FR2825717A1 - Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule I, (CF DESSIN DANS BOPI) caractérisé en ce que a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule II (CF DESSIN DANS BOPI) ou un mélange énantiomère comprenant un tel L-acide diaminé et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables, en milieu aqueux en présence d'une ornithine cyclodéaminase ou d'un polypeptide homologue à l'ornithine cyclodéaminase.

Description

<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne la préparation stéréosélective de L-acides aminés cycliques ou de leurs sels et dérivés.
Il existe une demande grandissante d'acides aminés cycliques notamment la L-proline, l'acide L-pipécolique ou l'acide L-pipérazine-2carboxylique et leurs sels en raison de leur utilisation pour la synthèse de nouveaux médicaments. Etant donné qu'il s'agit de molécules chirales, les synthèses en sont difficiles.
D'un point de vue biosynthétique, seule la formation du cycle de la L-proline a été élucidée et décrite. Elle peut s'effectuer selon deux voies : soit par cyclisation de l'acide glutamique semialdéhyde pour former l'acide L'l1-pyrroline-5-carboxylique, suivie d'une réduction du cycle insaturé ; soit directement à partir de la L-ornithine par cyclodéamination.
Toutefois, ces procédés n'apportent pas de solution satisfaisante pour la synthèse des acides aminés cycliques chiraux à l'échelle industrielle.
Par ailleurs, une activité enzymatique de conversion directe de la L-ornithine en L-prolin a été décrite pour la première fois chez Clostridium (Costilow et al., 1971 ; Muth et al., 1974) et une conversion totale de 20 mM de L-ornithine en L-prolin a été obtenue in vitro en présence de l'enzyme partiellement purifiée. Cette ornithine cyclodéaminase (OCD) de Clostridium possède la particularité d'être activée par le NAD, un cofacteur impliqué habituellement dans les réactions d'oxydation, et semble être assez instable lorsqu'elle est purifiée. Elle n'agit pas sur la D-ornithine, par contre elle est inhibée en présence de 40 mM de D-ornithine, tandis qu'en présence de 40 mM de L-Lysine son activité n'est pas réduite. La possibilité que la cyclodéaminase agisse sur la L-Lysine n'a ainsi même pas été envisagée par ces auteurs, probablement parce qu'il est très souvent admis que les enzymes du métabolisme sont très spécifiques.
Quelques années plus tard, la corrélation entre l'expression d'un gène d'Agrobacterium impliqué dans la dégradation de la opaline et une activité OCD a été établie (Sans et al., 1988), et le gène codant pour OCD a alors été séquencé.
<Desc/Clms Page number 2>
Figure img00020001
Un deuxième gène très homologue a par la suite été trouvé dans une autre souche d'Agrobacterium par les mêmes auteurs (Schindier et al., 1989). Les propriétés des deux cyclodéaminases ont été étudiées et seule une activité sur la L-ornithine a été mise en évidence. Ainsi, de nouveau la possibilité que la L-Lysine soit un substrat de la cyclodéaminase n'a pas été envisagée, seul son effet inhibiteur a été examiné (Schindler et al., 1989).
Depuis, le séquençage total ou partiel de nombreux organismes a permis d'identifier plusieurs nouveaux gènes ayant une homologie forte avec ce gène ocd d'Agrobactérium. Cependant, ni l'activité enzymatique du polypeptide codé par chacun de ces gènes, ni son spectre d'activité n'ont été étudiées, cette enzyme étant réputée spécifique de l'ornithine. En particulier la spécificité de ces enzymes et leur niveau d'activité catalytique restent inconnus alors que ce sont des éléments déterminants pour la productivité d'un procédé enzymatique.
Pour trois de ces gènes trouvés chez des Streptomyces producteurs de métabolites dérivés de l'acide L-pipécolique, une activité Lysine cyclodéaminase pour le polypeptide codé a été postulée (WO 96/01901-A1, Khaw et al., 1998, Molnar et al., Motamedi et al., 1998).
Ainsi, il a été suggéré qu'une cyclodéaminase codée par le gène rapL (Khaw et al., 1998) ou pipA (WO 9601901-A1) pourrait être impliquée dans la voie de synthèse de la Rapamycine via une transformation de la lysine en acide pipécolique. A ce jour, même si elle été parfois suggérée obiter dictum, aucune activité de cyclodéamination de L-Lysine en acide Lpipécolique n'a toutefois été mise en évidence, exemplifiée, ou quantifiée.
Cette méconnaissance de la réaction réellement catalysée par ces gènes est démontrée par la diversité des hypothèses sur la voie biologique menant à l'acide pipécolique par certains de ces auteurs qui relatent également dans ces publications que la conversion de Lysine en acide pipécolique pourrait se faire via la D-Lysine (Khaw et al., 1998). D'autres études biochimiques ont décrit la formation d'acide L-pipécolique à partir d'acide a-aminoadipique par réduction d'un cycle insaturé (Aspen et al., 1962) chez Aspergillus et, sur la base d'expériences de marquages isotopiques, de telles voies de biosynthèse
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avaient été également proposées chez un Streptomyces par les hommes de l'art (Reed et al., 1989).
Le fait que les enzymes de biosynthèse de la L-proline, et en particulier l'ornithine cyclodéaminase, n'aient pas été proposées pour fabriquer de nouveaux acides aminés cycliques constitue une preuve supplémentaire que de l'opinion générale des hommes de métier, il n'était pas possible de réaliser la biosynthèse de l'acide pipécolique de cette façon. Ainsi plusieurs procédés biotechnologiques de bioconversion conduisant aux formes énantiomériquement pures, et plus particulièrement à la forme L, de l'acide pipécolique ou de l'acide pipérazine-2-carboxylique ont été protégés par des brevets depuis quelques années. Les exemples figurant dans ces publications font état d'une production maximale de 15 g/t de l'acide aminé cyclique : Aucune mention n'a été trouvée de l'emploi d'une cyclodéaminase.
Tous ces documents, à l'exception d'un seul, décrivent la résolution d'un substrat racémique. Ils emploient des activités de type Nacylase (WO 95/10604, WO 99/07873), amidase (EP 0 686 698-A), aminoacide oxydase (JP 06030789), nitrilase (JP 06038781, JP 11127885) ou esterase (WO 00/12745) agissant sur des substrats adéquats..
L'ensemble de ces méthodes comporte par ailleurs un certain nombre d'inconvénients parmi lesquels on peut citer une limitation du rendement maximal à 50% sur le mélange racémique, la nécessité d'une séparation du produit ainsi formé et du substrat non transformable par l'enzyme pour récupérer la forme énantiomérique recherchée, et la nécessité du développement éventuel d'un recyclage de l'autre forme énantiomérique. Seul JP 06030781 décrit la conversion de la L-lysine, un substrat chiral commercialement disponible et peu onéreux, en acide L-pipécolique par divers isolats bactériens non-recombinants mais sans la séquence de réactions chimiques empruntée pour effectuer cette bioconversion. Les performances, en termes de rendement et de productivité, mentionnées dans ce document-à savoir une production en 7 jours d'environ 4,2 g/) d'acide L-pipécolique à partir de 10 g/) de L-Lysine-restent tout à fait insuffisantes pour qu'un tel procédé soit avantageux et économiquement compétitif.
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La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de convertir avec des rendements élevés des solutions concentrées d'acides diaminés en des solutions d'acides a-imino-cycliques, notamment en solution aqueuse de sels d'ammonium d'acides a-imino-cycliques, en mettant en oeuvre une enzyme codée par le gène de l'ornithine cyclodéaminase (EC 4.3. 1.12) de la souche d'Agrobacterium C58 ou par un gène homologue à celui-ci, ou des microorganismes recombinants surproduisant de telles enzymes.
L'invention a pour objet un procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule 1 ou d'un sel ou dérivé d'un acide aminé de formule
Figure img00040001

