15BTG的PstI/HindIII片段(小，包括PvuII位点)和PvuII/HindIII片段(小)(日本特许公开公报平6-30771)连接构建了pTRPMTG-00。

(6)MTG表达质粒pUCTRPMTG-00(+)，(-)的构建：

pTRPMTG-00是多拷贝的。将含有pTRPMTG-00的trp启动子和trpA终止子的Eco0109I片段(小)变为平齐末端，然后整合到pUC19的HincII位点，该质粒是多拷贝的质粒。构建了其中lacZ启动子和trp启动子位于同方向的pUCTRPMTG-00(+)，其中两种启动子位于互相反方向的pUCTRPMTG-00(-)。

(7)MTG表达的比较：

通过在3毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中，37℃振荡10小时(预培养)培养用pUCTRPMTG-02(+)或(-)，pUCTRPMTG-00(+)或(-)，pTRPMTG-02，pTRPMTG-01，pTRPMTG-00或pUC19转化的大肠杆菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中加入0.5毫升的培养悬浮液，在37℃振荡培养20小时。

从培养悬浮液收集细胞，和测定其表达的MTG，获得的结果显示于表1。发现新构建的含有pTRPMTG-00，pUCTRPMTG-00(+)或(-)的大肠杆菌没有高效表达MTG。该结果表明为了高效地表达MTG，将MTG基因的密码子改变为大肠杆菌的密码子和也改变为多拷贝质粒是必要的。

表1菌株 MTG的表达pUCTRPMTG-02(+)/JM109 +++pUCTRPMTG-02(-)/JM109 +++pUCTRPMTG-00(+)/JM109 +pUCTRPMTG-00(-)/JM109 +pTRPMTG-02/JM109 +pTRPMTG-01/JM109 +pTRPMTG-00/JM109 -pUC19/JM109 -+++：至少300毫克/升

+：5毫克/升或更低

-：没有表达

(8)所表达的MTG的N-末端的氨基酸分析：

对所表达的MTG的蛋白质包含体的N-末端的氨基酸残基进行分析发现约60％的N-末端的序列是甲硫氨酸残基和约40％的N-末端序列是甲酰甲硫氨酸残基。通过下文描述的技术计划去除对应于起始密码子的(甲酰)甲硫氨酸残基。

(9)MTG的N-末端的天冬氨酸的缺失：

利用含有216碱基的pUCN216作为模板进行PCR缺失对应于天冬氨酸残基的碱基序列(MTG的N-末端)。pUCN216是通过在pUC19的EcoRI/HindIII位点克隆含有MTG的N-末端的ClaI-HpaI片段的约216碱基对获得的质粒。pF01(SEQ ID No.56)和pR01(SEQ ID No.57)是各含有载体中的序列的引物。pDELD(SEQ ID No.58)是通过缺失对应于Asp残基的碱基序列获得的质粒。pHd01(SEQ ID No.59)是通过用G替代C(不包括HindIII位点)获得的质粒。pF01和pDELD是有意义引物和pR01和pHd01是反意义引物。

对于pUCN216，结合使用pF01和pHd01，结合使用pDELD和pR01，以94℃，30秒，55℃，1分钟和72℃，2分钟进行PCR，共进行35个循环。用苯酚/氯仿提取各PCR产物，用乙醇沉淀，并且溶于100微升的水中。

各获取1微升的PCR产物，将它们混合在一起。在94℃加热10分钟变性之后，结合使用pF01和pHd01，以94℃，30秒，55℃，1分钟和72℃，2分钟进行PCR，共进行35个循环。

用苯酚/氯仿提取第二次PCR产物，用乙醇沉淀，用HindIII和EcoRI处理。在pUC19亚克隆之后，获得了pUCN216D(附图5)。证实获得的pUCN216D的序列是预期需要的。

(10)编码缺失N-末端天冬氨酸的MTG的质粒的构建：

将pUCN216D的Eco0109I/Hpal片段(小)与pUCB1-1的Eco0109I/Hpal片段(大)(通过在pUC19的EcoRI/HindIII位点克隆MTG基因的HpaII/BglII片段获得的质粒)结合获得了pUCB1-2D。此外，将pUCNB1-2D的ClaI/BglII片段(小)与pUCTRPMTG-02(+)的ClaI/BglII片段(大)结合获得了pUCTRPMTG(+)D2，该MTG表达质粒缺失了N-末端天冬氨酸，pUCTRPMTG-02(+)是高效MTG表达质粒(附图6)。结果是，获得了显示于附图7的含有缺失了对应于天冬氨酸残基的GAI的MTG基因的质粒。

