CN1529756A - 环状l-氨基酸的立体选择性制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备式(I)的环状L－氨基酸的方法，其特征在于使式(II)的L－二氨基酸或者以可变比例包含这种L－二氨基酸或相应的D－二氨基酸的对映异构体混合物在有鸟氨酸环化脱氨酶或其同源多肽存在下进行反应。
Description
本发明涉及环状L-氨基酸或其盐和衍生物的立体选择性制备。
由于环状氨基酸，特别是L-脯氨酸、L-哌啶酸(L-pipecolic acid)或L-哌嗪-2-羧酸及其盐在合成新药中的用途，它们的需求日益增多。由于它们都是手性分子，因此合成较困难。
从生物合成的角度看，仅有L-脯氨酸环的形成已有说明和描述。它可以用两种方法实现：
-或者通过谷氨酸半醛酸的环化形成Δ1-二氢吡咯-5-羧酸，之后还原该不饱和环；
-或者通过环化脱氨基作用直接由L-鸟氨酸形成。
然而，这些工艺不能提供令人满意的在工业规模上合成手性环状氨基酸的方案。
此外，一种直接将L-鸟氨酸转化为L-脯氨酸的酶活性首次在梭菌(Clostridium)中被描述(R.N.Costilow等，J.Biol.Chem.，246(
21)，(1971)，6655-60；W.L.Muth等，J.Biol.Chem.，249(
23)，(1974)，7457-62，并且在体外存在部分纯化的酶时总共将20mM的L-鸟氨酸转化成L-脯氨酸。梭菌的这种鸟氨酸环化脱氨酶(ornithinecyclodeaminase，ocd)具有被NAD(一种通常参与氧化反应的辅因子)激活的特性，并且当其为纯化形式时似乎相当不稳定。其对D-鸟氨酸不起作用，但40mM D-鸟氨酸存在时受到抑制，而当存在40mM L-赖氨酸的时候，它的活性不降低。因此这些作者甚至没有设想过环化脱氨酶可能对L-赖氨酸起作用的可能性，大概是因为人们太习以为常地公认这种代谢中的酶是非常特异性的。
若干年后，土壤杆菌(Agrobacterium)中参与胭脂碱降解的基因的表达与ocd活性间的关联得以确定(N.Sans等，Eur.J.Biochem.，173，(1988)，123-130)，进而测定了编码ocd的基因的序列。
随后同一作者在另外一株土壤杆菌(Agrobacterium)中发现了另一个非常同源的基因(U.Schindler等，J.Bacteriol.，
171，(1989)，847-854)。研究了这两个环化脱氨酶的性质，并且仅仅证明了对L-鸟氨酸的活性作用。因此，同样没有预见到L-赖氨酸可能是环化脱氨酶的底物，而仅仅检测了它的抑制效果(Schindler等，ibid)。
从那时起，多数生物体的全部或部分测序使得可以鉴定出若干与土壤杆菌的ocd基因高度同源的新基因。不过，不仅没有研究每一基因所编码的多肽的酶活性，而且也没有研究其活性谱，这个酶被认为是鸟氨酸特异性的。尤其是，这些酶的特异性以及它们催化活性的水平仍然是未知的，虽然它们是酶促工艺中生产力的决定性因素。
对于在链霉菌(Streptomyces)中发现这些基因中的三个，来自L-哌啶酸的代谢物的生产者，已经推断了编码多肽的赖氨酸环化脱氨酶活性(WO-A1-96/01901；L.E.Khaw等，J.Bacteriol.，
180，(1998)，809-814；I.Molnar等，Gene，
169，(1996)，1-7；H.Motamedi等，Eur.J.Biochem.，
249，(1998)，528-534)。
因此，已经提出由基因rapL(Khaw等，ibid.)或pipA(WO-A-96/01901)所编码的环化脱氨酶能够通过将赖氨酸转化为哌啶酸，参与雷帕霉素(Rapamycin)的合成路线。然而，迄今为止，尽管有时这被顺便提出，但将L-赖氨酸环化脱氨形成L-哌啶酸的活性没有被证明、例证或定量。有关确实由这些基因催化的反应的了解十分匮乏，这一点可以由这些作者中的某些人提出的有关哌啶酸生物学路线的各种各样假说得到证明，他们还在这些出版物中陈述赖氨酸到哌啶酸的转化可以由D-赖氨酸完成(Khaw等，ibid.)。
其它生化研究描述了在曲霉(Aspergillus)中由α-氨基己二酸通过不饱和环的还原形成L-哌啶酸(A.J.Aspen等，Biochemistry，1，(4)，(1962)，606-612)，并且依据同位素标记实验，本领域熟练技术人员还提出了链霉菌(Streptomyces)中这样的生物合成路线(J.W.Reed等，J.Org.Chem.，
54(5)，(1989)，1161-65)。
现有技术中并没有提及L-脯氨酸生物合成的酶，特别是鸟氨酸环化脱氨酶在制备新的环状氨基酸中的用途，这一事实进一步证明本领域熟练技术人员一般认为不可能以这种方式实现哌啶酸的生物合成。因此产生对映异构体纯的形式，更特别的是产生L型哌啶酸或哌嗪-2-羧酸的生物转化的许多生物技术工艺已经通过专利被保护了若干年。这些出版物中的例子报道最大产量为15g/L的环状氨基酸；其中并未提及环化脱氨酶。
所有这些文献，除了仅有一个例外，描述了外消旋底物的拆分。它们利用了作用于合适底物的N-酰基酶类(WO 95/10604，WO99/07873)、酰胺酶类(EP-A-0 686 698)、氨基酸氧化酶类(JP06030789)、腈水解酶类(JP 06038781，JP 11127885)或酯酶类(WO00/12745)的活性。
所有这些方法具有一定的缺陷，其中要提到的是外消旋混合物最大产量仅50％的限制、必须分离如此形成的产物和不可被酶转化的底物以便回收目的对映异构体形式、以及有必要开发对另一对映异构体形式进行再利用等。只有JP 06030781描述了通过各种非重组细菌分离物，将L-赖氨酸，一种市售的、并且不是十分昂贵的手性底物，转化为L-哌啶酸，但是没有描述所借用的用来实现这种生物转化的化学反应的顺序。该文献中所提到的功效，在产量和生产能力方面，-即在7天内由10g/L L-赖氨酸产生大约4.2g/L L-哌啶酸-仍然相当不足以使这样一种方法具有优势和经济方面的竞争力。本发明的一个目的是取得比现有技术中所知更好的功效，并且特别地，制备比现有技术公开的那些高5倍、10倍或者甚至20倍或者更高数量级的环状氨基酸。
本申请现在表明，可以通过使用由土壤杆菌(Agrobacterium)C58菌株的鸟氨酸环化脱氨酶(EC 4.3.1.12)基因或者其同源基因编码的酶、或者过表达这种酶的重组微生物，将二氨基酸浓缩溶液高产量地转化为α-亚氨基-环酸溶液，特别是α-亚氨基-环酸的铵盐水溶液。
本发明涉及制备结构式(I)的环状L-氨基酸、或者结构式(I)的氨基酸的盐或衍生物的方法：
其中：
*R1选自氢原子、具有1到6个碳原子的直链或支链烷基、以及具有1到6个碳原子的直链或支链酰基；且
*X代表饱和的、或者部分或全部不饱和的直链或支链C1-C9，优选C2-C4的烃链，任选地在链中和/或链末端包括选自O，S，P，NR2中的一个或数个杂原子或杂基团，其中R2代表H或C1-C4烷基或酰基，所说的链还任选地被选自-R，-OR，-SR，＝O，-C(O)OR，-C(S)OR，-C(O)NR’R″，-C(S)NR’R”，-CN，-NO2，-X，-MgX，-NR’R″，-NR’C(O)R，-SiR和-SiOR中的一个或数个相同或不同的基团取代，其中R、R’和R″相同或不同，代表氢原子、或者直链或支链、饱和的或者全部或部分不饱和的具有从2到20个碳原子的烃基，应当理解R’和R″可以与携带它们的原子成环，
其特征在于：
a)使结构式(II)的L-二氨基酸：
其中X和R1如上文所定义；
或者其盐或衍生物，
或者是以可变比例包括结构式(II)的L-二氨基酸和相应的D-二氨基酸、其盐或衍生物的对映异构体混合物，优选是在水性介质中，
在存在鸟氨酸环化脱氨酶或鸟氨酸环化脱氨酶的同源多肽时反应，该酶或同源多肽获自于表达所说的酶或所说的同源多肽的重组表达载体，
b)回收结构式(I)的环状L-氨基酸或其盐或衍生物，其中对映异构体过量至少80％。
″结构式(I)或(II)的氨基酸衍生物″应理解为是指它们的酰胺或酯。
更具体的，本发明涉及制备结构式(I)的环状L-氨基酸、或者结构式(I)的氨基酸的盐或衍生物的方法：
其中R1代表H或C1-C6烷基或C1-C6酰基，而X代表饱和的直链或支链C2-C9烃链，优选C2-C4烃链，任选地由选自O，S，NR2中的一个或数个杂原子或杂基团中断，其中R2代表H或C1-C4烷基或酰基，和/或任选地由一个或数个羟基、氨基或卤代基团取代，
其特征在于：
a)使结构式(II)的L-二氨基酸：
其中X和R1如上文所定义；
或者其盐或衍生物，
或者是以可变比例包括结构式(II)的L-二氨基酸和相应的D-二氨基酸、其盐或衍生物的对映异构体混合物，优选是在水性介质中，
在存在鸟氨酸环化脱氨酶或鸟氨酸环化脱氨酶的同源多肽时反应，该酶或同源多肽获自于表达所说的酶或所说的同源多肽的重组表达载体，
b)回收结构式(I)的环状L-氨基酸或其盐或衍生物，其中对映异构体过量至少80％。
当烃链具有一个或数个乙烯和/或乙炔性质的不饱和现象时，它们优选不涉及位于形成结构式(II)二氨基酸中胺官能团的氮原子α位的碳原子。
当烃链具有一个或数个杂原子时，还优选所说的杂原子被至少两个碳原子隔开。
利用根据本发明的方法获得的结构式(I)的化合物最经常地包括3，4，5，6或7个键的环，这些是在有机化学领域最频繁遇到的环。其中环具有5，6或7个键的结构式(I)的化合物是优选的，并且这似乎是本领域熟练技术人员最容易得到的。不过，本发明的方法不应当局限于合成具有5，6或7个键的环的这些化合物。