1 :
Figure img00040002

dans laquelle R1 représente H ou un groupe alkyle en C1-C6 ou acyle en Ci-Ce et X représente une chaîne hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée en Cz-Cg, de préférence en C2-C4, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi 0, S, NR2, R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en C1-C4, et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy, amino, ou halogéné, caractérisé en ce que a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule Il :
Figure img00040003

dans laquelle X et Ri sont tels que définis ci-dessus ; ou un sel ou dérivé de celui-ci,
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ou un mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables, en milieu aqueux en présence d'une ornithine cyclodéaminase ou d'un polypeptide homologue à l'ornithine cyclodéaminase, sous réserve que lorsque l'enzyme est l'ornithine cyclodéaminase native de Clostridium ou d'Agrobacterium le composé de formule Il n'est pas la L-ornithine, et sous réserve que lorsque le composé de formule générale Il est la L-lysine, celle-ci n'est pas mise en présence de microorganismes vivants et non recombinants appartenant aux genres Alcaligenes, Providencia, Protes, Bacillus, Agrobacterium, Morganella ou Planococcus ; et b) l'on récupère le L-acide aminé cyclique de formule 1 ou un sel ou dérivé de celui-ci en un excès énantiomérique d'au moins 80 %.
Par dérivé d'acide aminé de formule 1 ou Il , on entend un amide ou ester de ceux-ci.
L'ornithine cyclodéaminase à laquelle on se réfère dans la suite du texte est l'ornithine cyclodéaminase (EC 4.3. 1.12) de la souche d'Agrobacterium C 58.
L'ornithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium, codée par un gène porté par le plasmide TiC58, est décrite par Sans et al., 1988, et sa séquence polypeptidique est également accessible sur Genbank (gi : 68365).
Par polypeptide homologue à l'ornithine cyclodeaminase, on entend les polypeptides ayant une séquence d'acides aminés homologues à celle d'une ornithine cyclodeaminase, notamment celle de la souche C58 d'Agrobacterium.
Ces séquences homologues peuvent être définies comme les séquences similaires à au moins 25 % de la séquence d'acides aminés du gène ocd d'Agrobacterium et ayant une activité d'ornithine cyclodeaminase telle que décrite par Costilow et al. 1971.
Le terme"similaires"se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une
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séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence d'acides aminés de l'ornithine cyclodeaminase codée par le gène ocd d'Agrobacterium par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique du polypeptide codé.
Avantageusement, une telle séquence d'acides aminés homologue est similaire à au moins 35 % de la séquence du polypeptide codé par le gène ocd d'Agrobacterium, de préférence au moins 45 %.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wi 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i. e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
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Ces polypeptides ont en commun de présenter une activité d'acide a-5 ou a-s diaminés-déaminase, sans que celle-ci ait nécessairement été établie jusqu'à présent.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium trouvés chez les microorganismes appartenant aux genres Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium,
Figure img00070001

Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus, et Streptomyces.
On peut citer en particulier les séquences des polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium trouvés chez les espèces ou souches listées dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1 : Microorganismes ayant des séquences de polypeptides homologues à celle de l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium
Figure img00070002
<tb>
<tb> Numéro <SEP> Genbank <SEP> (gi <SEP> : <SEP> ) <SEP> du
<tb> Souche <SEP> ou <SEP> espèce
<tb> polypeptide <SEP> homologue
<tb> -Aeropyrum <SEP> pernix <SEP> (strain <SEP> K1) <SEP> 7521229
<tb> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 1066073
<tb> - <SEP> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> plasmide <SEP> pAtK84b, <SEP> 11269716 <SEP> (fragment)
<tb> - <SEP> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> plasmide <SEP> pTiAch5, <SEP> 2498689
<tb> - <SEP> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> plasmide <SEP> pTiC58,68365
<tb> - <SEP> Archaeoglobus <SEP> fulgidus, <SEP> 11499255
<tb> - <SEP> Brucel/a <SEP> melitensis <SEP> biovar <SEP> bortus, <SEP> 1354828
<tb> - <SEP> Corynebacterium <SEP> glutamicum, <SEP> 4127671
<tb> - <SEP> Halobacterium <SEP> sp. <SEP> NRC-1,10581639 <SEP> (ocd1)
<tb> 10580873 <SEP> (ocd2)
<tb> - <SEP> Mesorhizobium <SEP> loti, <SEP> 13472795
<tb> - <SEP> Mesorhizobium <SEP> loti, <SEP> 13472097
<tb> -Mesorhizobium <SEP> loti <SEP> 13475945
<tb> - <SEP> Mesorhizobium <SEP> loti, <SEP> 13475655
<tb> - <SEP> Mesorhizobium <SEP> loti, <SEP> 13471680
<tb> - <SEP> Methanobacterium <SEP> thermoautotrophícum <SEP> (strain <SEP> Delta <SEP> H), <SEP> ou <SEP> 7482770
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
Figure img00080001
<tb>
<tb> Methanothermobacter <SEP> thermautotrophicus
<tb> - <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> (strain <SEP> PA01), <SEP> 11350019 <SEP> (ocd <SEP> 1)
<tb> 11350319 <SEP> (ocd2)
<tb> - <SEP> Y4tK <SEP> Rhizobium <SEP> sp. <SEP> NGR234,2182641
<tb> - <SEP> Rhizobium <SEP> ou <SEP> Sinorhizobium <SEP> melifoti, <SEP> 420888
<tb> - <SEP> Rhodobacter <SEP> capsulatus, <SEP> 7437141
<tb> - <SEP> Schizosaccharomyces <SEP> pombe, <SEP> 12044475
<tb> - <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> 13700033
<tb> - <SEP> Streptomyces <SEP> hygroscopicus, <SEP> 7481884
<tb> - <SEP> Streptomyces <SEP> hygroscopicus <SEP> var <SEP> ascomycetus, <SEP> 9280393
<tb> - <SEP> Sulfolobus <SEP> solfataricus, <SEP> 13813523 <SEP> (ocd1)
<tb> 13816686 <SEP> (ocd2)
<tb> - <SEP> Thermoplasma <SEP> acidophilum, <SEP> 10639650
<tb> - <SEP> Thermopfasma <SEP> volcanium, <SEP> 13541655
<tb>
Figure img00080002

On peut citer en outre le polypeptide codé par le gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis (ATCC-25486) dont la séquence est décrite dans WO~9601901-A1~et les séquences des polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium susceptibles d'être trouvés chez les espèces ou souches productrices de rapamycine, d'ascomycine, et de FK- 506, ainsi que les Streptomyces ou autres microorganismes producteurs de streptogramines, en particulier Streptomyces loedensis (ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis (A TCC-15297), Streptomyces olivaceus (A TCC- 12019), Streptomyces ostréogriseus (A TCC-27 455), Streptomyces virginiae (ATCC-13161).
On peut citer également les polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium trouvés chez des organismes eucaryotes tels que Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapins, Macropus fuliginosus, Mus musculus, et Rattus norvegicus et listées dans le tableau 2 suivant :
Tableau 2 : Organismes supérieurs ayant des séquences de polypeptides homologues à celle de l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium
<Desc/Clms Page number 9>
Figure img00090001
<tb>
<tb> Numéro <SEP> Genbank <SEP> (gi <SEP> : <SEP> ) <SEP> du
<tb> Souche <SEP> ou <SEP> espèce
<tb> polypeptide <SEP> homologue
<tb> -Arabidopsis <SEP> thaliana, <SEP> 9950040
<tb> - <SEP> Drosophila <SEP> melanogaster, <SEP> 7293295
<tb> - <SEP> Homo <SEP> sapiens, <SEP> 13647115
<tb> - <SEP> Macropus <SEP> fuliginosus, <SEP> 283930
<tb> - <SEP> Mus <SEP> musculus, <SEP> 3913376
<tb> - <SEP> Rattus <SEP> norvegicus <SEP> 5931745
<tb>
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ces polypeptides sont codés par des gènes homologues à celui de l'ornithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium.
Par gène homologue de celui de l'ornithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium, on entend tout gène ayant : a) une séquence nucléotidique similaire à la séquence codante du gène de l'ornithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium ; ou b) une séquence nucléotidique hybridant avec la séquence codante du gène de l'ornithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation ; ou c) une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide homologue à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium tel que défini cidessus ou ayant une activité d'ornithine cyclodeaminase.
De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue selon l'invention est similaire à au moins 75 % de la séquence du gène ocd
Figure img00090002