(11)编码缺失N-末端天冬氨酸的MTG的质粒的表达：

通过在3毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中，37℃振荡10小时(预培养)培养用pUCTRPMTG(+)D2转化的大肠杆菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨苄青霉素的2xYT培养基中加入0.5毫升的培养悬浮液，在37℃振荡培养20小时。通过超声分裂破碎细胞。对由此获得的上清液和沉淀用考马斯亮蓝染料染色和用小鼠的抗MTG抗体进行Western印迹分析的结果表明在通过超声分裂破碎获得的沉淀即在不溶性的组分中检测到缺失了N-末端天冬氨酸残基的MTG蛋白质。该事实暗示缺失了N-末端天冬氨酸残基的MTG蛋白质以细胞中蛋白质包含体的形式积累。

对蛋白质包含体的N-末端氨基酸序列进行分析发现其中约90％是丝氨酸，如附图8所示。

在(8)和(11)中获得的所表达的MTG的N-末端氨基酸序列分析结果相互比较，结果如表2所示。发现通过从MTG缺失N-末端天冬氨酸残基，有效地去除了加入到所表达的MTG的N-末端的起始甲硫氨酸。

表2菌株 N-末端氨基酸

f-Met Met Asp SerpUCTRPMTG-02(+)/JM109 40％ 60％ N.D.pUCTRPMTG(+)D2/JM109 N.D. 10％ - 90％

(12)缺失了N-末端天冬氨酸残基的MTG包含体的溶解性，复性活性和比活性的测定：

通过重复离心几次部分纯化缺失了天冬氨酸的MTG包含体，然后溶解于8M脲[50mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)]获得了2毫克/毫升溶液。通过离心从溶液中去除沉淀，用50mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)将溶液稀释到0.5M脲的浓度。用50mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)进一步透析稀释的溶液以去除脲。根据MonoS柱测试，当氯化钠的浓度是在100-150mM范围内时洗脱具有TG活性的峰。采用异羟肟酸盐方法测定该组分的比活性发现缺失天冬氨酸残基的MTG的比活性约是30U/毫克。这相当于天然MTG的比活性。因此，显然缺失天冬氨酸残基对比活性没有影响。

序列表SEQ ID NO：1的资料：序列特征：

长度：331

类型：氨基酸

几何结构：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：1Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn

20 25 30Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu65 70 75 80Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu

115 120 125Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser

130 135 140Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala145 150 155 160Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg

180 185 190Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile225 230 235 240Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp

290 295 300Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

325 330SEQ ID NO：2的资料：序列特征：

长度：993

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性分子类型：其它核酸合成DNA特征

特征键：CDS

定位：1..993

识别方法：S序列描述：SEQ ID NO：2GAT TCT GAC GAT CGT GTT ACT CCA CCA GCT GAA CCA CTG GAT CGT ATG

48Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15CCA GAT CCA TAT CGT CCA TCT TAT GGT CGT GCT GAA ACT GTT GTT AAT

96Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn

20 25 30AAT TAT ATT CGT AAA TGG CAA CAA GTT TAT TCT CAT CGT GAT GGT CGT

144Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45AAA CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA CGT GAA TGG CTG TCT TAT GGT TGC

192Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT GGT CAG TAT CCG ACT AAC CGT CTG

240Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu65 70 75 80GCA TTC GCT GCC TTC GAT GAA GAT CGT TTC AAG AAC GAA CTG AAG AAC

288Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95GGT CGT CCG CGT TCT GGT GAA ACT CGT GCT GAA TTC GAA GGT CGT GTT

336Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110GCT AAG GAA TCC TTC GAT GAA GAG AAA GGC TTC CAG CGT GCT CGT GAA

384Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu

115 120 125GTT GCT TCT GTT ATG AAC CGT GCT CTA GAG AAC GCT CAT GAT GAA TCT

432Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser

130 135 140GCT TAC CTG GAT AAC CTG AAG AAG GAA CTG GCT AAC GGT AAC GAT GCT

480Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala145 150 155 160CTG CGT AAC GAA GAT GCT CGT TCT CCG TTC TAC TCT GCT CTG CGT AAC

528Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175ACT CCG TCC TTC AAA GAA CGT AAC GGT GGT AAC CAT GAT CCG TCT CGT

576Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg

180 185 190ATG AAA GCT GTT ATC TAC TCT AAA CAT TTC TGG TCT GGT CAG GAT AGA

624Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205TCT TCT TCT GCT GAT AAA CGT AAA TAC GGT GAT CCG GAT GCA TTC CGT

672Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220CCG GCT CCG GGT ACT GGT CTG GTA GAC ATG TCT CGT GAT CGT AAC ATC

720Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile225 230 235 240CCG CGT TCT CCG ACT TCT CCG GGT GAA GGC TTC GTT AAC TTC GAT TAC

768Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255GGT TGG TTC GGT GCT CAG ACT GAA GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTA TGG

816Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270ACC CAT GGT AAC CAT TAC CAT GCT CCG AAC GGT TCT CTG GGT GCT ATG

864Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285CAT GTA TAC GAA TCT AAA TTC CGT AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAC

912His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp

290 295 300TTC GAT CGT GGT GCT TAC GTT ATC ACC TTC ATT CCG AAA TCT TGG AAC

960Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320ACT GCT CCG GAC AAA GTT AAA CAG GGT TGG CCG

993Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

325 330SEQ ID NO：3的资料：序列特征：

长度：1518

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性分子类型：其它核酸合成DNA特征

特征键：CDS

定位：87..1082

识别方法：S序列描述：SEQ ID NO：3TTCCCCTGTT GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG

60GGTATCGATT AGTAAGGAGG TTTAAA ATG GAT TCT GAC GAT CGT GTT ACT CCA

113

Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro

1 5CCA GCT GAA CCA CTG GAT CGT ATG CCA GAT CCA TAT CGT CCA TCT TAT

161Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr10 15 20 25GGT CGT GCT GAA ACT GTT GTT AAT AAT TAT ATT CGT AAA TGG CAA CAA

209Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln

30 35 40GTT TAT TCT CAT CGT GAT GGT CGT AAA CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA

257Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln

45 50 55CGT GAA TGG CTG TCT TAT GGT TGC GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT

305Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser

60 65 70GGT CAG TAT CCG ACT AAC CGT CTG GCA TTC GCT TCC TTC GAT GAA GAT

353Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp

75 80 85CGT TTC AAG AAC GAA CTG AAG AAC GGT CGT CCG CGT TCT GGT GAA ACT

401Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr90 95 100 105CGT GCT GAA TTC GAA GGT CGT GTT GCT AAG GAA TCC TTC GAT GAA GAG

449Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu

110 115 120AAA GGC TTC CAG CGT GCT CGT GAA GTT GCT TCT GTT ATG AAC CGT GCT

497Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala

125 130 135CTA GAG AAC GCT CAT GAT GAA TCT GCT TAC CTG GAT AAC CTG AAG AAG

545Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys

140 145 150GAA CTG GCT AAC GGT AAC GAT GCT CTG CGT AAC GAA GAT GCT CGT TCT

593Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser

155 160 165CCG TTC TAC TCT GCT CTG CGT AAC ACT CCG TCC TTC AAA GAA CGT AAC

641Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn170 175 180 185GGT GGT AAC CAT GAT CCG TCT CGT ATG AAA GCT GTT ATC TAC TCT AAA

689Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys

190 195 200CAT TTC TGG TCT GGT CAG GAT AGA TCT TCT TCT GCT GAT AAA CGT AAA

737His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys

205 210 215TAC GGT GAT CCG GAT GCA TTC CGT CCG GCT CCG GGT ACT GGT CTG GTA

785Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val

220 225 230GAC ATG TCT CGT GAT CGT AAC ATC CCG CGT TCT CCG ACT TCT CCG GGT

833Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly

235 240 245GAA GGC TTC GTT AAC TTC GAT TAC GGT TGG TTC GGT GCT CAG ACT GAA

881Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu250 255 260 265GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTA TGG ACC CAT GGT AAC CAT TAC CAT GCT

929Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala

270 275 280CCG AAC GGT TCT CTG GGT GCT ATG CAT GTA TAC GAA TCT AAA TTC CGT

977Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg

285 290 295AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAC TTC GAT CGT GGT GCT TAC GTT ATC