该方法还优选其中结构式(I)的化合物包括有6个键的环，其中X代表有4个键的烃链。甚至更具体地，实施该方法，以便获得其中X为直链或支链亚烷基链的结构式(I)化合物。在本发明中，烃链应当理解为是指具有碳和氢原子的链。
对于根据本发明的方法，应当理解如上文所定义的结构式(II)的L-二氨基酸被置于存在至少一种酶和/或至少一种与鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽的条件下，该酶或多肽获自于表达所述酶或同源多肽的重组表达载体。
鸟氨酸环化脱氨酶应当理解为是指任何能够使二氨基酸，确切的是氨基-α-氨基酸，更特别的是鸟氨酸和赖氨酸，环化的酶。本文其余部分提及鸟氨酸环化脱氨酶优选是菌株土壤杆菌(Agrobacterium)C58的鸟氨酸环化脱氨酶(EC 4.3.1.12)。
由质粒TiC58携带的基因编码的菌株土壤杆菌(Agrobacterium)C58的鸟氨酸环化脱氨酶描述于N.Sans等，Eur.J.Biochem.，
173，(1988)，123-130，并且它的多肽序列在Genbank中可以同样地得到(gi：68365)。
″与鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽″应理解为是指具有与鸟氨酸环化脱氨酶，特别是与菌株土壤杆菌C58的鸟氨酸环化脱氨酶同源的氨基酸序列的多肽。
同源序列可被定义为与土壤杆菌ocd基因的氨基酸序列具有至少25％的相似性，并且具有鸟氨酸环化脱氨酶活性的序列，例如由R.N.Costilow等，J.Biol.Chem.，246，
21，(1971)，6655-60所描述的。
术语″相似″既指比较的氨基酸之间的完全相似或一致性，而且还指称之为相似性的不完全相似。多肽序列的相似性搜索将同类氨基酸取代的保守取代考虑在内，例如具有不带电荷侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)，具碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)取代。
更一般地，“氨基酸的同源序列”应被理解为是指任何通过取代、缺失和/或插入氨基酸或减少氨基酸数目，特别是通过用非天然氨基酸或氨基假酸在受到修饰时不会显著破坏编码多肽的生物活性的位置上取代天然的氨基酸，而有别于土壤杆菌ocd基因编码的鸟氨酸环化脱氨酶氨基酸序列的氨基酸序列。
这样的同源氨基酸序列优选地与土壤杆菌ocd基因编码的多肽具有至少35％的相似性，优选至少45％的相似性。
通常利用序列分析软件包(例如，Genetics Computer Group的Sequence Analysis Software Package，University of WisconsinBiotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI53705，USA)测定同源性。对相似氨基酸序列进行比对，以便取得最大程度的同源(即如上文所定义的一致性或相似性)。对于这个目的，有必要以人工方式向序列中引入缺口。一旦实现了最佳比对，通过记录两个比较序列中氨基酸相同的所有位置占总位置数的比例来确定同源性程度。
这些多肽具有的共同特征是它们具有α-δ或α-ε二氨基脱氨酶酸活性，这一点迄今为止尚未被必然地确定。
包括在这些同源序列之内的是与土壤杆菌的鸟氨酸环化脱氨酶同源的、在属于土壤杆菌属(Agrobacterium)，气生菌属(Aeropyrum)，古生球菌属(Archaeoglobus)，布鲁氏菌属(Brucella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，嗜盐菌属(Halobacterium)，中生根瘤菌属(Mesorhizobium)，甲烷杆菌属(Methanobacterium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，根瘤菌属(Rhizobium)，红细菌属(Rhodobacter)，中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)，硫化叶菌属(Sulfolobus)，热原体属(Thermoplasma)，葡萄球菌属(Staphylococcus)和链霉菌属(Streptomyces)属的微生物中发现的多肽序列。
特别提及的是下面表1中所列的种系或株系中发现的与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽序列：
表1：具有与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽序列的微生
物
| 株系或种系 | 同源肽的Genbank号(gi：) |
| -冻疮气生菌(Aeropyrum pernix)(K1株) | 7521229 |
| -根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) | 1066073 |
| -根癌土壤杆菌质粒pAtK84b | 11269716(片段) |
| -根癌土壤杆菌质粒pTiAch5 | 2498689 |
| -根癌土壤杆菌质粒pTiC58 | 68365 |
| 株系或种系 | 同源肽的Genbank号(gi：) |
| -闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) | 11499255 |
| -马尔他布鲁氏菌流产变种(Brucella melitensisbiovar Abortus) | 1354828 |
| -谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) | 4127671 |
| -嗜盐菌之种NRC-1 | 10581639(ocd1)；10580873(ocd2) |
| -百脉中生根瘤菌(Mesorhizobium loti) | 13472795 |
| -百脉中生根瘤菌 | 13472097 |
| -百脉中生根瘤菌 | 13475945 |
| -百脉中生根瘤菌 | 13475655 |
| -百脉中生根瘤菌 | 13471680 |
| -热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(Delta H株)、或热自养甲烷嗜热细菌(Methanothermobacterthermautotrophicus) | 7482770 |
| -铜绿甲单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(PA01株) | 11350019(ocd1)；11350319(ocd2) |
| -Y4tK根瘤菌之种NGR234 | 2182641 |
| -根瘤菌或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti) | 420888 |
| -荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) | 7437141 |
| -粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe) | 12044475 |
| -金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) | 13700033 |
| -吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus) | 7481884 |
| -吸水链霉菌子囊霉素变种(Streptomyceshygroscopicus var ascomycetus) | 9280393 |
| -硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus) | 13813523(ocd1)；13816686(ocd2) |
| -嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum) | 10639650 |
| -火山热原体(Thermoplasma volcanium) | 13541655 |
同样提及的是始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)(ATCC-25486)pipA基因编码的多肽，其序列描述于WO-A1-96/01901中，以及与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽序列，这些多肽存在于例如生产雷帕霉素(Rapamycin)、子囊霉素(ascomycin)和FK-506的种系或株系中，以及链霉菌或其它生产链阳性菌素(streptogramins)的微生物中，特别是(Streptomycesioidensis)(ATCC-11415)，三鹰链霉菌(Streptomyces mitakaensis)(ATCC-15297)，橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)(ATCC-12019)，蛎灰链霉菌(Streptomyces ostreogriseus)(ATCC-27455)，弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)(ATCC-13161).