de séquence SEQ ID n d'Agrobacterium ou du gène pipA. rapL, pipA* de séquence SEQ) D n 1, rapL* de séquence SEQ ID n 2 et rapL*L* de séquence SEQ ID n 5 définis ci-après, de préférence encore au moins 85 %, ou au moins 90 %.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence du gène ocd d'Agrobacterium ou du gène pipA. rapL, pipa : de
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séquence SEQ ID n 1, rapL* de séquence SEQ ID nO 2 et rapL*L* de séquence SEQ ID n 5 définis ci-après, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0, 41 (%G+C) +16, 6Log ( concentration en cations) - 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (Sambrook et a/., 1989).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucléotidique homologue inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de l'une des séquences identifiées, par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique.
De telles séquences homologues peuvent être obtenues à partir de microorganismes appartenant aux genres Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus et Streptomyces.
On peut citer en particulier les séquences des gènes codant pour des polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium trouvés chez les espèces ou souches listées dans le tableau 1 précédent.
On peut citer en outre la séquence du gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis (ATCC-25486) décrite dans WO 9601901-A1 et les séquences des gènes codant pour des polypeptides homologues à
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l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium susceptibles d'être trouvés chez les espèces ou souches productrices de rapamycine, d'ascomycine, et de FK- 506, ainsi que les Streptomyces ou autres microorganismes producteurs de streptogramines, en particulier Streptomyces lo'densis (ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis (A TCC-15297), Streptomyces olivaceus (A TCC- 12019), Streptomyces ostréogriseus (ATCC-27455), Streptomyces virginia (ATCC-13161).
On peut citer également les séquences des gènes eucaryotes de Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus
Figure img00110001

fuliginosus, Mus musculus, et Rattus norvegicus qui sont décrits comme codant pour des polypeptides homologues à l'ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium et listés dans le tableau 2 précédent.
Parmi les gènes convenant bien au procédé de l'invention, on
Figure img00110002

peut citer notamment les gènes rapL de Streptomyces hygroscopicus et pipA de Streptomyces pristinaespirales dont la séquence est décrite respectivement par Schwecke et al., 1995, et dans WO 9601901-A1. Selon un mode de réalisation de l'invention, le composé de formule générale Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide aminé de formule Il et un D-acide aminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables est mis en présence d'une suspension du microorganisme producteur du polypeptide homologue à l'ornithine cyclodeaminase.
Des gènes homologues préférés tels que décrits ci-dessus sont des gènes synthétiques obtenus par mutagénèse dirigée tel que décrit plus bas
Selon un mode de réalisation de l'invention, le composé de formule générale Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide aminé de formule Il et un D-acide aminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables est mis en présence d'une enzyme isolée du microorganisme producteur.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme à l'état purifié.
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Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme recombinante, ce dernier mode de réalisation étant préféré.
On a pu constater de manière surprenante que les polypeptides tels que décrits ci-dessus permettaient dans les conditions de l'invention la synthèse stéréospécifique des composés de formule 1 de l'invention sans nécessiter l'addition exogène de NAD au milieu réactionnel.
Dans un mode de réalisation de l'invention, on ajoute à la préparation enzymatique ou à la suspension cellulaire éventuellement perméabilisée, un composé de formule Il ou un mélange d'énantiomères du composé de formule Il et de D-acide diaminé correspondant en une concentration variant entre 0,05 M et 3 M, de préférence entre 0,1 M et 2,5 M, leurs sels ou dérivés et on laisse incuber à une température comprise entre 10 et 100 C, avantageusement entre 20 et 70, préférentiellement entre 25 et 45, pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours, sous agitation.
On peut de la sorte obtenir des rendements molaires en composé de formule 1 d'au moins 20, avantageusement d'au moins 80, de préférence au moins 90% avec un excès énantiomère supérieur à 80, avantageusement supérieur 90, de préférence supérieure à 95 %.
Avantageusement, le composé de formule 1 est sous la forme d'un sel d'ammonium.
En variante, on peut également mettre à incuber les enzymes extraites du milieu de culture ou purifiées avec le composé de formule Il ou un mélange d'énantiomères du composé de formule Il ou de D-acide diaminé correspondant dans un milieu tamponné ou non à un pH compris entre 6 et 11 et de préférence entre 7 et 10.
Le produit obtenu peut être recueilli par précipitation, cristallisation ou chromatographie d'échanges d'ions.
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Parmi les substrats préférés pour la préparation d'un composé de formule 1, on peut citer en particulier la L-lysine ou un mélange de L-et Dlysine, la L-thialysine (S-2-aminoéthyl-L-cysteïne), la L-ornithine, un mélange
Figure img00130001

de L-et D-5- (R, S)-hydroxy- ! ysine, un mélange de L-et D-azatysine (acide y- N-2aminoéthyl- diaminopropionique).
Afin de rendre le procédé plus particulièrement efficace, la surproduction du polypeptide à activité d'ornithine cyclodeaminase est particulièrement avantageuse.
Dans cette optique, on introduit le gène d'intérêt codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus dans un microorganisme hôte, de préférence surexprimant le polypeptide.
A cet effet, un vecteur contenant un acide nucléique comprenant l'une des séquences nucléotidiques telle que définie ci-dessus ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression, de préférence la surexpression du polypeptide correspondant.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (parmi lesquels on peut citer les promoteurs, les activateurs, et les séquences de terminaison) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard.
Parmi les vecteurs préférés, on peut citer les plasmides pTZ18 (Sigma, St-louis), pQE70 (Qiagen, Munich) et PQE60 (Qiagen, Munich).
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Les vecteurs d'expression sont introduits dans les cellules hôtes et celles-ci sont mises en culture dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment E. coli, de préférence les souches Escherichia coli DH5a, Escherichia coli ss2033, et
Figure img00140001

Escherichia coli K12 (MG1655).
Toutefois, d'autres organismes hôtes appartenant à des genres différents conviennent également.
Des résultats particulièrement intéressants sont obtenus lorsqu'on
Figure img00140002

transfecte E. coli avec des gènes modifiés par rapport aux gènes correspondants natifs de façon à permettre une expression optimale du gène d'intérêt dans E. coli.
Le gène hétérologue est modifié de façon à comprendre une proportion inférieure à 65 %, avantageusement inférieure à 55 % de bases G + C, tout en codant pour le même polypeptide que le gène natif ou un polypeptide homologue tel que défini précédemment.
Ainsi, pour un acide aminé donné codé par un codon de l'ADN natif, on remplace le cas échéant la troisième base du codon, voire la seconde base du codon lorsque celle-ci est G ou C par A ou T, lorsque le codon obtenu correspond au même acide aminé que celui codé par le codon natif.
Les gènes modifiés qui ont permis d'obtenir les meilleurs taux d'expression et également les rendements les plus élevés en acides a-iminocycliques sont ceux dans lesquels les codons natifs ont été remplacés pour un acide aminé donné du polypeptide ayant l'activité acide aminé cyclodéaminase par les codons respectifs suivants représentés au tableau 3.
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Tableau 3 : Code de conversion utilisé
Figure img00150001
<tb>
<tb> Acide <SEP> aminé <SEP> Codon <SEP> utilisé <SEP> Acide <SEP> aminé <SEP> Codon <SEP> utilisé
<tb> A <SEP> Ala <SEP> GCA <SEP> L <SEP> Leu <SEP> TTA
<tb> R <SEP> Arg <SEP> CGT <SEP> K <SEP> Lys <SEP> AAA
<tb> N <SEP> Asn <SEP> AAT <SEP> M <SEP> Met <SEP> ATG
<tb> D <SEP> Asp <SEP> GAT <SEP> F <SEP> Phe <SEP> TTT
<tb> C <SEP> Cys <SEP> TGT <SEP> P <SEP> Pro <SEP> CCA
<tb> Q <SEP> Gln <SEP> CAA <SEP> S <SEP> Ser <SEP> TCT
<tb> E <SEP> Glu <SEP> GAA <SEP> T <SEP> Thr <SEP> ACT
<tb> G <SEP> Gly <SEP> GGT <SEP> W <SEP> Trp <SEP> TGG
<tb> H <SEP> His <SEP> CAT <SEP> y <SEP> Tyr <SEP> TAT
<tb> Ile <SEP> ATT <SEP> v <SEP> Val <SEP> GTT
<tb>
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Les gènes modifiés ont été obtenus par assemblage de tronçons obtenus par PCR et mutagénèse dirigée à partir des gènes natifs correspondants.
Parmi les gènes modifiés ayant donné les meilleurs résultats, on
Figure img00160001