1025Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile

300 305 310ACC TTC ATT CCG AAA TCT TGG AAC ACT GCT CCG GAC AAA GTT AAA CAG

1073Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln

315 320 325GGT TGG CCG TAATGAAAGC TTGGATCTCT AATTACTGGA CTTCACACAG ACTAAAATAG

1131Gly Trp Pro330ACATATCTTA TATTATGTGA TTTTGTGACA TTTCCTAGAT GTGAGGTGGA GGTGATGTAT

1191AAGGTAGATG ATGATCCTCT ACGCCGGACG CATCGTGGCC GGCATCACCG GCGCCACAGG

1251TGCGGTTGCT GGCGCCTATA TCGCCGACAT CACCGATGGG GAAGATCGGG CTCGCCACTT

1311CGGGCTCATG AGCGCTTGTT TCGGCGTGGG TATGGTGGCA GGCCCCGTGG CCGGGGGACT

1371GTTGGGCGCC ATCTCCTTGC ATGCACCATT CCTTGCGGCG GCGGTGCTCA ACGGCCTCAA

1431CCTACTACTG GGCTGCTTCC TAATGCAGGA GTCGCATAAG GGAGAGCGTC GAGAGCCCGC

1491CTAATGAGCG GGCTTTTTTT TCAGCTG

1518SEQ ID NO：4的资料：

序列特征：

长度：39

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：4AATTCATCGA TTAGTAAGGA GGTITAAAAT GGATTCTGA

39SEQ ID NO：5的资料：

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：5CGATCGTCAG AATCCATTTT AAACCTCCTT ACTAATCGAT G

41SEQ ID NO：6的资料：

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：6CGATCGTGTT ACTCCACCAG CTGAACCACT GGATCGTATG C

41SEQ ID NO：7的资料：

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：7GATCTGGCAT ACGATCCAGT GGTTCAGCTG GTGGAGTAAC A

41SEQ ID NO：8的资料：

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：8CAGATCCATA TCGTCCATCT TATGGTCGTG CTGAAACTGT T

41SEQ ID NO：9的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：9ATTAACAACA GTTTCAGCAC GACCATAAGA TGGACGATAT G

41SEQ ID NO：10的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：10GTTAATAATT ATATTCGTAA ATGGCAACAA GTTTATTCTC A

41SEQ ID NO：11的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：11TCACGATGAG AATAAACTTG TTGCCATTTA CGAATATAAT TSEQ ID NO：12的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：12TCGTGATGGT CGTAAACAAC AAATGACTGA AGAACAACGT G

41SEQ ID NO：13的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：13GCCATTCACG TTGTTCTTCA GTCATTTGTT GTTTACGACC A

41SEQ ID NO：14的资料

序列特征：

长度：42

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：14AATGGCTGTC TTATGGTTGC GTTGGTGTTA CTTGGGTTAA CA

42SEQ ID NO：15的资料

序列特征：

长度：40

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：15AGCTTGTTAA CCCAAGTAAC ACCAACGCAA CCATAAGACA

40SEQ ID NO：16的资料

序列特征：

长度：38

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：16AATTCGTTAA CTCTGGTCAG TATCCGACTA ACCGTCTG

38SEQ ID NO：17的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：17CGAATGCCAG ACGGTTAGTC GGATACTGAC CAGAGTTAAC G

41SEQ ID NO：18的资料

序列特征：

长度：49

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：18GCATTCGCTT CCTTCGATGA AGATCGTTTC AAGAACGAAC TGAAGAACG

49SEQ ID NO：19的资料

序列特征：

长度：49

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：19GGACGACCGT TCTTCAGTTC GTTCTTGAAACGATCTTCAT CGAAGGAAG

49SEQ ID NO：20的资料

序列特征：

长度：35

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：20GTCGTCCGCG TTCTGGTGAA ACTCGTGCTG AATTCSEQ ID NO：21的资料

序列特征：

长度：35

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：21GACCTTCGAA TTCAGCACGA GTTTCACCAG AACGC