同样提及的是在真核生物体，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，人类(Homo sapiens)，黑褐色大袋鼠(Macropus fuliginosus)，小家鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)中发现的与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源、并列在下面表2中的多肽：
表2：具有与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽序列的高等
生物
| 株系或种系 | 同源肽的Genbank号(gi：) |
| -拟南芥 | 9950040 |
| -黑腹果蝇 | 7293295 |
| -人类 | 13647115 |
| -黑褐色大袋鼠 | 283930 |
| -小家鼠 | 3913376 |
| -褐家鼠 | 5931745 |
在本发明特别的实施方式中，这些多肽由与菌株土壤杆菌C58的鸟氨酸环化脱氨酶基因同源的基因编码。
“与菌株土壤杆菌C58的鸟氨酸环化脱氨酶基因同源的基因”应理解为是指具有下列特征的任何基因：
a)与菌株土壤杆菌C58的鸟氨酸环化脱氨酶基因的编码序列相似的核苷酸序列；或
b)在严谨杂交条件下，与菌株土壤杆菌C58的鸟氨酸环化脱氨酶基因的编码序列、或它的互补序列杂交的核苷酸序列；或
c)编码如上文所定义的与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽、或者具有鸟氨酸环化脱氨酶活性的多肽的核苷酸序列。
优选地，本发明的这种同源核苷酸序列与土壤杆菌ocd基因序列、或者与如下文所定义的序列SEQ ID No.1的
pipA，rapL，
pipA*基因、序列SEQ ID No.2的
rapL*基因以及序列SEQ ID No.5的
rapL*L*基因具有至少75％的相似性，更优选至少85％相似，或者至少90％相似。
在优选的方式中，这种同源核苷酸序列在严谨条件下，特异性地与土壤杆菌ocd基因序列、或者如下文所定义的序列SEQ ID No.1的
pipA，rapL，
pipA*基因、序列SEQ ID No.2的
rapL*基因以及序列SEQ ID No.5的
rapL*L*基因的互补序列杂交。确定严谨条件的参数取决于50％配对的链分离的温度(Tm)。
对于包括30个碱基以上的序列，Tm由关系式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(阳离子浓度)-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数目)(Sambrook等，1989)确定。
在非特异性序列不会杂交的合适严谨条件下，杂交温度可以优选地在Tm以下5到10℃，并且所用的杂交缓冲液优选是具有高离子强度的溶液，例如6×SSC溶液。
上文所用的术语“相似序列”不仅指比较的核苷酸之间的完全相似或一致性，而且还指称之为相似性的不完全相似。这种核酸序列的相似性搜索可以区分例如嘌呤和嘧啶。
因此同源核苷酸序列包括通过一个或数个碱基的突变、插入、缺失或取代，或者由于遗传密码的简并性而有别于已鉴定的序列的任何核苷酸序列。
这些同源序列可以从属于土壤杆菌属(Agrobacterium)，气生菌属(Aeropyrum)，古生球菌属(Archaeoglobus)，布鲁氏菌属(Brucella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，嗜盐菌属(Halobacterium)，中生根瘤菌属(Mesorhizobium)，甲烷杆菌属(Methanobacterium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，根瘤菌属(Rhizobium)，红细菌属(Rhodobacter)，中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)，硫化叶菌属(Sulfolobus)，热原体属(Thermoplasma)，葡萄球菌属(Staphylococcus)和链霉菌属(Streptomyces)属的微生物中获得。
特别要提及的是编码上文表1中所列的各种或株系中发现的与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽编码基因序列。
同样提及的是在WO-A1-96/01901中描述的始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)(ATCC-25486)pipA基因的序列，以及编码与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源的多肽的基因序列，它们可存在于生产雷帕霉素(Rapamycin)、子囊霉素(ascomycin)和FK-506的种或株系中，以及链霉菌或其它生产链阳性菌素(streptogramins)的微生物中，特别是Streptomyces ioidensis(ATCC-11415)，三鹰链霉菌(Streptomyces mitakaensis)(ATCC-15297)，橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)(ATCC-12019)，蛎灰链霉菌(Streptomyces ostreogriseus)(ATCC-27455)，弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)(ATCC-13161)。
同样提及的有拟南芥(Arabidopsis thaliana)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，人类(Homo sapiens)，黑褐色大袋鼠(Macropus fuliginosus)，小家鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)中编码与土壤杆菌鸟氨酸环化脱氨酶同源、并列在前述表2中的多肽的真核基因。
在非常适合用于本发明方法的基因中，要特别提及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的
rapL基因和始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespirales)的
pipA基因，其序列分别在Schwecke等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
92(17)，(1995)，7839-43和WO-A1-96/01901中描述。根据本发明的实施方式，通式(II)的化合物或者以可变比例包括结构式(II)的L-氨基酸和相应的D-氨基酸、其盐或衍生物的对映异构体混合物，被置于存在生产鸟氨酸环化脱氨酶的同源多肽的微生物悬浮液的条件下。
优选的如上所述的同源基因是通过如下所述的定向诱变法获得的合成基因。
根据本发明的一个实施方式，结构式(II)的化合物或者以可变比例包括结构式(II)的L-氨基酸和相应的D-氨基酸、其盐或衍生物的对映异构体混合物，被置于存在由生产微生物中分离的酶的条件下。
根据本发明的另一个实施方式，结构式(II)的化合物或者以可变比例包括结构式(II)L-二氨基酸和相应的D-二氨基酸的对映异构体混合物，被置于存在纯化状态的酶的条件下。
根据本发明的另一个实施方式，结构式(II)的化合物或者以可变比例包括结构式(II)的L-二氨基酸和相应的D-二氨基酸的对映异构体混合物，被置于存在重组酶的条件下，这后一种实施方式是优选的。
令人惊讶地发现在本发明的条件下，如上所述的多肽能够使得立体专一地合成结构式(I)的化合物，而无需向反应介质中外在地添加NAD。
在本发明的一种实施方式中，在酶制备物或者任选地经过渗透处理的细胞悬浮液中，以大于约0.05M的浓度，优选以大于0.1M的浓度加入结构式(II)的化合物，或者结构式(II)的化合物和相应的D-二氨基酸的对映体混合物，及其盐或衍生物，该浓度小于约3M，并且优选小于2.5M，并且使其置于10℃-100℃的温度下，优选地在20℃-70℃，优选地在25℃-45℃，温育数小时到数天，伴有搅动。
以这种方式，可以获得至少20％摩尔产量的结构式(I)的化合物，优选地至少80％，优选地至少90％，其中对映异构体过量大于80％，优选地大于90％，优选地大于95％。
优选地，结构式(I)的化合物是铵盐的形式。
或者，可将自培养基中提取的或者纯化的酶与结构式(II)的化合物、或者结构式(II)的化合物或者相应的D-二氨基酸的对映体混合物也可以在介质中温育，介质可以缓冲在pH6和11之间、并且优选地在pH7和10之间，也可不用如此缓冲。
所获得的产物可通过沉淀、结晶或者离子交换层析进行收集。
在优选用于制备结构式(I)化合物的底物中，要特别提及L-赖氨酸或L-和D-赖氨酸混合物，L-硫代赖氨酸(S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸)，L-鸟氨酸，L-和D-5-(R，S)-羟赖氨酸混合物，L-和D-氮杂赖氨酸(γ-N-2-氨基乙基二氨基丙酸)混合物。
为使该方法更有效，过量生产具有鸟氨酸环化脱氨酶活性的多肽特别有利。
有鉴于此，将编码如上文所定义的多肽的感兴趣基因导入到宿主微生物中，优选过表达该多肽。
为达到这个目的，将含有包括一个如上文所定义的核苷酸序列或者同源序列的核酸的载体转染到宿主细胞中，将其在允许表达、优选过表达相应多肽的条件下培养。
可将感兴趣的核酸序列插入到表达载体上，其中它以一种可操作的方式连接了可调控其表达的元件上，例如特别是启动子、激活子和/或转录终止子。
控制核苷酸序列表达的信号(其中要提及启动子、激活子和终止序列)根据所用宿主细胞选择。为此目的，可将本发明的核苷酸序列插入到可在所选择的宿主细胞中自主复制的载体中，或者插入到可整合进所选择的宿主的载体中。这样的载体可按照本领域熟练技术人员当前所使用的方法制备，并且可将由此产生的克隆可以通过标准方法导入到合适的宿主中。
在优选的载体中，可提及的有质粒pTZ18(Sigma，St-Louis)，pQE70(Qiagen，Munich)以及pQE60(Qiagen，Munich)。
在利用它们时，QIAGEN质粒表现出在获得的酶中形成聚组氨酸的主要缺陷。所以，这些质粒必须进行修饰以便克服这个缺陷。因此必须修饰或破坏该编码序列。这些修饰在编码环化脱氨酶的基因表达水平方面没有导致任何差异。
将表达载体引入宿主细胞，然后在允许所转染的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养这些细胞。
宿主细胞的例子特别包括大肠杆菌，优选菌株大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、大肠杆菌β2033、和大肠杆菌K12(MG1655)。
不过，其它属于不同属的宿主生物体同样适合。
当利用相对于相应的天然基因而言被修饰成可以允许感兴趣的基因在大肠杆菌中最佳表达的基因转染大肠杆菌时，可以获得特别有意思的结果。
将异源基因修饰成包括小于65％，优选地小于55％比例的碱基G+C，同时又象天然基因一样编码相同的多肽，或者编码如先前所定义的同源多肽。
因此对于给定的由天然DNA的密码子所编码的氨基酸，如果需要，可将密码子的第三个碱基替换掉，或者若密码子的第二个碱基为G或C时，将其替换为A或T，当然所得的密码子对应于由天然密码子所编码的相同氨基酸时。
经过修饰的、使其有可能获得最大表达率并且同样地最高产量生产α-亚氨基-环酸的基因是那些对于具有氨基酸环化脱氨酶活性的多肽的给定氨基酸，其天然密码子被下列表3中所示的相应密码子替换的基因。
表3：所用的转化密码子
通过装配得自于PCR的片段和相应的天然基因的定向诱变获得经修饰的基因。
在给出最好结果的被修饰基因中，可提及的是分别具有如本申请附件中所示的序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.5的修饰基因
pipA*和
rapL**。
与这些修饰基因相对应的多核苷酸构成了本发明的进一步的主题。
基因
pipA*得自于由附件中显示为序列SEQ ID No.3的始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)
pipA基因所编码的多肽序列。
rapL**基因得自于由附件中显示为序列SEQ ID No.4的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
rapL基因所编码的多肽序列。
象上文就将天然基因转染到重组宿主所述的方式一样将修饰基因插入克隆载体中。
可以培养宿主微生物，并任选地在表达诱导物，例如IPTG存在的条件下培养，该宿主微生物可以是重组的，并且包括以天然状态存在的或者如上所述的经过修饰的基因。
当作为标准培养物的细胞培养至密度达到600nm为至少一个吸光单位的数量级，或者作为高密度培养物的细胞培养至密度达到数十个或者更多个吸光单位的数量级时，将它们从其培养基中分离，并经受通透性处理，这种处理可以是物理的(例如，交替冻融处理、用超声波或者French压力器机械挤压处理)或者化学的(例如，添加溶剂或者络合剂例如EDTA)、或者酶促的(例如，添加溶菌酶)。
然后可以利用细胞悬浮液以便实现如上所述的结构式(II)产品的制备，接着可以回收和纯化其中制备的感兴趣的蛋白。例如，利用“分批补料”型或等价的方法，获得以每升细胞悬浮液的浓缩物干细胞克重大于约10g/L，优选地大于30g/L。这些浓缩物一般小于60g/L，或者甚至小于50g/L，没有这些则意味着不可克服的界限。
所用的纯化方法是本领域熟练技术人员公知的。获得的重组多肽能够通过单独或联合使用的方法，以溶解物和细胞提取物、培养基上清为基础进行纯化，例如分级分离、色谱法、借助于特异性单或多克隆抗体的免疫-亲和技术等。
不过，没必要回收该蛋白。
根据一个优选的实施方式，破坏生产具有所需酶活性的多肽的宿主细胞，使它们的胞质内含物释放到含有L型或者对映体混合物形式的二氨基酸底物的培养基中，该底物的两个胺基被四个或五个键远远地隔开(如果许多路线可能的话，以最短的路线计)，使得酶和它的底物能够接近。
下列实施例阐释了本发明。
实施例1：
由菌株的总DNA PCR扩增始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)的
pipA基因
1.1
总DNA提取
菌株始旋链霉菌(
Streptomyces pristinaespiralis)ATCC 25486在培养基TSB(DIFCO)中于28℃培养24小时，然后将如此获得的10mL培养物以11000g离心5分钟。将离心沉淀物悬浮在含有2mMEDTA和5mg/mL溶菌酶的1mL 10mM Tris pH 8.0溶液中。将这样得到的悬浮液置于37℃搅动30分钟，然后加入100μL 20％的SDS溶液。于30℃温育数分钟之后，再次加入125μL 2mg/mL的蛋白酶K溶液。然后利用试剂盒DNeasy Tissue Kit(QIAGEN，Munich)中的试剂，根据厂商的说明书进行DNA的提取。对如此提取的DNA通过苯酚/氯仿提取法纯化，用乙醇沉淀并溶解在100μl水中。
1.2
基因pipA的扩增
自这样制备的总DNA经PCR扩增基因
pipA，所用引物按照专利WO-A1-96/01901中有描述的序列合成。反应在总体积为50μL的20mMTris-HCl pH 8.8缓冲液中进行，其中含10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，2μL总DNA溶液，4种dNTP各250μM，1单位的Vent DNA聚合酶(BioLabs)以及下列两种寡脱氧核糖核苷酸各500nM：
5’CCCGAATTCCGACACCACGCACGGACGAGAAG
5’CCCTGCAGGCATCTCTCTCCTCGCGAGGGC.