peut citer tes gènes modifiés pipA* et rapL** ayant respectivement les peut citer les gènes modifiés ppA séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 5 représentées en annexe de la présente demande.
Les polynucléotides correspondant à ces gènes modifiés constituent un autre objet de l'invention.
Le gène pipA* a été obtenu à partir de la séquence du polypeptide codé par le gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis représentée en annexe en tant que séquence SEQ ID n 3.
Le gène rapL** a été obtenu à partir de la séquence du polypeptide codé par le gène rapL de Streptomyces hygroscopicus représentée en annexe en tant que séquence SEQ ID n 4.
Les gènes modifiés sont insérés dans des vecteurs de clonage comme décrit ci-dessus pour les gènes natifs transfectés dans des hôtes recombinants.
Les microorganismes hôtes, le cas échéant, recombinants comportant un gène existant à l'état natif ou modifié comme décrit ci-dessus sont cultivés, éventuellement en présence d'un inducteur d'expression, par exemple l'IPTG.
Lorsque les cellules atteignent une densité de l'ordre de au moins une unité d'absorbance à 600 nm pour des cultures standards et de l'ordre de quelques dizaines ou plus de telles unités pour des cultures à haute densité, elles sont séparées de leur milieu de culture et soumises à un traitement de perméabilisation qui peut être physique (par exemple, traitements alternatifs de congélation et décongélation, traitements aux ultra-sons ou à la presse de French, broyage mécanique) ou chimique (par exemple, ajout de solvant ou d'agents complexant tels l'EDTA), ou enzymatique (par exemple, ajout de lysozyme).
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La suspension cellulaire peut alors être utilisée pour réaliser la préparation des produits de formule Il comme décrit ci-dessus ou la protéine d'intérêt produite peut ensuite être récupérée et purifiée.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de Iysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono-ou polyclonaux spécifiques, etc.
Toutefois, il n'est pas nécessaire de récupérer cette protéine.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules hôtes produisant le polypeptide ayant l'activité enzymatique recherchée sont détruites afin que leur contenu cytoplasmique soit libéré dans le milieu contenant le substrat acide diaminé dont les deux fonctions amines sont distantes (par la voie la plus courte lorsque plusieurs chemins sont possible) de quatre ou cinq chaînons, sous forme L ou sous forme d'un mélange d'énantiomères et de manière à permettre la mise en présence de l'enzyme et de son substrat.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1 :
Amplification par PCR du gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis à partir de l'ADN total de la souche.
1.1. Extraction de l'ADN total.
La souche Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486 a été cultivée à 28 C pendant 24 h dans le milieu TSB (DIFCO), puis 10 ml de la culture ainsi obtenue ont été centrifugés pendant 5 min à 11000 g. Le culot de centrifugation a été repris par 1 ml d'une solution de 10 mM Tris pH 8,0 contenant 2 mM d'EDTA et 5 mg/ml de lysozyme. La suspension ainsi obtenue a été laissée sous agitation pendant 30 min à 37 C, puis 100 III d'une solution de SDS à 20 % ont été ajoutés. Après incubation à 300C pendant quelques
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minutes, 125 pI d'une solution de protéinase K à 2 mg/ml ont été encore ajoutés. Ensuite l'extraction de l'ADN a été poursuivie en utilisant les réactifs du kit DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Munich) et en respectant les indications du fournisseur. L'ADN ainsi extrait a été purifié par extraction phénol/chloroforme, précipité par de l'éthanol et repris dans 100 pI d'eau.
1.2. Amplification du gène pipA.
Le gène pipA a été amplifié par PCR à partir de l'ADN total ainsi préparé en utilisant, pour la synthèse des amorces, sa séquence décrite dans le brevet WO 9601901-A1. La réaction a été effectuée dans un volume de 50 PLI de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgS04,0, 1 % Triton X-100,2 loi de la solution d'ADN total, 250 M de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5'CCCGAATTCCGACACCACGCACGGACGAGAAG
5'CCCTGCAGGCATCTCTCTCCTCGCGAGGGC.
Le protocole de PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 97 C pendant 4 min suivie d'une incubation à 80 C pendant 1 min, et s'est poursuivi par 5 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97 C, suivie de 1 min d'hybridation à 55 C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72 C. Ensuite 40 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97 C, suivie de 1 min d'hybridation à 50 C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 720C ont été effectués. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 720C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par EcoRI et Pstl et cloné dans le vecteur pTZ18 (SIGMA, St-Louis, MO) préalablement coupé. Deux constructions plasmidiques (pKT 35, pKT 36) obtenues suite à des amplifications PCR indépendantes ont été séquencées. Les séquences de ces deux fragments ainsi clonés étaient identiques. La protéine spécifiée, de séquence SEQ ID n 3, diffère cependant d'un acide aminé (alanine) à la position 87 par rapport à la séquence publiée dans WO 9601901-A1 (glycine).
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Exemple 2 :
Amplification par PCR du gène rapL de Streptomyces hygroscopicus à partir d'une suspension de cellules de la souche.
La souche Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 a été cultivée à 28 pendant 24 h dans le milieu TSB (DIFCO). 50 de la suspension cellulaire ainsi obtenue ont été soumis à des étapes d'échauffement et de refroidissement suivants : 30 sec à 65 C, 30 sec à 8 C, 90 sec à 65 C, 180 sec à 97 C, 60 sec à 8 , 180 sec à 65 C, 60 sec à 97 C, 60 sec à 65 C, 20 min à 80 C.
L'amplification du gène rapL a été réalisée par PCR à partir d'une suspension de cellules en utilisant pour la synthèse des amorces sa séquence décrite (Schwecke et al., 1995). La réaction a été effectuée dans un volume de
Figure img00190001

50 ! JI de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8. 8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4) 2S04, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100,10 ! ll de la suspension de cellules préalablement traitée, 250 J. M de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5'CCCGAATTCGAGGTTGCATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAG 5'CCCAAGCTTAGATCTTTATTACAGCGAGTACGGATCGAGGACG
Le protocole PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 97 pendant 4 min suivie d'une incubation à 80 C pendant 1 min, et s'est poursuivi tout d'abord par 5 cycles caractérisés par une séquence
Figure img00190002

de 1 min de dénaturation à 97 C, suivie de 1 min d'hybridation à 60 C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72 C, puis par 5 nouveaux cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97 C, suivie de 1 min d'hybridation à 52 C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72 C. Ensuite 30 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97 C, suivie de 1 min d'hybridation à 500C puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72 C ont été effectués. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 720C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été purifié sur la colonne du Qiaquick
Figure img00190003

PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par EcoRI et Hindlll et cloné dans le
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vecteur pTZ18 préalablement coupé. Trois constructions plasmidiques obtenues (pKT30, pKT31, pKT34) suite à des amplifications PCR indépendantes ont été séquencées. Les séquences de ces trois fragments ainsi clonés étaient identiques. La protéine spécifiée, de séquence SEQ ID n 4, diffère cependant de cinq acides aminés par rapport à la séquence publiée par Schwecke et al, à savoir que la protéine de l'invention contient en positions 50,84, 102,127 et 129 respectivement un résidu de thréonine, glutamin, acide aspartique, alanine et alanine.
Exemple 3 :
Synthèse totale par PCR du gène pipA*
Le gène pipA d'une taille de 1066 pb issu de Streptomyces pristinaespiralis et dont la séquence est décrite dans le brevet WO 9601901- A1, est composé d'une proportion en G + C de 69,6 %. Ce gène a été réécrit suivant le code génétique optimisé pour l'expression dans Escherichia coli décrit dans le tableau 3. Le gène réécrit pipA*, de séquence SEQ ID n 1 est désormais composé d'une proportion en G + C de 38 %. Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT prévu par le code du tableau 3. Deux codons de terminaison de la traduction TAA ont été également ajoutés en position 15 et 1080 (le'nucléotide du codon), respectivement de la séquence SEQ ID n 1, et des sites de restriction uniques EcoRI et Ncol d'une part, Hindlll d'autre part, ont été introduits respectivement en 5'et en 3'du gène permettant ainsi son insertion dans un vecteur de clonage.
La synthèse du gène pipA* a été effectuée en assemblant deux tronçons EcoRI-Kpnl (tronçon 1 de 305 pub-nucleotide 1 à nucléotide 304) et Kpnl-Hindlll (tronçon 2 de 798 pub-nucleotide 305 à nucléotide 1092).
Chaque tronçon a été synthétisé par extension d'oligonucléotides simple brin d'une longueur de 50 à 60 nucléotides se chevauchant (brins sens et brins anti-sens ), suivie d'une amplification par des oligonucléotides d'extrémité 5'et 3'.
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Synthèse du tronçon 1 : La réaction PCR a été effectuée dans un volume de 100 pI de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4) 2S04, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100,0, 01 M des oligonucléotides listés ci-après, 0,3 mM de chacun des quatre dNTP et 2 unités de Vent DNA Polymerase (BioLabs). Le protocole PCR appliqué était composé de 30 cycles caractérisés par une séquence de 30 sec de dénaturation à 96 C, suivie de 30 sec d'hybridation à 55 C, puis de 30 sec d'élongation à 72 C. Au cycle numéro 10, les oligonucléotides des extrémités 5' (PIPAUP) et 3' (PIPAD1) ont été ajoutés à une concentration finale de 0,5 jjv). A la fin du cycle 30, une période d'élongation de 2 minutes à 720C a été ajoutée.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour la réaction : PipaVO, PipaV2, PipaV4, PipaV6, PipaV8, PipaD4, PipaD5, PipaD6 et PipaD7.
Les séquences de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 4.
Le produit PCR ainsi obtenu a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré successivement par les enzymes de restrictions Kpnl et EcoRI, et à nouveau purifié sur gel d'agarose.
Une bande de taille apparente de 300 pb a été extraite du gel en utilisant le Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN). Ce produit PCR purifié a été ensuite ligué au vecteur pTZ18, préalablement digéré par les enzymes EcoRI et Kpnl et purifié sur gel d'agarose, par la T4 DNA ligase (BioLabs). La réaction de ligation s'est effectuée pendant une nuit à 16 C dans le tampon de ligation fourni avec l'enzyme. Le produit de la ligation a été ensuite transformé dans la souche E. coli DH5a CIP104738 (Hanahan D., 1983) par choc thermique et des clones recombinants sélectionnés sur milieu LB (DIFCO) agar supplementé avec ampicilline (100 mg/1).
Les plasmides contenus dans les transformants résistants à l'ampicilline ont été isolés en utilisant le système de préparation de plasmides QlAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Pour quatre de ces plasmides dont l'analyse par des enzymes de restriction appropriés montrait un insert de taille attendue, les fragments EcoRI-Kpnl ont été séquencés. Chacune des séquences des quatre constructions contenait entre une et trois déviations par
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rapport à la séquence attendue. Le plasmide pSP23 pour lequel la séquence du fragment était correcte à l'exception d'une délétion de 6 pb a été soumis à une étape de mutagenèse dirigée suivant une méthode publiée (Ansaldi et al., 1996) pour corriger cette délétion. Le plasmide pSP39 a été ainsi obtenu. Le séquençage du fragment EcoRI-Kpnl du plasmide pSP39 a été réalisé et la séquence obtenue a été trouvée conforme à celle attendue.
Synthèse du tronçon 2 : La réaction PCR pour la synthèse du tronçon Kpnl-Hindlll a été effectuée comme décrit pour le tronçon 1 à l'exception de la période d'élongation dont la durée a été allongée à 1 minute pour les 30 cycles et à 4 min à la fin du protocole. Au cycle numéro 10, les oligonucléotides des extrémités 5' (PIPA29) et 3' (PIPA3) ont été ajoutés à une concentration finale de 0, 5, uM.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour la réaction : PipaV8, PipaV10, PipaV12, PipaV14, PipaV16, PipaV18, PipaV20, PipaV22, PipaV24, PipaV26, PipaV28, PipaD8, PipaD9, PipaD10, PipaD11, PipaD12, PipaD13, PipaD14, PipaD15, PipaD16 et PipaD17. Les séquences de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 4.
Le produit PCR a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par les enzymes de restriction Kpnl et Hindlll et ligué au vecteur pTZ18 préalablement digéré par les mêmes enzymes. La transformation de la souche E. coli DH5a, la sélection des transformants et l'analyse des plasmides ont été réalisés comme décrit cidessus pour le tronçon 1. Le plasmide pSP25 pour lequel la séquence du fragment Kpnl-Hindlll comportait cinq déviations par rapport à la séquence attendue a été soumis à plusieurs étapes de mutagenèse dirigée (Ansaldi et al., 1996) pour corriger ces erreurs. Le plasmide pSP42 a été ainsi obtenu.
Assemblage des 2 tronçons : Le gène entier pipA* a été assemblé par clonage du fragment Kpnl-Hindlil extrait du plasmide pSP42 dans le plasmide pSP39 préalablement coupé par les enzymes Kpnl et Hindlil. Un des plasmides résultant, le plasmide pSP43 contenant un fragment EcoRI-Hindlll de taille attendue a été séquencé et la séquence du gène ainsi vérifiée.
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Tableau 4 : Synthèse du gène pipA* séquence des oligonucléotides
Fragment EcoRI-KpnI : Pipa VO 5' TTCCAAGGAATTTGTTTACCCAATCTTCAGTCCGTTCGAATTCGAGGTTCC PipaV2 5' TGATGTTGCAGAAGTTGTTGCAGCAGTTGGTCGTGATGAATTAATGCGTC PipaV4 5' CAGAAATTGGTCGTGGTGAACGTCATTTATCTCCATTACGTGGTGGTTTA PipaV6 5' GAATGGATGCCACATCGTGAACCAGGTGATCATATTACTTTAAAAACTGT
Figure img00230001

PipaV8 5'TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG Pipa D4 S'ATA GTT GGT AAA CCA AAA CGA CCT GGA TTT GCT GGA GAA TAA
CCA ACA GTT TTT AAA GTA Pipa D5 5'ATG TGG CAT CCA TTC CCA AAT ACC TGG AAC TGG TTC AGA ACG
TTCTAAACCACCACGTAA 3' Pipa D6 5'CAC GAC CAA TTT CTG CTA AAC CAC CAG TTA AAC GAT CGA TAA
TACGACGCATTAATTCAT 3' Pipa D7 5'ACT TCT GCA ACA TCA CGA CGA CCT AAA ACC CAA GTT TCC ATG GAACCTCGAATTCG 3' Oligos externes : PIPAUP 5'CCCGAATTCGAGGTTCCATGGAAAC PIPAD1 5'CAGTAGTATCATCATAACGTGC
Fragment KpnI-Hindm :
Figure img00230002

PipaV8 TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG Pipa TATTAACTGCATTACGTACTGGTGCAGCATCTGCTGTTGCATCTCGTTTA PipaV12 TTAATTGGTACTGGTGCACAAGCAGTTACTCAATTACATGCATTATCTTT PipaV14 GGATACTGATCCAGCACATCGTGAATCTTTTGCACGTCGTGCAGCATTTA PipaV16 CACGTATTGCAGCAGAAGCAGATGTTATTTCTACTGCAACTTCTGTTGCA PipaVI 8 GGTGTTCGTGAACATTTACATATTAATGCAGTTGGTGCAGATTTAGTTGG PipaV20 ACGTGCATTTGTTACTGCAGATCATCCAGAACAAGCATTACGTGAAGGTG
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Figure img00240001

PipaV22 GTCCACAATTAGCACATTTATGTGCAGATCCAGCAGCAGCAGCAGGTCGT PipaV24 GGTTTTGCATTTGAAGATGCATTAGCAATGGAAGTTTTTTTAGAAGCAGC PipaV26 TATTGAACATCATCCAGGTGATGCATTAGATCCATATGCATTACAACCAT Pipa V28 5'ATA AAGATCTAAGCTTCCCC Pipa D8 5'GGGG AAG CTT AGA TCT TTA TTA ATG TGC TGG TGC TGC TAA TGG
TAA TGG TAA TGG TTG TAA TGC AT 3' Pipa D9 5'GGA TGA TGT TCA ATA CCA ACA CGA ATA CCT AAA TCA CGT TCT
GCT GCT GCT TCT AAA AAA 3' Pipa D10 5'TTC AAA TGC AAA ACC AGT AGA ATC AAA AAC AGA TAA AGT ATC
TTGACGACCTGCTGCTGC 3' Pipa Dl 1 5'GTG CTA ATT GTG GAC CTA AAC GAT CAG CAG ATA ATT GTT GAC
ATTCACCTTCACGTAATG 3' Pipa D12 5'GTA ACA AAT GCA CGT TCT AAT AAA CCT AAT GGT AAT TCA GTT
TTACCAACTAAATCTGCA 3' Pipa D13 5'ATG TTC ACG AAC ACC AGT ATC TGG TAA AAC TGG ACC TTG ACC
AAC TGC AAC AGA AGT TGC 3' Pipa D14 5'CTG CTG CAA TAC GTG CTG GTT CTG CAA TTT CAA CAG AAA CAC
CAGTAAATGCTGCACGAC 3' PipaD15 5'GCT GGA TCA GTA TCC CAA ACT AAT GCA CGT TGT AAT GGT AAA
ACT AAA GAT AAT GCA TGC 3' Pipa D16 5'ACC AGT ACC AAT TAA ACC TAA AGT ATG AGA ATC TGG ACG TGC
TAA TAA ACG AGA TGC AAC 3' Pipa D17 5'GTA ATG CAG TTA ATA AAA CAC CAT CCA TTA ATG CAG TTA ATG
CACCAGTAGTATCATCAT 3' Oligo externes : PIPA V29 5'CTA TTTTAGGTACCGTTGCA
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Figure img00250001