35SEQ ID NO：22的资料

序列特征：

长度：48

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：22GAAGGTCGTG TTGCTAAGGA ATCCTTCGAT GAAGAGAAAG GCTTCCAG

48SEQ ID NO：23的资料

序列特征：

长度：48

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：23GAGCACGCTG GAAGCCTTTC TCTTCATCGA AGGATTCCTT AGCAACAC

48SEQ ID NO：24的资料

序列特征：

长度：42

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：24CGTGCTCGTG AAGTTGCTTC TGTTATGAAC CGTGCTCTAG AA

42SEQ ID NO：25的资料

序列特征：

长度：39

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：25AGCTTTCTAG AGCACGGTTC ATAACAGAAG CAACTTCAC

39SEQ ID NO：26的资料

序列特征：

长度：45

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：26AATTCTCTAG AGAACGCTCA TGATGAATCT GCTTACCTGG ATAAC

45SEQ ID NO：27的资料

序列特征：

长度：50

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：27CTTCTTCAGG TTATCCAGGT AAGCAGATTC ATCATGAGCG TTCTCTAGAG

50SEQ ID NO：28的资料

序列特征：

长度：49

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：28CTGAAGAAGG AACTGGCTAA CGGTAACGAT GCTCTGCGTA ACGAAGATG

49SEQ ID NO：29的资料

序列特征：

长度：49

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：29GAGAACGAGC ATCTTCGTTA CGCAGAGCAT CGTTACCGTT AGCCAGTTCSEQ ID NO：30的资料

序列特征：

长度：40

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：30CTCGTTCTCC GTTCTACTCT GCTCTGCGTA ACACTCCGTC

40SEQ ID NO：31的资料

序列特征：

长度：39

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：31CTTTGAAGGA CGGAGTGTTA CGCAGAGCAG AGTAGAACG

39SEQ ID NO：32的资料

序列特征：

长度：47

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：32CTTCAAAGAA CGTAACGGTG GTAACCATGA TCCGTCTCGT ATGAAAG

47SEQ ID NO：33的资料

序列特征：

长度：47

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：33GATAACAGCT TTCATACGAG ACGGATCATG GTTACCACCG TTACGTT

47SEQ ID NO：34的资料

序列特征：

长度：45

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：34CTGTTATCTA CTCTAAACAT TTCTGGTCTG GTCAGGATAGATCTA

45SEQ ID NO：35的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：35AGCTTAGATC TATCCTGACC AGACCAGAAA TGTTTAGAGT A

41SEQ ID NO：36的资料

序列特征：

长度：42

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：36AATTCAGATC TTCTTCTGCT GATAAACGTA AATACGGTGA TC

42SEQ ID NO：37的资料

序列特征：

长度：44

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：37CATCCGGATC ACCGTATTTA CGTTTATCAG CAGAAGAAGA TCTG

44SEQ ID NO：38的资料

序列特征：

长度：48

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：38CGGATGCATT CCGTCCGGCT CCGGGTACTG GTCTGGTAGA CATGTCTC

48SEQ ID NO：39的资料

序列特征：

长度：48

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：39GATCACGAGA CATGTCTACC AGACCAGTAC CCGGAGCCGG ACGGAATG

48SEQ ID NO：40的资料

序列特征：

长度：35

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：40GTGATCGTAA CATCCCGCGT TCTCCGACTT CTCCG