应用的PCR操作以97℃ 4分钟的变性步骤开始，接着按80℃温育1分钟，然后继续以97℃变性1分钟、55℃杂交1分钟、72℃延伸1分30秒的顺序进行5个循环。然后以97℃变性1分钟、50℃杂交1分钟、72℃延伸1分30秒的次序进行40个循环。这个操作以72℃延伸10分钟的步骤结束。
这样扩增的片段在Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)的柱子上纯化，然后用
EcoRI和
PstI消化，并克隆到预先切开的载体pTZ18(SIGMA，St-Louis，MO)中。对独立PCR扩增后所得到的两个质粒构建物(pKT 35，pKT 36)进行序列分析。这样克隆的两个片段的序列是相同的。不过，序列SEQ ID No.3所确定的蛋白相对于WO-A1-96/01901(甘氨酸)中公开的序列，在87位具有氨基酸差别(丙氨酸)。
实施例2：
由菌株的悬浮细胞PCR扩增吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的基因
rapL
菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC 29253在培养基TSB(DIFCO)中于28℃培养24小时。使这样获得的50μL细胞悬浮液经受下列步骤的加热和冷却：65℃ 30秒、8℃ 30秒、65℃ 90秒、97℃ 180秒、8℃ 60秒、65℃ 180秒、97℃ 60秒、65℃ 60秒、80℃ 20分钟。
利用其被描述的序列(Schwecke等，1995)合成引物，自细胞悬浮液中通过PCR进行基因
rapL的扩增。反应在总体积为50μL的20mMTris-HCl pH 8.8缓冲液中进行，该缓冲液中含有10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，10μL预先处理过的细胞悬浮液，4种dNTP各250μM，1单位的Vent DNA聚合酶(BioLabs)以及下列两种寡脱氧核糖核苷酸各500nM：
5’CCCGAATTCGAGGTTGCATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAG
5’CCCAAGCTTAGATCTTTATTACAGCGAGTACGGATCGAGGACG
应用的PCR操作以97℃ 4分钟的变性步骤开始，紧接着80℃温育1分钟，然后按97℃变性1分钟、60℃杂交1分钟、72℃延伸1分30秒的次序进行5个循环，然后按97℃变性1分钟、52℃杂交1分钟、72℃延伸1分30秒的次序进行5个新的循环。然后按97℃变性1分钟、50℃杂交1分钟、72℃延伸1分30秒的次序进行30个循环。这个操作以72℃延伸10分钟的步骤结束。
这样扩增的片段在Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)的柱子上纯化，然后用
EcoRI和
HindIII消化，并克隆到预先切开的载体pTZ18中。对独立PCR扩增后所得到的三个质粒构建物(pKT 30，pKT 31，pKT34)进行序列分析。这样克隆的三个片段的序列是相同的。不过，序列SEQID No.4所确定的蛋白相对于由Schwecke等公开的序列，具有5个氨基酸的差别，也就是说本发明的蛋白在第50，84，102，127和129位分别含有苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸和丙氨酸残基。
实施例3：基因
pipA*的PCR总合成
大小为1066bp、来源于始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、并且其序列在专利WO-A1-96/01901中描述过的基因
pipA中G+C组成为69.6％。这个基因根据表3中所述的用于在大肠杆菌表达的优化遗传密码作了改写。具有改写序列SEQ ID No.1的基因
pipA*中G+C组成为38％。为了引入单限制性位点
KpnI，苏氨酸残基97由密码子ACC而不是表3中所提供的ACT编码。还分别在序列SEQ ID No.1的第15位和第1080位(密码子的第一个核苷酸)添加了两个翻译终止密码子TAA，并且在基因的5’和3’分别引入了单限制性位点
EcoRI和
NcoI以及
HindIII，从而允许将它插入到克隆载体中。
基因
pipA*的合成通过装配两个片段
EcoRI-
KpnI(305bp的片段1-第1到第304位核苷酸)和
KpnI-
HindIII(798bp的片段2-第305到第1092位核苷酸)进行。
每个片段通过延伸重叠的长度为50到60个核苷酸的单链寡核苷酸合成(“有义”和“反义”链)，接着是通过末端寡核苷酸5’和3’进行扩增。
片段1的合成：PCR反应在总体积为100μL的20mM Tris-HClpH 8.8缓冲液中进行，该缓冲液中含10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，0.01μM下文所列的寡核苷酸、4种dNTP各0.3mM和2单位的Vent DNA聚合酶(BioLabs)。应用的PCR操作包括以96℃变性30秒、55℃杂交30秒、72℃延伸30秒的次序进行30个循环。在第10个循环中，加入5’(PIPAUP)和3’(PIPAD1)末端寡核苷酸至终浓度0.5μM。在30个循环结束时，72℃延伸2分钟。
下列寡核苷酸被用于这个反应：PipaV0，PipaV2，PipaV4，PipaV6，PipaV8，PipaD4，PipaD5，PipaD6和PipaD7。这些寡核苷酸的序列描述于表4。
这样获得的PCR产物在Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)的柱子上纯化，然后相继用限制性内切酶
KpnI和
EcoRI消化，再在琼脂糖凝胶上纯化。利用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶中提取300bp表观大小的条带。然后通过T4 DNA连接酶(BioLabs)，将纯化的PCR产物连接到预先用酶
EcoRI和
KpnI消化并且在凝胶上纯化了的载体pTZ18上。连接反应在提供酶的连接缓冲液中于16℃过夜进行。然后通过热休克向菌株
E.Coli DH5αCIP104738(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，
166，(1983)，557-580)中转化连接产物，并在补充有氨苄青霉素(100mg/L)的琼脂LB培养基(DIFCO)上选择重组克隆。
利用质粒制备系统QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)分离转化子中含有的抗氨苄青霉素的质粒。这些质粒中的四个，其通过合适的限制性酶分析显示有预期大小的插入片段，对其
EcoRI-
KpnI片段进行测序。四个构建物序列的每一个相对于预期序列含有1到3处差异。对于片段序列中除了6bp的缺失之外其余都正确的质粒pSP23，根据公开的方法(Ansaldi等，Anal.Biochem.，
234，(1996)，110-111)对其进行定向诱变步骤以校正这种缺失。以这种方式获得质粒pSP39。对质粒pSP39的
EcoRI-
KpnI片段进行序列分析，发现所得的序列与预期的序列一致。
片段2的合成：除了延伸周期以外，用于合成
KpnI-
HindIII片段的PCR反应的进行与所述的用于片段1的反应相同，前者延伸时间对于30个循环延长至1分钟，并且在操作结束时延长至4分钟。在第10个循环时，加入5’(PIPAV29)和3’(PIPAD3)末端寡核苷酸至终浓度0.5μM。
下列寡核苷酸被用于这个反应：PipaV8，PipaV10，PipaV12，PipaV14，PipaV16，PipaV18，PipaV20，PipaV22，PipaV24，PipaV26，PipaV28，PipaD8，PipaD9，PipaD10，PipaD11，PipaD12，PipaD13，PipaD14，PipaD15，PipaD16和PipaD17。这些寡核苷酸的序列描述于表4。
PCR产物在Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)的柱子上纯化，然后用限制性内切酶
KpnI和
HindIII消化，并连接到预先用同样的酶消化过的载体pTZ18中。菌株
E.Coli DH5α的转化和转化子的选择以及质粒的分析与上述的片段1同样地进行。对于其中的KpnI-
HindIII片段与预期序列具有5处差异的质粒pSP25进行数个步骤的定向诱变(Ansaldi等，1996，ibid)以校正这些错误。以这种方式获得质粒pSP42。
2个片段的装配：通过将从质粒pSP42中提取的
KpnI-
HindIII片段克隆到预先用酶
KpnI和
HindIII切割的质粒pSP39中，装配出完整的基因
pipA*。对所得质粒之一，即含有预期大小的EcoRI-
HindIII片段的质粒pSP43测序，从而证实基因序列。
表4：
pipA*基因寡核苷酸序列的合成
PipaV0 5’TTCCAAGGAATTTGTTTACCCAATCTTCAGTCCGTTCGAATTCGAGGTTCC
PipaV2 5’TGATGTTGCAGAAGTTGTTGCAGCAGTTGGTCGTGATGAATTAATGCGTC
PipaV4 5’CAGAAATTGGTCGTGGTGAACGTCATTTATCTCCATTACGTGGTGGTTTA
PipaV6 5’GAATGGATGCCACATCGTGAACCAGGTGATCATATTACTTTAAAAACTGT
PipaV8 5’TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG
PipaD4 5’ATA GTT GGT AAA CCA AAA CGA CCT GGA TTT GCT GGA GAA TAA CCA
ACA GTT TTT AAA GTA
PipaD5 5’ATG TGG CAT CCA TTC CCA AAT ACC TGG AAC TGG TTC AGA ACG TTC
TAA ACC ACC ACG TAA 3’
PipaD6 5’CAC GAC CAA TTT CTG CTA AAC CAC CAG TTA AAC GAT CGA TAA TAC
GAC GCA TTA ATT CAT 3’
PipaD7 5’ACT TCT GCA ACA TCA CGA CGA CCT AAA ACC CAA GTT TCC ATG GAA
CCT CGA ATT CG 3’
外部寡核苷酸：
PIPAUP 5’CCCGAATTCGAGGTTCCATGGAAAC
PIPAD1 5’CAGTAGTATCATCATAACGTGC
片段KpnI-HindIII：
PipaV8 TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG
PipaV10 TATTAACTGCATTACGTACTGGTGCAGCATCTGCTGTTGCATCTCGTTTA
PipaV12 TTAATTGGTACTGGTGCACAAGCAGTTACTCAATTACATGCATTATCTTT
PipaV14 GGATACTGATCCAGCACATCGTGAATCTTTTGCACGTCGTGCAGCATTTA
PipaV16 CACGTATTGCAGCAGAAGCAGATGTTATTTCTACTGCAACTTCTGTTGCA
PipaV18 GGTGTTCGTGAACATTTACATATTAATGCAGTTGGTGCAGATTTAGTTGG
PipaV20 ACGTGCATTTGTTACTGCAGATCATCCAGAACAAGCATTACGTGAAGGTG