PIPAD3 5'CCCAAGCTTAGATCTTTATTAATGTG
Exemple 4 :
Synthèse totale par ligation du gène rapL*, et obtention du variant rapL**
Le gène rapL d'une taille de 1029 pb issu de Streptomyces hygroscopicus et dont la séquence a été publiée (Schwecke et al., 1995), est composé d'une proportion en G + C de 68 %. Ce gène a été réécrit en suivant
Figure img00250002

le code génétique employé pour la synthèse du gène pipA* à l'exemple 3. Le gène réécrit rapL*, de séquence SEQ ID n 2 est désormais composé d'une proportion en G + C de 38 %. Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT prévu par le code représenté au tableau 3. Deux codons TAA de terminaison de la traduction ont été également ajoutés et des sites de restriction uniques EcoRI et Sphl d'une part, Hindlil d'autre part ont été introduits respectivement en 5' et en 3'du gène permettant ainsi son insertion dans différents vecteurs de clonage.
La synthèse totale du gène rapL* a été effectuée en assemblant les trois tronçons EcoRI-Kpnl (tronçon 1 de 305 pb), Kpnl-Pstl (tronçon 2 de 316 pb), et Pstl-Hindlll (tronçon 3 de 440 pb).
Chaque tronçon a été synthétisé par ligation d'oligonucléotides simple brin phosphorylés en 5'd'une longueur de 50 nucléotides en moyenne,
Figure img00250003

recouvrant la totalité de la séquence à cloner (brins sens et brins anti- sens ) et se chevauchant. Les séquences et positions de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 5. Les oligonucléotides, mélangés de façon equimolaire (1 M) dans le tampon de chevauchement (20 mM Tris-HCI, pH 8 ; 0,08 M NaCI) dans un volume final de 20 pI, ont été chauffés 10 minutes à 70 C et maintenus dans le bloc chauffant jusqu'à retour à la température ambiante. Le produit ainsi obtenu a été ensuite ligué par la T4 DNA ligase pendant une nuit à 16 C en présence de vecteur pTZ18 (rapport de
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concentration molaire vecteur/oligonucléotides 1/100) préalablement digéré par les enzymes de restriction appropriés.
Le produit de ligation a été utilisé pour transformer par
Figure img00260001

électroporation la souche ss2033 (E. coli K12, pro, thi, rpsL, hsdS, AlacZ, F' (AlacZM15, laclq, traD36, proA+, proB+)) et les clones recombinants ont été Lrob sélectionnés sur milieu LB agar contenant 100 j. lg/ml ampicilline, 0,5 mM IPTG et 30 g/ml X-Gal.
Les plasmides contenus dans plusieurs transformants blancs résistants à l'ampicilline ont été isolés en utilisant le système de préparation de plasmides Q ! Aprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Pour chaque tronçon, les inserts de deux à quatre plasmides dont l'analyse par enzymes de restriction appropriés montrait un fragment de taille attendue, ont été séquencés.
Synthèse du tronçon 1 :
Le plasmide pTZ18 coupé par EcoRI et Kpnl a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) : IcdV- 1, IcdV-2, IcdV-3, IcdV-4, IcdV-5, tcdV-6, IcdVrev-16, IcdVrev-17, IcdVrev-18, IcdVrev-19, IcdVrev-20, IcdVrev-21, IcdVrev-22. Le plasmide pSP3 dont la séquence de l'insert comportait seulement deux déviations par rapport à la séquence attendue a été retenu. Les deux erreurs ont été corrigées par mutagenèse dirigée suivant une méthode publiée (Ansaldi et al., 1996) et les corrections confirmées par séquençage de l'insert du plasmide pSP14 résultant.
Synthèse du tronçon 2 :
Le plasmide pTZ18 coupé par Kpnl et Pstl a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) : IcdV-7,
Figure img00260002

IcdV-8, IcdV-9, IcdV-10, IcdV-11, IcdV-12, IcdVrev-9, IcdVrev-10, IcdVrev-11, IcdVrev-12, IcdVrev-13, IcdVrev-14, IcdVrev-15. Le plasmide pSP8 dont la séquence de l'insert comportait seulement une déviation par rapport à la séquence attendue a été retenu. L'erreur a été corrigée par mutagenèse dirigée (Ansaldi et al., 1996) et la correction confirmée par séquençage de l'insert du plasmide pSP15 résultant.
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Synthèse du tronçon 3 :
Le plasmide pTZ18 coupé par Pstl et Hind) ! ! a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) :
Figure img00270001

IcdV-13, IcdV-14, IcdV-15, IcdV-16, IcdV-17, IcdV-18, IcdV-19, lcdV-20, lcdv- 21, IcdVrev-1, IcdVrev-2, IcdVrev-3, IcdVrev-4, IcdVrev-5, IcdVrev-6, IcdVrev-7, IcdVrev-8. Le plasmide pSP12 dont la séquence de l'insert comportait seulement une délétion de 25 pb et une déviation ponctuelle a été retenu. Les deux erreurs ont été corrigées par mutagenèse dirigée (Ansaldi et al., 1996) et les corrections confirmées par séquençage de l'insert du plasmide pSP26 résultant.
Assemblage des 3 tronçons : Les fragments corrigés Kpnl-Pstl, puis Pstl-Hindlll sont sous-clonés successivement dans le plasmide pSP14 contenant déjà le fragment EcoRI-Kpnl, reconstituant ainsi le gène synthétique rapL*. La séquence du gène rapL* du plasmide résultant pSP33 a été confirmée par séquençage.
Obtention du variant rapL** (Séquence SEQ ID n 5) : Le variant rapL** a été obtenu à partir du gène rapL* du plasmide pSP33 en introduisant par mutagenèse dirigée (Ansaldi et al., 1996) les cinq changements nécessaires pour que la protéine codée par le gène rapL** soit la même que celle codée par le gène amplifié et séquencé décrit à l'exemple 2 et corresponde à la séquence SEQ ID n 4, tout en respectant le code génétique décrit au tableau 3. Un plasmide pSP36 dérivé du plasmide pTZ18 et contenant le gène rapL** a été ainsi obtenu.
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Tableau 5 : Synthèse du gène rapL* séquence des oligonucléotides
Fragment EcoRI-KpnI :
Figure img00280001

Brin sens : IcdV-l : 5'-AATTCGAGGTTGCATGCAAACTAAAGTTTTATGTCAACGTGATATTAA-3' lcdV-2 : 5'p-ACGTATITTATCTGTTGTT GGTCGTGATGTT ATG ATG GAT
CGT TTA ATT T-3' lcdV-3 : 5'p-CTGAAGTTCAT GCA GGT TTT GCA CGT TTA GGT
CGT GGT GAAACT GATGAA-3' IcdV-4 : 5'p-CCACCA CCA CGT CCA GGT TTT GCA CGT GGT
GGT GAT GTT CCAGGT GTTAT-3' led-5 : 5'p-T GAA TTT ATG CCA CAT CGT GCA TCT GGT
ATT GGT GTTACT ATGAAA ACTG-3' lcdV-6 : 5'p-TT TCT TAT TCT CCA GAA AAT TTT GAA
CGT TTTAAT TTACCA ACT ATT GTT GGT AC-3' Brin anti-sens : IcdVrev-16 : 5'p-CAACAATAG TTGGTAAATTAAAA-3' IcdVrev-17 : 5'pCGTTCAAAATTTTCTGGAGAATAAGAAACAGTTTTCATAGTAACACCAAT-3' lcdVrev-18 : 5'pACCAGATGCACGATGTGGCATAAATTCAATAACACCTGGAACATCACCA-3' lcdVrev-19 : 5'p-
Figure img00280002

CCACGTGCAAAACCTGGACGTGGTGGTGGTTCATCAGTTTCACCACGACCT-3' IcdVrev-20 : 5'pAAACGTGCAAAACCTGCATGAACTTCAGAAATTAAACGATCCATCATAAC-3' lcdVrev-21 : 5'p-ATCACGACCAACAACAGATAAAATACGTTTAATATCACGTTGA-3' lcdVrev-22 : 5'p-CATAAAACTTTAGTTTGCATGCAACCTCG-3'
Fragment KpnI-PstI :
Figure img00280003