35SEQ ID NO：41的资料

序列特征：

长度：36

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：41CTTCACCCGG AGAAGTCGGA GAACGCGGGA TGTTAC

36SEQ ID NO：42的资料

序列特征：

长度：40

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：42GGTGAAGGCT TCGTTAACTT CGATTACGGT TGGTTCGGTG

40SEQ ID NO：43的资料

序列特征：

长度：40

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：43GTCTGAGCAC CGAACCAACC GTAATCGAAG TTAACGAAGC

40SEQ ID NO：44的资料

序列特征：

长度：44

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：44CTCAGACTGA AGCTGATGCT GATAAGACTG TATGGACCCA TGGA

44SEQ ID NO：45的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：45AGCTTCCATG GGTCCATACA GTCTTATCAG CATCAGCTTC A

41SEQ ID NO：46的资料

序列特征：

长度：39

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：46AATTCCCATG GTAACCATTA CCATGCTCCG AACGGTTCT

39SEQ ID NO：47的资料

序列特征：

长度：42

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：47CACCCAGAGA ACCGTTCGGA GCATGGTAAT GGTTACCATG GG

42SEQ ID NO：48的资料

序列特征：

长度：41

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：48CTGGGTGCTA TGCATGTATA CGAATCTAAA TTCCGTAACT G

41SEQ ID NO：49的资料

序列特征：

长度：42

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：49CTTCAGACCA GTTACGGAAT TTAGATTCGT ATACATGCAT AG

42SEQ ID NO：50的资料

序列特征：

长度：37

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：50GTCTGAAGGT TACTCTGACT TCGATCGTGG TGCTTAC

37SEQ ID NO：51的资料

序列特征：

长度：37

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：51GTGATAACGT AAGCACCACG ATCGAAGTCA GAGTAAC

37SEQ ID NO：52的资料

序列特征：

长度：38

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：52GTTATCACCT TCATTCCGAA ATCTTGGAAC ACTGCTCC

38SEQ ID NO：53的资料

序列特征：

长度：38

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：53CTTTGTCCGG AGCAGTGTTC CAAGATTTCG GAATGAAG

38SEQ ID NO：54的资料

序列特征：

长度：38

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：54GGACAAAGTT AAACAGGGTT GGCCGTAATG AAAGCTTA

38SEQ ID NO：55的资料

序列特征：

长度：34

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：55AGCTTAAGCT TTCATTACGG CCAACCCTGT TTAA

34SEQ ID NO：56的资料

序列特征：

长度：20

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：56TTTTCCCAGT CACGACGTTG

20SEQ ID NO：57的资料

序列特征：

长度：21

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：57CAGGAAACAG CTATGACCAT G

21SEQ ID NO：58的资料

序列特征：

长度：36

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：58TAAGGAGGTT TAAAATGTCT GACGATCGTG TTACTCSEQ ID NO：59的资料

序列特征：

长度：21

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性

分子类型：其它核酸合成DNA

序列描述：SEQ ID NO：59TACGCCAAGG TTGTTAACCC A

21

Claims

1.具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，它包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基范围内的序列，其中蛋白质的N-末端氨基酸对应于SEQ ID No.1的第二位的丝氨酸残基。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，它由SEQ ID No.1的氨基酸序列的第二位的丝氨酸残基到第331位的脯氨酸残基之间的氨基酸序列组成。

3.编码权利要求1所述的蛋白质的DNA。

4.编码权利要求2所述的蛋白质的DNA。

5.根据权利要求3所述的DNA，其中编码从N-末端氨基酸计数第四位的Arg的碱基序列是CGT或CGC，编码从N-末端氨基酸计数第五位的Val的碱基序列是GTT或GTA。

6.根据权利要求5所述的DNA，其中编码N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之间的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的碱基序列具有下列序列：

Ser：TCT或TCC

Asp：GAC或GAT

Arg：CGT或CGC

Val：GTT或GTA

7.根据权利要求6所述的DNA，其中编码从N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之间的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的碱基序列具有序列TCT-GAC-GAT-CGT-GTT。

8.根据权利要求6所述的DNA，其中编码N-末端开始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之间的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的碱基序列具有下列序列：

Thr：ACT或ACC

Pro：CCA或CCG

Ala：GCT或GCA

9.根据权利要求7所述的DNA，其中编码N-末端开始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之间的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的碱基序列具有下列序列：

Thr：ACT或ACC

Pro：CCA或CCG

Ala：GCT或GCA

10.包括由SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基之间的序列的DNA。

11.由SEQ ID No.2的碱基序列中第四位的胸腺嘧啶碱基到第993位的鸟嘌呤碱基之间的序列组成的DNA。

12.具有权利要求3所述的DNA的重组DNA。

13.具有权利要求5所述的DNA的重组DNA。

14.具有权利要求6所述的DNA的重组DNA。

15.根据权利要求12所述的重组DNA，它具有选自于下列组的启动子：trp，tac，lac，trc，λPL和T7。

16.根据权利要求13所述的重组DNA，它具有选自于下列组的启动子：trp，tac，lac，trc，λPL和T7。

17.根据权利要求14所述的重组DNA，它具有选自于下列组的启动子：trp，tac，lac，trc，λPL和T7。

18.用权利要求12所述的重组DNA转化获得的转化体。

19.根据权利要求18所述的转化体，其中转化是通过使用多拷贝的载体进行的。

20.根据权利要求18所述的转化体，它属于大肠杆菌。

21.通过用权利要求14所述的DNA转化获得的转化体，其中转化是通过使用多拷贝的载体进行的，该转化体属于大肠杆菌。

22.用于生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求18所述的转化体以生产具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质和回收该蛋白质的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中转化体是权利要求19所述的转化体。

24.根据权利要求22所述的方法，其中转化体是权利要求20所述的转化体。

25.根据权利要求22所述的方法，其中转化体是权利要求21所述的转化体。