PipaV22 GTCCACAATTAGCACATTTATGTGCAGATCCAGCAGCAGCAGCAGGTCGT
PipaV24 GGTTTTGCATTTGAAGATGCATTAGCAATGGAAGTTTTTTTAGAAGCAGC
PipaV26 TATTGAACATCATCCAGGTGATGCATTAGATCCATATGCATTACAACCAT
PipaV28 5’ATA AAG ATC TAA GCT TCC CC
PipaD8 5’GGGG AAG CTT AGA TCT TTA TTA ATG TGC TGG TGC TGC TAA TGG TAA
TGG TAA TGG TTG TAA TGC AT 3’
PipaD9 5’GGA TGA TGT TCA ATA CCA ACA CGA ATA CCT AAA TCA CGT TCT GCT
GCT GCT TCT AAA AAA 3’
PipaD10 5’TTC AAA TGC AAA ACC AGT AGA ATC AAA AAC AGA TAA AGT ATC TTG
ACG ACC TGC TGC TGC 3’
PipaD11 5’GTG CTA ATT GTG GAC CTA AAC GAT CAG CAG ATA ATT GTT GAC ATT
CAC CTT CAC GTA ATG 3’
PipaD12 5’GTA ACA AAT GCA CGT TCT AAT AAA CCT AAT GGT AAT TCA GTT TTA
CCA ACT AAA TCT GCA 3’
PipaD13 5’ATG TTC ACG AAC ACC AGT ATC TGG TAA AAC TGG ACC TTG ACC AAC
TGC AAC AGA AGT TGC 3’
PipaD14 5’CTG CTG CAA TAC GTG CTG GTT CTG CAA TTT CAA CAG AAA CAC CAG
TAA ATG CTG CAC GAC 3’
PipaD15 5’GCT GGA TCA GTA TCC CAA ACT AAT GCA CGT TGT AAT GGT AAA ACT
AAA GAT AAT GCA TGC 3’
PipaD16 5’ACC AGT ACC AAT TAA ACC TAA AGT ATG AGA ATC TGG ACG TGC TAA
TAA ACG AGA TGC AAC 3’
PipaD17 5’GTA ATG CAG TTA ATA AAA CAC CAT CCA TTA ATG CAG TTA ATG CAC
CAG TAG TAT CAT CAT 3’
外部寡核苷酸：
PIPAV29 5’CTA TTT TAG GTA CCG TTG CA
PIPAD3 5’CCCAAGCTTAGATCTTTATTAATGTG
实施例4：
通过连接基因
rapL*进行总合成并获得变体
rapL**
大小为1029bp、来源于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、其序列已经被Schwecke等，1995，ibid公开的基因
rapL中G+C组成比例为68％。这个基因根据实施例3中合成基因
pipA*所使用的遗传密码作了改写。因此含改写序列SEQ ID No.2的基因
rapL*中G+C组成比例为38％。为了引入单限制性位点KpnI，苏氨酸残基97由ACC而不是表3中所提供的密码子ACT编码。还添加了两个翻译终止密码子TAA，并且在基因的5’和3’分别引入了单限制性位点
EcoRI和
NcoI以及
HindIII，以便将它插入到不同的克隆载体中。
基因
rapL*的总合成通过装配三个片段
EcoRI-
KpnI(305bp的片段1)、
KpnI-
PstI(316bp的片段2)和
PstI-
HindIII(440bp的片段3)进行。
通过将覆盖待克隆的整个序列(“有义”和“反义”链)并且重叠的平均为50个核苷酸长的单链寡核苷酸进行连接来合成每一片段，其中各寡核苷酸均是磷酸化的。这些寡核苷酸的序列和位点描述于表5中。在重叠缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8；0.08M NaCl)中以等摩尔的方式(1μM)混合各寡核苷酸至20μL总体积，在70℃加热10分钟，并留置在加热组件中直到它们恢复到室温。然后将这样得到的产物通过T4 DNA连接酶，在预先通过合适的限制性酶消化的载体pTZ18(载体/寡核苷酸摩尔浓度比1/100)存在的条件下，于16℃过夜连接。
连接产物用于通过电穿孔转化菌株β2033(
E.coli K12，
pro，thi，
rpsL，
hsdS，Δ
lacZ，F’(Δ
lacZM15，
lacI q，
traD36，
proA+，proB+))，并在含有100μg/mL氨苄青霉素、0.5mM IPTG和30μg/mLX-Gal的琼脂LB培养基上选择重组克隆。
利用质粒制备系统QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)分离数个白色的氨苄青霉素抗性转化子中含有的质粒。针对每个片段，对2到4个通过合适的限制性酶分析显示有预期大小片段的质粒中的插入片段进行测序。
片段1的合成：
将由
EcoRI和
KpnI切割的质粒pTZ18与下列寡核苷酸连接(其序列图示于表5中)：IcdV-1，IcdV-2，IcdV-3，IcdV-4，IcdV-5，IcdV-6，IcdVrev-16，IcdVrev-17，IcdVrev-18，IcdVrev-19，IcdVrev-20，IcdVrev-21，IcdVrev-22。保留质粒pSP3，其中插入片段的序列相对于预期序列仅具有两个差异。这两个误差根据公开的方法通过定点诱变校正(Ansaldi等，1996，ibid)，并且通过对所得质粒pSP14的插入片段进行序列分析来证实这种校正。
片段2的合成：
将由
KpnI和
PstI切割的质粒pTZ18与下列寡核苷酸连接(其序列图示于表5中)：IcdV-7，IcdV-8，IcdV-9，IcdV-10，IcdV-11，IcdV-12，IcdVrev-9，IcdVrev-10，IcdVrev-11，IcdVrev-12IcdVrev-13，IcdVrev-14，IcdVrev-15。保留质粒pSP8，其中插入片段的序列仅有一个差异。这个误差通过定点诱变校正(Ansaldi等，1996，ibid)，并且通过对所得质粒pSP15中的插入片段进行序列分析来证实这种校正。
片段3的合成：
将由
PstI和
HindIII切割的质粒pTZ18与下列寡核苷酸连接(其序列图示于表5中)：IcdV-13，IcdV-14，IcdV-15，IcdV-16，IcdV-17，IcdV-18，IcdV-19，IcdV-20，IcdV-21，IcdVrev-1，IcdVrev-2，IcdVrev-3，IcdVrev-4，IcdVrev-5，IcdVrev-6，IcdVrev-7，IcdVrev-8。保留质粒pSP12，其中插入片段的序列仅有一个25bp的缺失以及一个点差异。这两个误差通过定点突变校正(Ansaldi等，1996，ibid)，并且通过对所得质粒pSP26中的插入片段进行序列分析来证实这种校正。
3个片段的装配：随后将校正的
KpnI-
PstI片段、是PstI-
HindIII亚克隆到已含有
EcoRI-
KpnI片段的质粒pSP14中，从而重构建了合成基因
rapL*。所得质粒pSP33中基因
rapL*的序列通过测序证实。
变体rapL**的获得(序列SEQ ID No.5)：通过定点突变(Ansaldi等，1996，ibid)引入5个必要的改变，由质粒pSP33的基因
rapL*获得变体
rapL**，该5个改变使得基因
rapL**编码的蛋白与实施例2中所述的扩增并测序的基因所编码的蛋白相同，并与序列SEQ ID No.4相对应，同时符合表3中所述的遗传密码。这样获得了衍生自质粒pTZ18并且含有基因
rapL**的质粒pSP36。
表5：
合成基因rapL*的寡核苷酸序列
EcoRI-KpnI片段：
″有义″链：
IcdV-1： 5’-AATTCGAGGTTGCATGCAAACTAAAGTTTTATGTCAACGTGATATTAA-3’
IcdV-2： 5’p-ACGTATTTTATCTGTTGTT GGTCGTGATGTT ATG ATG GAT
CGT TTA ATT T-3’
IcdV-3： 5’p-CTGAAGTTCAT GCA GGT TTT GCA CGT TTA GGT
CGT GGT GAAACT GATGAA-3’
IcdV-4： 5’p-CCACCA CCA CGT CCA GGT TTT GCA CGT GGT
GGT GAT GTT CCAGGT GTTAT-3’
IcdV-5： 5’p-T GAA TTT ATG CCA CAT CGT GCA TCT GGT
ATT GGT GTTACT ATGAAA ACTG -3’
IcdV-6： 5’p-TT TCT TAT TCT CCA GAA AAT TTT GAA CGT
TTTAAT TTACCA ACT ATT GTT GGT AC-3’
Brin″反义″：
IcdVrev-16： 5’p-CAACAATAGTTGGTAAATTAAAA-3’
IcdVrev-17： 5’p-CGTTCAAAATTTTCTGGAGAATAAGAAACAGTTTTCATAGTAACACCAAT-
3’
IcdVrev-18： 5’p-ACCAGATGCACGATGTGGCATAAATTCAATAACACCTGGAACATCACCA-
3’
IcdVrev-19： 5’p-CCACGTGCAAAACCTGGACGTGGTGGTGGTTCATCAGTTTCACCACGACCT-
3’
IcdVrev-20： 5’p-
AAACGTGCAAAACCTGCATGAACTTCAGAAATTAAACGATCCATCATAAC-3’
IcdVrev-21： 5’p-ATCACGACCAACAACAGATAAAATACGTTTAATATCACGTTGA-3’
IcdVrev-22： 5’p-CATAAAACTTTAGTTTGCATGCAACCTCG-3’
片段KpnI-PstI：
″有义″链：
IcdV-7： 5’p-CGTTTCT CGT TTA GGT GAT GATTCT GGTTCT
ATG GTT GCA TTA GC-3’
IcdV-8： 5’p-A GAT GCA GCAACTATT ACT GCAATGCGTACT GGT
GCA GTT GCA TCT GTT A-3’
IcdV-9： 5’p-CT ACT CGT TTATTAGCACGTCCAGGT TCT ACT ACT
TTA GCA TTA ATT GGT -3’
IcdV-10： 5’p-GCA GGT GCACAA GCAGTTACT CAA GCA CAT
GCA TTA TCT CGT GTT TTA CC-3’
IcdV-11： 5’p-A TTA GAACGT ATTTTA ATTTCTGAT ATT AAA
GCA GAA CAT GCA GAA TCT T-3’
IcdV-12： 5’p-TTGCAGGTCGT GTT GCA TTTTTAGAA TTA CCA GTT
GAA GTT ACT GATGCAGCAACT GCA ATG GCA ACT
GCA-3’
″反义″链：
IcdVrev-9： 5’p-GTTGCCATTGCAGTTGCTGCATCAGTAACTTCAA-3’
IcdVrev-10：5’p-
CTGGTAATTCTAAAAATGCAACACGACCTGCAAAAGATTCTGCATGTTCTGCTTT-3’
IcdVrev-11：5’p-AATATCAGAAATTAAAATACGTTCTAATGGTAAAACACGAGATAATGCA-
3’
IcdVrev-12：5’p-