Brin sens : lcdV-7 : 5'p-CGTITCT CGT TTA GGT GAT GATTCT GGTTCT ATG GTT GCA TTA GC-3'
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IcdV-8 : 5'p-A GAT GCA GCAACTATT ACT GCAATGCGTACT GGT
GCA GTT GCA TCT GTT A-3' lcdV-9 : 5'p-CT ACT CGT TTATTAGCACGTCCAGGT TCT ACT ACT
TTA GCA TTA ATT GGT-3' lcdV-10 : 5'p-GCA GGT GCACAA GCAGTTACT CAA GCA CAT
GCA TTA TCT CGT GTT TTA CC-3'
Figure img00290001

IcdV-11 : 5'p-A TTA GAACGT ATTTTA ATTTCTGAT ATT AAA
GCA GAA CAT GCA GAA TCT T-3' lcdV-12 : 5'p-TTGCAGGTCGT GTT GCA TTTTTAGAA TTA CCA GTT
GAA GTT ACT GATGCAGCAACT GCA ATG GCA ACT
GCA-3' Brin anti-sens : IcdVrev-9 : 5'p-GTTGCCATTGCAGTTGCTGCATCAGTAACTTCAA-3' IcdVrev-10 : 5'p- CTGGTAATTCTAAAAATGCAACACGACCTGCAAAAGATTCTGCATGTTCTGCTTT-3' lcdVrev-11 : 5'pAATATCAGAAATTAAAATACGTTCTAATGGTAAAACACGAGATAATGCA-3' lcdVrev-12 : 5'pTGTGCTTGAGTAACTGCTTGTGCACCTGCACCAATTAATGCTAAAGTAGTA-3' lcdVrev-13 : 5'pGAACCTGGACGTGCTAATAAACGAGTAGTAACAGATGCAACTGCACCAGT-3' IcdVrev-14 : 5'p-ACGCATTGCAGTAATAGTTGCTGCATCTGCTAATGCAACC-3' lcdVrev-15 : 5'p-ATAGAACCAGAATCATCACCTAAACGAGAAACGGTAC-3'
Fragment PstI-HindIII :
Brin sens : ledV-13 : 5'p-GATGTTTTA TGT ACT GTT ACTTCTGTTCC-3' IcdV-14 : 5'p-A GTT GGT GGT GGT CCAGTTGTTCCA GCA GAA
CCA CGTCAAGCACAT TTA C-3' lcdV-15 : 5'p-AT GTT AAT GGT ATT GGT GCA GATGAACAAGGT
AAAACTGAA TTA CCA AAA-3' IcdV-16 : 5'p-GCA TTA TTA GAT GAT GCA TTT ATT TGT GTTGATCAT CCA GGT CAA GCA CG-3' lcdV-17 : 5'p-T GCA GAA GGT GAA TTT CAACAA
TTACCAGATCGTGAA TTA GGT CCA TCT T-3'
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lcdV-18 : 5'p-TA GCA GAT TTA TGT GCAGCACCAGAA ATT GCA
GCACCACAT CCA GAA CGT-3' lcdV-19 : 5'p-TTA TCT GTT TTTGATTCTACT GGT TCT GCA TTT GCA GAT CATATTGCA TTA GAT GTTTTATTA-3' lcdV-20 : 5'p-GGTTTT GCA GAT GAA TTA GGT TTA GGT CAT
AAAATGTCTATT GAAT-3' lcdV-21 : 5'p-CTACT CCA GAA GAT GTT TTA GAT CCA TAT
TCT TTATAATAAAGATCTA-3'
Figure img00300001

Brin anti-sens : 1cdVrev-l : 5'AGCTTAGATCTTTATTATAAAGAATATGGATCTAAAACATCTTCTGGAGTAGATT
CAATA GACATTTTATGAC-3' lcdVrev-2 : 5'pCTAAACCTAATTCATCTGCAAAACCTAATAAAACATCTAATGCAATATGA-3' lcdVrev-3 : 5'pTCTGCAAATGCAGAACCAGTAGAATCAAAAACAGATAAACGTTCTGGATG-3' lcdVrev-4 : 5'p-TGGTGCTGCAATTTCTGGTGCTGCACATAAATCTGCTAAAGATGGACCT- 3' lcdVrev-5 : 5'pAATTCACGATCTGGTAATTGTTGAAATTCACCTTCTGCACGTGCTTGACCT-3' lcdVrev-6 : 5'p-GGATGATCAACACAAATAAATGCATCATCTAATAATGCTTTTGGTAATT- 3' lcdVrev-7 : 5'p- CAGTTTTACCTTGTTCATCTGCACCAATACCATTAACATGTAAATGTGCTT-3' lcdVrev-8 : 5'p- GACGTGGTTCTGCTGGAACAACTGGACCACCACCAACTGGAACAGAAGTAACAGT
ACATAAAACATCTGCA-3'
Exemple 5 :
Surexpression du gène pipA* chez Escherichia coli.
Le gène pipA* a été cloné dans le vecteur pQE60 (QIAGEN) entre les sites de restriction Ncol et Hindlll à partir du plasmide pSP43 construit à l'exemple 3. Le plasmide pSP47 résultant a été introduit dans une souche d'E. coli K12 MG1655 (Vidal et al., 1998) exprimant le gène lacl à partir du plasmide auxiliaire pREP4 (QIAGEN). La souche +75 ainsi obtenue a été
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cultivée dans le milieu LB et l'expression du gène pipA* a été induite par l'ajout d'IPTG suivant le protocole du fournisseur. Les protéines totales des cellules ont été séparées par électrophorèse en gel polyacrylamide/SDS et colorées par le bleu de Coomassie. Une protéine au poids moléculaire de 36 kD a été détectée et son taux d'expression a été estimé à environ 5 % de protéines totales.
Exemple 6 :
Surexpression des gènes pipA. rapL. rapL*. et rapL** chez
Figure img00310001