TGTGCTTGAGTAACTGCTTGTGCACCTGCACCAATTAATGCTAAAGTAGTA-3’
IcdVrev-13：5’p-
GAACCTGGACGTGCTAATAAACGAGTAGTAACAGATGCAACTGCACCAGT-3’
IcdVrev-14：5’p-ACGCATTGCAGTAATAGTTGCTGCATCTGCTAATGCAACC-3’
IcdVrev-15：5’p-ATAGAACCAGAATCATCACCTAAACGAGAAACGGTAC-3’
片段PstI-HindIII：
″有义″链：
IcdV-13： 5’p-GATGTTTTA TGT ACT GTT ACTTCTGTTCC-3’
IcdV-14： 5’p-A GTT GGT GGT GGT CCAGTTGTTCCA GCA GAA
CCA CGTCAAGCACAT TTA C-3’
IcdV-15： 5’p-AT GTT AAT GGT ATT GGT GCA GATGAACAAGGT
AAAACTGAA TTA CCA AAA -3’
IcdV-16： 5’p-GCATTA TTA GAT GAT GCA TTT ATT TGT
GTTGATCAT CCA GGT CAA GCA CG-3’
IcdV-17： 5’p-T GCA GAA GGT GAA TTT CAACAA
TTACCAGATCGTGAA TTA GGT CCA TCT T-3’
IcdV-18： 5’p-TA GCA GAT TTA TGT GCAGCACCAGAA ATT GCA
GCACCACAT CCA GAA CGT-3’
IcdV-19： 5’p- TTA TCT GTT TTTGATTCTACT GGT TCT GCA
TTT GCA GAT CATATTGCA TTA GAT GTTTTATTA-3’
IcdV-20： 5’p-GGT TTT GCA GAT GAA TTA GGT TTA GGT CAT
AAAATGTCTATT GAAT-3’
IcdV-21： 5’p-CTACT CCA GAA GAT GTT TTA GAT CCA TAT
TCT TTATAATAAAGATCTA-3’
″反义″链：
IcdVrev-1：5’p-
AGCTTAGATCTTTATTATAAAGAATATGGATCTAAAACATCTTCTGGAGTAGATT
CAATA GACATTTTATGAC-3’
IcdVrev-2：5’p-
CTAAACCTAATTCATCTGCAAAACCTAATAAAACATCTAATGCAATATGA-3’
IcdVrev-3：5’p-
TCTGCAAATGCAGAACCAGTAGAATCAAAAACAGATAAACGTTCTGGATG-3’
IcdVrev-4：5’p-TGGTGCTGCAATTTCTGGTGCTGCACATAAATCTGCTAAAGATGGACCT-
3’
IcdVrev-5：5’p-
AATTCACGATCTGGTAATTGTTGAAATTCACCTTCTGCACGTGCTTGACCT-3’
IcdVrev-6：5’p-GGATGATCAACACAAATAAATGCATCATCTAATAATGCTTTTGGTAATT-
3’
IcdVrev-7：5’p-
CAGTTTTACCTTGTTCATCTGCACCAATACCATTAACATGTAAATGTGCTT-3’
IcdVrev-8：5’p-
GACGTGGTTCTGCTGGAACAACTGGACCACCACCAACTGGAACAGAAGTAACAGT
ACATAAAACATCTGCA-3’
实施例5：基因
pipA*在大肠杆菌中的过表达
将基因
pipA*克隆到载体pQE60(QIAGEN)(其编码序列如上所示被预先修饰的质粒)中，在基于实施例3中构建的质粒pSP43的限制性位点NcoI和HindIII之间。基于辅助质粒pREP4(QIAGEN)，将产生的质粒pSP47引入到表达基因IacI的菌株E.coli K12 MG1655(Vidal等，1998)中。这样获得的菌株+75在LB培养基中培养，并且根据厂商的说明书通过添加IPTG诱导基因
pipA*的表达。通过聚丙烯酰胺/凝胶电泳分离细胞的总蛋白，并用考马斯亮兰染色。检测到分子量为36kD的蛋白，并且它的表达率据估计大约为总蛋白的5％。
实施例6：基因
pipA，
rapL，
rapL*和
rapL**在大肠杆菌中的过表达
进程如实施例5所述，通过引入质粒pKT37获得过表达基因
pipA的大肠杆菌菌株(菌株+353)。通过将感兴趣基因克隆到载体pQE60的限制性位点
NcoI和
HindIII之间，从实施例1中所述的质粒pKT36获得该质粒。
相似地，通过分别引入质粒pSP32、pSP37或pSP45，获得过表达基因
rapL(菌株 +38)、
rapL*(菌株 +60)或
rapL**(菌株+73)的大肠杆菌菌株。这些质粒pSP32、pSP37或pSP45通过在载体pQE70限制性位点
SphI和
HindIII之间克隆感兴趣基因而分别来自于实施例2和4中描述的质粒pKT30、pSP33或pSP36。
这些不同蛋白的表达率如实施例5所述测定。对于每个菌株，检测到具有预期分子量的蛋白，表达率大约为总蛋白的5％。
实施例7：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
ocd基因的PCR扩增及其在大肠杆菌中的过表达
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CIP 104333质粒Ti-C58的制备如别处所述(Hayman等，Mol.Gen.Genet.，
223，(1990)，465-473)。ocd gene(Sans等，(1988)，ibid)从质粒Ti-C58的制备物中通过PCR扩增。
反应在总体积为50μL的20mM Tris-HCl pH 8.8缓冲液中进行，该缓冲液中含10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，2ng质粒Ti-C58，4种dNTP各200μM，1单位的Vent DNA聚合酶(BioLabs)以及下列两种寡脱氧核糖核苷酸各500nM：
5’CCCGCATGCCTGCACTTGCCAACC
5’CCCAGATCTTAACCACCCAAACGTCGGAAA
应用的PCR操作以94℃2分钟的变性步骤开始，然后按94℃变性30秒、52℃杂交30秒、72℃延伸1分30秒的次序进行30个循环。这个操作以72℃延伸10分钟的步骤结束。
这样扩增的片段用
NcoI和
BglII消化，并克隆到预先切开的载体pQE70(QIAGEN)(其编码序列如上所示被预先修饰的质粒)中。
对这样获得的质粒pKR7的
NcoI和
BglII片段测序。所确定的蛋白相对于发表的序列(Sans等，(1988)，ibid)具有两个氨基酸的差别，即残基Gln212被赖氨酸取代，而残基Ile297被亮氨酸取代。这两个差异通过对独立获得的PCR扩增产物进行序列分析来确认。
按照如实施例5所述的进程，通过引入质粒pKR7获得过表达ocd基因的大肠杆菌菌株(菌株+78)。ocd基因编码的蛋白的表达率如实施例5所述进行测定。检测到分子量与预期一致的蛋白，表达率大约为总蛋白的5％。
实施例8：通过大肠杆菌重组菌株的细胞悬浮液由L-赖氨酸制备L-哌啶酸
将实施例5中构建的菌株+75在矿质培养基MS(Richaud等，J.Biol.Chem.，
268，(1993)，26827-35)中培养，其中含有2g/L葡萄糖，50mg/L氨苄青霉素和30mg/L卡那霉素。在14小时培养结束时，向含2g/L葡萄糖的400mL矿质培养基MS中以1/10比例接种菌株+75的预培养物。该培养物被置于37℃搅动直至OD600nm达到0.7。然后通过向200mL培养物中加入1mM IPTG而在37℃诱导基因
pipA*4小时。还制备了没有添加IPTG的200mL参照培养物。在这个步骤结束时，两个培养物以13000g离心，细胞沉淀溶解在矿质培养基MS中，从而将细胞浓缩100倍。然后细胞通过在-20℃冻/融两步进行通透化处理，以利于底物接近酶。然后向细胞悬浮液中加入L-赖氨酸单盐酸(pH＝7)至终浓度1M(终体积＝2mL)。酶反应在37℃搅动下进行。在20个小时后，取出每种培养物的300μL样品，以13000g离心，从而回收上清。然后将上清的稀释液上样到硅胶薄层上，并同时用HPLC分析。
在经IPTG诱导的培养物中检测到具有色谱迁移(Rf＝0.22；CMC中洗脱液：丁醇/乙酸/水4/1/1)并且被茚三酮着色的不能与L-哌啶酸区分的化合物，而在未诱导的参照培养物中没有检测到。
HPLC分析(条件描述如下)显示在20个小时后，L-哌啶酸盐的浓度为40g/L。对映异构体过量95％以上。
L-赖氨酸制备L-哌啶酸的测试用实施例6和7中构建的菌株+38、+60、+73、+78和+353，在与上文应用于菌株+75相同的条件下进行。在茚三酮染色之后，通过对各自的上清进行薄层硅胶层析分析揭示仅仅菌株+73、+78和+353产生L-哌啶酸。
所用的HPLC方法的说明：
-Phenomenex Synergi Polar-RP-80 4μ(250×4.6mm)柱恒温器控制在30℃，
-在210nm紫外检测
-样品注入量：10μL
-用0.05％TFA水溶液等度洗脱5分钟，接着用水中的80％乙腈和0.05％TFA洗涤柱子，
-保留时间：赖氨酸2.98分钟，而哌啶酸4.62分钟
实施例9：由L-硫代赖氨酸制备L-硫代吗啉-2-羧酸
L-硫代吗啉-2-羧酸的制备是在如实施例8所述制备的菌株+75的细胞悬浮液基础上进行的。以1M的终浓度添加L-硫代赖氨酸(S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)(SIGMA)。对温育悬浮液的上清进行薄层硅胶层析，揭示了一个具有迁移(Rf＝0.28；洗脱液：丁醇/乙酸/水4/1/1)、并且被茚三酮染色、与L-硫代赖氨酸和L-哌啶酸截然不同的化合物。
在相同的条件下，实施例7中描述的菌株+78产生与菌株+75相同的化合物。
实施例10：由L-和D-5-(R，S)羟赖氨酸混合物制备5-R-和5-S-羟基-L-哌啶酸混合物
5-R-和5-S-羟基-L-哌啶酸混合物的制备是在如实施例8所述制备的菌株+75的细胞悬浮液基础上进行的。以1M的终浓度添加5-R，S-羟基-D，L-赖氨酸(SIGMA)。对温育悬浮液的上清进行薄层硅胶层析，揭示了两个等比例存在、具有迁移(Rf1＝0.14，Rf2＝0.20；洗脱液：丁醇/乙酸/水4/1/1)、并且被茚三酮染色、与5-R，S-羟基-D，L-赖氨酸和L-哌啶酸截然不同的化合物。
在相同的条件下，实施例7中描述的菌株+78产生两个与菌株+75相同的化合物。
实施例11：其他环状氨基酸的制备
本发明方法的强大多功能性可以利用实施例8中所描述的操作模式通过修饰起始二氨基酸的性质获得的下述环状氨基酸加以阐释。
| L-二氨基酸 | 环状L-氨基酸 |
| 2，6-二氨基庚二酸 | 哌啶-2，6-庚二酸 |
| 2，6-二氨基-5-羟基己酸 | 5-羟基哌啶-2-羧酸 |
| 2-氨基-3-(2-氨乙基硫基)丙酸(2-amino-3-(2-aminoethylsulphanyl)propanoic acid) | 硫代吗啉-3-羧酸 |
| 氮杂赖氨酸(β-N-2-氨乙基-α，β-二氨基丙酸 | 哌嗪-2-羧酸 |
序列表
<110>Rhodia
<120>环状L-氨基酸的立体选择性制备
<130>BFF 00/0696
<140>
<141>
<160>5
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1097
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成基因pipA*的核酸序列
<400>1