Escherichia coli.
En procédant comme décrit à l'exemple 5 une souche d'E. coli surexprimant le gène pipA (souche +353) a été obtenue en introduisant le plasmide pKT37. Ce plasmide a été obtenu à partir du plasmide pKT36, décrit à l'exemple 1, par clonage du gène d'intérêt entre les sites de restriction Ncol et Hindlll du vecteur pQE60.
Figure img00310002
De même, des souches d'E. coli surexprimant les gènes rapL (souche +38), rapL* (souche +60), ou rapL** (souche +73) ont été obtenues en introduisant respectivement les plasmides pSP32, pSP37, ou pSP45. Ces plasmides pSP32, pSP37, ou pSP45 ont été obtenus respectivement à partir des plasmides pKT30, pSP33, ou pSP36, décrits dans les exemples 2 et 4, par clonage du gène d'intérêt entre les sites de restriction Sphl et Hindttt du vecteur pQE70.
Le taux d'expression des ces différentes protéines à été déterminé comme décrit à l'exemple 5. Pour chaque souche, une protéine au poids moléculaire attendu a été détectée avec un taux d'expression d'environ 5 % de protéines totales.
Exemple 7 :
Amplification par PCR et surexpression du gène ocd d'Agrobacterium tumefaciens chez Escherichia coli.
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Une préparation du plasmide Ti-C58 d'Agrobactérium tumefaciens CIP 104333 a été réalisée comme décrit par ailleurs (Hayman et al., 1990). Le gène ocd (Sans et al., 1988) a été amplifié par PCR à partir de cette préparation du plasmide Ti-C58.
La réaction a été effectuée dans un volume de 50 LI de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NHSO, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100,2 ng du plasmide Ti-C58, 200 ils de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5'CCCGCATGCCTGCACTTGCCAACC 5'CCCAGATCTTAACCACCCAAACGTCGGAAA
Le protocole PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 94 C pendant 2 min suivie par 30 cycles caractérisés par une séquence de 30 sec de dénaturation à 94 C, suivie de 30 sec d'hybridation à 52 C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72 C. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 72 C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par Ncol et Brill et cloné dans le vecteur pQE70 (QIAGEN) préalablement coupé. Le fragment Ncol-Bolil du plasmide pKR7 ainsi obtenu a été séquencé. La protéine spécifiée diffère de deux acides aminés par rapport à la séquence publiée (Sans et al., 1988), à savoir le résidu 212Gln remplacé par la lysine et le résidu 29711e remplacé par la leucine. Les deux déviations ont été confirmées par séquençage d'un produit d'amplification par PCR obtenu indépendamment.
En procédant comme décrit à l'exemple 5 une souche d'E. coli surexprimant le gène ocd (souche +78) a été obtenue en introduisant le plasmide pKR7. Le taux d'expression de la protéine codée par le gène ocd a été déterminé comme décrit à l'exemple 5. Une protéine de poids moléculaire conforme à celui qui était attendu a été détectée avec un taux d'expression d'environ 5 % des protéines totales.
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Exemple 8 :
Production d'acide L-pipécolique à partir de la L-lysine par des suspensions cellulaires des souches d'E. coli recombinantes.
La souche +75, construite à l'exemple 5, est cultivée dans le milieu minéral MS (Richaud et al., 1993) contenant 2 g/i Glucose, 50 mgll Ampicilline et 30 mg/l Kanamycine. Au bout de 14 heures de culture, 400 mL de milieu minéral MS contenant 2 g/) Glucose sont ensemencées au 1/10 avec la préculture de la souche +75. Cette culture est placée à 37 C sous agitation jusqu'à atteindre une DOeoonm de 0,7. Le gène pipA* est alors induit pendant 4 heures à 37 C par l'ajout de lmM d'IPTG à 200 mL de culture. Une culture témoin de 200 ml sans ajout d'IPTG est également réalisée. A la fin de cette étape, les deux cultures sont centrifugées à 13000g et les culots cellulaires sont repris dans du milieu minéral MS de façon à concentrer les cellules 100 fois. Les cellules sont alors perméabilisées par deux étapes de congélation/décongélation à-20 C favorisant l'accès du substrat à l'enzyme.
La L-lysine monohydrochloride (pH = 7) est alors ajoutée à une concentration finale de 1 M dans les suspensions cellulaires (volume final = 2 mL). La réaction enzymatique se fait à 370C sous agitation. Au bout de 20 heures on prélève un échantillon de 300 III de chaque culture que l'on centrifuge à 13000g de façon à récupérer le surnageant. Une solution diluée des surnageants est ensuite déposée sur couche mince de silice et en parallèle dosée par CLHP.
Un composé à la migration chromatographique (Rf = 0. 22 ; éluant : butanol/acide acétique/eau 4/1/1 en CCM) et à la coloration par la ninhydrine indiscernables de celles de l'acide L-pipécolique est détecté dans le cas de la culture induite à l'IPTG et absent dans le cas de la culture témoin non induite.
Le dosage par CLHP (conditions décrites ci-dessous) indique une concentration de 40 g/L de L-pipécolate au bout de 20 heures. L'excès énantiomérique est supérieur à 95%.
Des essais de production d'acide L-pipécolique à partir de la Llysine ont été réalisés avec les souches +38, +60, +73, +78 et +353 construites
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aux exemples 6 et 7, dans les mêmes conditions que celles appliquées cidessus pour la souche +75. L'analyse par chromatographie des surnageants respectifs sur couche mince de silice après coloration par la ninhydrine n'a révélé une production d'acide L-pipécolique qu'avec les souches +73, +78 et +353.
Description de la méthode CLHP utilisée :
Colonne Phenomenex Synergi Polar-RP-80 zut (250 x 4,6 mm) thermostatée à 300C
Détection UV à 210 nm
Volume d'échantillon injecté : 10 ; J Elution ! socratique par une solution de 0,05% de TFA dans l'eau pendant 5 minutes suivi d'un lavage de la colonne par 80 % d'acetonitril et 0,05% de TFA dans l'eau.
Temps de rétention : Lysine à 2,98 min et Acide
Pipécolique à 4,62 min.
Exemple 9 :
Figure img00340001

Production d'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique à partir de la L-thialysine
La production d'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique a été réalisée à partir d'une suspension cellulaire de la souche +75 préparée comme décrit à l'exemple 8. La L-thialysine (S- (2-aminoethyl) -L-cysteïne) (SIGMA) est ajoutée à une concentration finale de 1 M. Une chromatographie sur couche mince de silice du surnageant de la suspension incubée est réalisée et elle révèle un composé à la migration (Rf = 0,28 ; éluant butanol/acide acétique/ eau 4/1/1) et à la coloration par la ninhydrine distinctes de celles de la Lthialysine et de l'acide L-pipécolique.
Dans les mêmes conditions, la souche +78 décrite à l'exemple 7 produit un composé identique à celui produit par la souche +75.
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Exemple 10 :
Production d'un mélange d'acides 5-R-et 5-S-hydroxy-L- pipécolique à partir d'un mélange de L-et D-5- (R, S) hydroxy-lysine
La production d'un mélange d'acides 5-R-et 5-S-hydroxy-L- pipécolique a été réalisée à partir d'une suspension cellulaire de la souche +75 préparée comme décrit à l'exemple 8. La 5-R, S-hydroxy-D, L-lysine (SIGMA) est ajoutée à 1 M final. Une chromatographie sur couche mince de silice du surnageant de la suspension incubée est réalisée et elle révèle deux composés présents en proportions équivalentes, à la migration (Rf1 = 0,14 ; Rf2 = 0,20 ; éluant butanol/acide acétique/eau 4/1/1) et à la coloration par la ninhydrine distinctes de celles de la 5-R, S-hydroxy-D, L-lysine et de l'acide L-pipécolique.
Dans les mêmes conditions, la souche +78 décrite à l'exemple 7 produit deux composés identiques à ceux produits par la souche +75.

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule 1 ou d'un de ses sels ou dérivés :
Figure img00360001
dans laquelle R1 représente H ou un groupe alkyle en Ci-Ce et X représente une chaîne hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée en C2-Cg, de préférence en C2-C4, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi 0, S, NR2, R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en C1-C4, et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy, amino, ou halogéné, caractérisé en ce que a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule 1\ :
Figure img00360002
dans laquelle X et R1 sont tels que définis ci-dessus ; ou un de ses sels ou dérivés ou un mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant ou un de ses sels ou dérivés en proportions variables, en milieu aqueux en présence d'une ornithine cyclodéaminase ou d'un polypeptide homologue à celle-ci, sous réserve que lorsque l'enzyme est l'ornithine cyclodéaminase
Figure img00360003
native de Clostridium ou d'Agrobacterium le composé de formule Il n'est pas la L-ornithine, et
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sous réserve que lorsque le composé de formule générale Il est la L-lysine, celle-ci n'est pas mise en présence de microorganismes vivants et non recombinants appartenant aux genres Alcaligenes, Providencia, Protes, Bacillus, Agrobacterium, Morganella ou Planococcus ; et b) l'on récupère le L-acide aminé cyclique de formule 1 avec un excès énantiomérique d'au moins 80 %.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule 1 comprend un cycle à six maillons, X représentant une chaîne hydrocarbonée à quatre maillons.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la chaîne hydrocarbonée X est une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule générale Il ou le mélange énantiomère comprenant un Lacide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme isolée du microorganisme producteur.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme à l'état purifié.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule Il ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule Il et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme recombinante.
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7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule générale 1 est sous la forme d'un sel d'ammonium en solution aqueuse.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare l'acide L-pipéridine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de Llysine.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare l'acide L-pipérazine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de Lazalysine.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare l'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de L-thialysine.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une ornithine cyclodeaminase d'Agrobacterium ou un peptide ayant une activité homologue à celle de ladite ornithine cyclodeaminase.
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ornithine cyclodeaminase est celle de la souche d'Agrobacterium C 58.
13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une enzyme recombinante exprimée par le gène ocd de la souche
Figure img00380001
d'Agrobacterium tumefaciens C58 ou pipA de Streptomyces pristinaespiralis ou rapL de Streptomyces hygroscopicus ou un gène homologue dans un microorganisme hôte.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'enzyme recombinante est exprimée dans E. coli.
<Desc/Clms Page number 39>
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'enzyme recombinante est obtenue par expression d'un gène modifié d'une ornithine cyclodéaminase native, dans lequel certaines bases G ou C sont remplacées par des bases A ou T, de manière à obtenir des codons modifiés codant pour le même acide aminé que le codon natif.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les gènes modifiés comportent moins de 65, avantageusement moins de 55 % de bases G + C.
17. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16,
Figure img00390001
caractérisé en ce que le gène modifié est le gène pipA* de séquence SEQ ID nO 1 ou le gène rapL* de séquence SEQ ! D 2, ou le gène rapt de séquence SEQ ID n 5.
18. Polynucléotide comprenant la séquence SEQ ID n 1 ;
19. Polynucléotide comportant la séquence SEQ ID n 2.
20. Polynucléotide comportant la séquence SEQ ID nO 5.
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