gaattcgagg ttccatggaa acttgggttt taggtcgtcg tgatgttgca gaagttgttg 60
cagcagttgg tcgtgatgaa ttaatgcgtc gtattatcga tcgtttaact ggtggtttag 120
cagaaattgg tcgtggtgaa cgtcatttat ctccattacg tggtggttta gaacgttctg 180
aaccagttcc aggtatttgg gaatggatgc cacatcgtga accaggtgat catattactt 240
taaaaactgt tggttattct ccagcaaatc caggtcgttt tggtttacca actattttag 300
gtaccgttgc acgttatgat gatactactg gtgcattaac tgcattaatg gatggtgttt 360
tattaactgc attacgtact ggtgcagcat ctgctgttgc atctcgttta ttagcacgtc 420
cagattctca tactttaggt ttaattggta ctggtgcaca agcagttact caattgcatg 480
cattatcttt agttttacca ttacaacgtg cattagtttg ggatactgat ccagcacatc 540
gtgaatcttt tgcacgtcgt gcagcattta ctggtgtttc tgttgaaatt gcagaaccag 600
cacgtattgc agcagaagca gatgttattt ctactgcaac ttctgttgca gttggtcaag 660
gtccagtttt accagatact ggtgttcgtg aacatttaca tattaatgca gttggtgcag 720
atttagttgg taaaactgaa ttaccattag gtttattaga acgtgcattt gttactgcag 780
atcatccaga acaagcatta cgtgaaggtg aatgtcaaca attatctgct gatcgtttag 840
gtccacaatt agcacattta tgtgcagatc cagcagcagc agcaggtcgt caagatactt 900
tatctgtttt tgattctact ggttttgcat ttgaagatgc attagcaatg gaagtttttt 960
tagaagcagc agcagaacgt gatttaggta ttcgtgttgg tattgaacat catccaggtg 1020
atgcattaga tccatatgca ttacaaccat taccattacc attagcagca ccagcacatt 1080
aataaagatc taagctt 1097
<210>2
<211>1061
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成基因rapL*的核酸序列
<400>2
gaattcgagg ttgcatgcaa actaaagttt tatgtcaacg tgatattaaa cgtattttat 60
ctgttgttgg tcgtgatgtt atgatggatc gtttaatttc tgaagttcat gcaggttttg 120
cacgtttagg tcgtggtgaa actgatgaac caccaccacg tccaggtttt gcacgtggtg 180
gtgatgttcc aggtgttatt gaatttatgc cacatcgtgc atctggtatt ggtgttacta 240
tgaaaactgt ttcttattct ccagaaaatt ttgaacgttt taatttacca actattgttg 300
gtaccgtttc tcgtttaggt gatgattctg gttctatggt tgcattagca gatgcagcaa 360
ctattactgc aatgcgtact ggtgcagttg catctgttac tactcgttta ttagcacgtc 420
caggttctac tactttagca ttaattggtg caggtgcaca agcagttact caagcacatg 480
cattatctcg tgttttacca ttagaacgta ttttaatttc tgatattaaa gcagaacatg 540
cagaatcttt tgcaggtcgt gttgcatttt tagaattacc agttgaagtt actgatgcag 600
caactgcaat ggcaactgca gatgttttat gtactgttac ttctgttcca gttggtggtg 660
gtccagttgt tccagcagaa ccacgtcaag cacatttaca tgttaatggt attggtgcag 720
atgaacaagg taaaactgaa ttaccaaaag cattattaga tgatgcattt atttgtgttg 780
atcatccagg tcaagcacgt gcagaaggtg aatttcaaca attaccagat cgtgaattag 840
gtccatcttt agcagattta tgtgcagcac cagaaattgc agcaccacat ccagaacgtt 900
tatctgtttt tgattctact ggttctgcat ttgcagatca tattgcatta gatgttttat 960
taggttttgc agatgaatta ggtttaggtc ataaaatgtc tattgaatct actccagaag 1020
atgttttaga tccatattct ttataataaa gatctaagct t 1061
<210>3
<211>355
<212>PRT
<213>始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)
<220>
<223>基因pipA的蛋白序列
<400>3
Met Glu Thr Trp Val Leu Gly Arg Arg Asp Val Ala Glu Val Val Ala
1 5 10 15
Ala Val Gly Arg Asp Glu Leu Met Arg Arg Ile Ile Asp Arg Leu Thr
20 25 30
Gly Gly Leu Ala Glu Ile Gly Arg Gly Glu Arg His Leu Ser Pro Leu
35 40 45
Arg Gly Gly Leu Glu Arg Ser Glu Pro Val Pro Gly Ile Trp Glu Trp
50 55 60
Met Pro His Arg Glu Pro Gly Asp His Ile Thr Leu Lys Thr Val Gly
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Ala Arg Phe Gly Leu Pro Thr Ile Leu Gly
85 90 95
Thr Val Ala Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met
100 105 110
Asp Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Arg Thr Gly Ala Ala Ser Ala Val
115 120 125
Ala Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro Asp Ser His Thr Leu Gly Leu Ile
130 135 140
Gly Thr Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Leu His Ala Leu Ser Leu Val
145 150 155 160
Leu Pro Leu Gln Arg Ala Leu Val Trp Asp Thr Asp Pro Ala His Arg
165 170 175
Glu Ser Phe Ala Arg Arg Ala Ala Phe Thr Gly Val Ser Val Glu Ile
180 185 190
Ala Glu Pro Ala Arg Ile Ala Ala Glu Ala Asp Val Ile Ser Thr Ala
195 200 205
Thr Ser Val Ala Val Gly Gln Gly Pro Val Leu Pro Asp Thr Gly Val
210 215 220
Arg Glu His Leu His Ile Asn Ala Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys
225 230 235 240
Thr Glu Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Arg Ala Phe Val Thr Ala Asp
245 250 255
His Pro Glu Gln Ala Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Gln Leu Ser Ala
260 265 270
Asp Arg Leu Gly Pro Gln Leu Ala His Leu Cys Ala Asp Pro Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Gly Arg Gln Asp Thr Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Phe
290 295 300
Ala Phe Glu Asp Ala Leu Ala Met Glu Val Phe Leu Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Glu Arg Asp Leu Gly Ile Arg Val Gly Ile Glu His His Pro Gly Asp
325 330 335
Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Leu Gln Pro Leu Pro Leu Pro Leu Ala Ala
340 345 350
Pro Ala His
355
<210>4
<211>343
<212>PRT
<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
<220>
<223>基因rapL的蛋白序列
<400>4
Met Gln Thr Lys Val Leu Cys Gln Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser
1 5 10 15
Val Val Gly Arg Asp Val Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Val His
20 25 30
Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro
35 40 45
Arg Thr Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Val Pro Gly Val Ile Glu Phe
50 55 60
Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Val Thr Met Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Gln Asn Phe Glu Arg Phs Asn Leu Pro Thr Ile Val Gly
85 90 95
Thr Val Ser Arg Leu Asp Asp Asp Ser Gly Ser Met Val Ala Leu Ala
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Val Ala Ala Val
115 120 125
Ala Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile
130 135 140
Gly Ala Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu Ser Arg Val
145 150 155 160
Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Glu His Ala
165 170 175
Glu Ser Phe Ala Gly Arg Val Ala Phe Leu Glu Leu Pro Vai Glu Val
180 185 190
Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Val Leu Cys Thr Val
195 200 205
Thr Ser Val Pro Val Gly Gly Gly Pro Val Val Pro Ala Glu Pro Arg
210 215 220
Gln Ala His Leu His Val Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gln Gly Lys
225 230 235 240
Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Val Asp
245 250 255
His Pro Gly Gln Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gln Gln Leu Pro Asp
260 265 270
Arg Glu Leu Gly Pro Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Ser
290 295 300
Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Val Leu Leu Gly Phe Ala Asp
305 310 315 320
Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp
325 330 335
Val Leu Asp Pro Tyr Ser Leu
340
<210>5
<211>1061
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成基因rapL**的核酸序列
<400>5
gaattcgagg ttgcatgcaa actaaagttt tatgtcaacg tgatattaaa cgtattttat 60
ctgttgttgg tcgtgatgtt atgatggatc gtttaatttc tgaagttcat gcaggttttg 120
cacgtttagg tcgtggtgaa actgatgaac caccaccacg tactggtttt gcacgtggtg 180
gtgatgttcc aggtgttatt gaatttatgc cacatcgtgc atctggtatt ggtgttacta 240
tgaaaactgt ttcttattct ccacaaaatt ttgaacgttt taatttacca actattgttg 300
gtaccgtttc tcgtttagat gatgattctg gttctatggt tgcattagca gatgcagcaa 360
ctattactgc aatgcgtact ggtgcagttg cagcagttgc aactcgttta ttagcacgtc 420
caggttctac tactttagca ttaattggtg caggtgcaca agcagttact caagcacatg 480
cattatctcg tgttttacca ttagaacgta ttttaatttc tgatattaaa gcagaacatg 540
cagaatcttt tgcaggtcgt gttgcatttt tagaattacc agttgaagtt actgatgcag 600
caactgcaat ggcaactgca gatgttttat gtactgttac ttctgttcca gttggtggtg 660
gtccagttgt tccagcagaa ccacgtcaag cacatttaca tgttaatggt attggtgcag 720
atgaacaagg taaaactgaa ttaccaaaag cattattaga tgatgcattt atttgtgttg 780
atcatccagg tcaagcacgt gcagaaggtg aatttcaaca attaccagat cgtgaattag 840
gtccatcttt agcagattta tgtgcagcac cagaaattgc agcaccacat ccagaacgtt 900
tatctgtttt tgattctact ggttctgcat ttgcagatca tattgcatta gatgttttat 960
taggttttgc agatgaatta ggtttaggtc ataaaatgtc tattgaatct actccagaag 1020
atgttttaga tccatattct ttataataaa gatctaagct t 1061
Claims (20)
1.制备结构式(I)的环状L-氨基酸、或其盐或衍生物的方法：
其中：
*R1选自氢原子、具有1到6个碳原子的直链或支链烷基、以及具有1到6个碳原子的直链或支链酰基；且
*X代表饱和的、或者部分或全部不饱和的直链或支链C1-C9烃链，优选C2-C4烃链，其中任选地在链中和/或链末端包含选自O、S、P、NR2中的一个或数个杂原子或杂基团，其中R2代表H或C1-C4烷基或酰基，所说的链还任选地被一或多个选自-R，-OR，-SR，＝O，-C(O)OR，-C(S)OR，-C(O)NR’R″，-C(S)NR’RR”，-CN，-NO2，-X，-MgX，-NR’R″，-NR’C(O)R，-SiR和-SiOR中的相同或不同基团取代，其中R、R’和R″相同或不同，各自代表氢原子、或者直链或支链、饱和的或者全部或部分不饱和的具有从2到20个碳原子的烃基，应当理解R’和R″可以与携带它们的原子成环，
其特征在于：
a)使结构式(II)的L-二氨基酸：
其中X和R1如上定义；
或者其盐或衍生物，
或者是以可变比例包括结构式(II)的L-二氨基酸和相应的D-二氨基酸、其盐或衍生物的对映异构体混合物，优选是在水性介质中，
在存在鸟氨酸环化脱氨酶、或鸟氨酸环化脱氨酶的同源多肽时反应，该酶或同源多肽获自于表达所说的酶或同源多肽的重组表达载体，
b)回收结构式(I)的环状L-氨基酸或其盐或衍生物，其中对映异构体过量至少80％。
2.如权利要求1中所要求保护的方法，特征在于结构式(I)的化合物包括具有6个键的环，X代表具有4个键的烃链。
3.如权利要求1或2中所要求保护的方法，特征在于烃链X是直链或支链亚烷基链。
4.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于将结构式(II)的化合物或者以可变比例包括结构式(II)L-二氨基酸和相应D-氨基酸的对映异构体混合物置于存在纯化状态的酶的条件下。
5.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于通式(I)的化合物以铵盐的形式存在于水性溶液中。
6.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于由L-赖氨酸制备L-哌啶-2-羧酸或其一种盐。
7.如权利要求1、2、4或5中任何一项所要求保护的方法，特征在于由L-氮杂赖氨酸制备L-哌嗪-2-羧酸或它的一种盐。
8.如权利要求1、2、4或5中任何一项所要求保护的方法，特征在于由L-硫代赖氨酸制备L-硫代吗啉-2-羧酸或它的一种盐。
9.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于所述酶是土壤杆菌(Agrobacterium)的鸟氨酸环化脱氨酶或者具有与所说的鸟氨酸环化脱氨酶类似活性的肽。
10.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于鸟氨酸环化脱氨酶是土壤杆菌C58菌株的鸟氨酸环化脱氨酶。
11.如权利要求1到9中任何一项所要求保护的方法，特征在于所述酶是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58的ocd基因或者始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)的pipA基因或者吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的rapL基因或者同源基因在宿主微生物中表达的重组酶。
12.如权利要求11中所要求保护的方法，特征在于重组酶表达于大肠杆菌中。
13.如权利要求12中所要求保护的方法，特征在于重组酶是通过表达天然鸟氨酸环化脱氨酶的修饰基因获得的，该修饰基因中一些G或C碱基被A或T碱基取代，从而获得与天然密码子编码相同氨基酸的经修饰密码子。
14.如权利要求13中所要求保护的方法，特征在于修饰基因中G+C碱基少于65％，优选地少于55％。
15.如权利要求12到14中任何一项所要求保护的方法，特征在于修饰基因是序列SEQ ID No.1的基因
pipA*、或者序列SEQ ID No.2的基因
rapL*、或者序列SEQ ID No.5的基因
rapL**。
16.如前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，特征在于不向反应介质中添加外源NAD。
17.包括序列SEQ ID No.1的多核苷酸。
18.包括序列SEQ ID No.2的多核苷酸。
19.包括序列SEQ ID No.5的多核苷酸。
20.结构式(I)的化合物、或者其盐或衍生物：
其中：
*R1选自氢原子、具有1到6个碳原子的直链或支链烷基、以及具有1到6个碳原子的直链或支链酰基；且
*X代表饱和的、或者部分或全部不饱和的、直链或支链C1-C9烃链，优选C2-C4烃链，任选地在链中和/或链末端包含选自O、S、P、NR2中的一个或数个杂原子或杂基团，其中R2代表H或C1-C4烷基或酰基，所说的链还任选地被选自-R，-OR，-SR，＝O，-C(O)OR，-C(S)OR，-C(O)NR’R″，-C(S)NR’RR”，-CN，-NO2，-X，-MgX，-NR’R″，-NR’C(O)R，-SiR和-SiOR中的一个或数个相同或不同的基团取代，其中R、R’和R″相同或不同，并且代表氢原子、或者直链或支链、饱和的、或者全部或部分不饱和的具有从2到20个碳原子的烃基，应当理解R’和R″可以与携带它们的原子成环，
其基本上是通过如权利要求1到16中任何一项所要求保护的方法获得的。
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