EP1409691A2 - Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques - Google Patents

Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques

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Publication number
EP1409691A2
EP1409691A2 EP02747526A EP02747526A EP1409691A2 EP 1409691 A2 EP1409691 A2 EP 1409691A2 EP 02747526 A EP02747526 A EP 02747526A EP 02747526 A EP02747526 A EP 02747526A EP 1409691 A2 EP1409691 A2 EP 1409691A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
formula
acid
cyclodeaminase
linear
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02747526A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Denis Thibaut
Volker Döring
Philippe Marliere
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rhodia Chimie SAS
Original Assignee
Rhodia Chimie SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8864129&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EP1409691(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhodia Chimie SAS filed Critical Rhodia Chimie SAS
Publication of EP1409691A2 publication Critical patent/EP1409691A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures

Definitions

  • the present invention relates to the stereoselective preparation of cyclic L-amino acids or their salts and derivatives.
  • L-proline has been elucidated and described. It can be done in two ways:
  • N-acylase (WO 95/10604, WO 99/07873), amidase (EP-A-0 686 698), amino acid oxidase (JP 06030789), nitrilase (JP 06038781, JP 11127885) or esterase (WO 00/12745) acting on suitable substrates.
  • the Applicant has now shown that it is possible to convert, with high yields, concentrated solutions of di-amino acids into solutions of -imino-cyclic acids, in particular in aqueous solution of ammonium salts of ⁇ - acids.
  • imino-cyclical by implementing an enzyme encoded by the omithine cyclodeaminase gene (EC 4.3.1.12) of the Agrobacterium C58 strain or by a gene homologous to it, or recombinant microorganisms overproducing such enzymes.
  • the subject of the invention is a process for producing a cyclic L-amino acid of formula (I) or of a salt or derivative of an amino acid of formula (I):
  • R 1 is chosen from the hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical comprising from 1 to 6 carbon atoms and a linear or branched acyl radical comprising from 1 to 6 carbon atoms;
  • X represents a saturated, or partially or completely unsaturated, linear or branched C 1 -C 9 , preferably C 2 -C 4 , hydrocarbon chain optionally comprising in the chain and / or at the chain end one or more heteroatoms or heterogroups chosen from O, S,
  • R 'and R " identical or different, representing hydrogen or a hydrocarbon radical, linear or branched, saturated, or totally or partially unsaturated, and comprising from 2 to 20 carbon atoms, it being understood that R' and R" can form a cycle with the atom which carries them, characterized in that: a) a L-diamine acid of formula (II) is reacted:
  • X and R-i are as defined above; or a salt or derivative thereof, or an enantiomeric mixture comprising an L-diamine acid of formula (II) and a corresponding D-diamine acid, their salts or derivatives in variable proportions, preferably in an aqueous medium, in the presence of 'an ornithine cyclodeaminase, or of a polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase, the enzyme or the homologous polypeptide being obtained from a recombinant expression vector expressing said enzyme or said homologous polypeptide, b) the cyclic L-amino acid of formula (I) or a salt or derivative thereof is recovered in an enantiomeric excess of at least 80%.
  • amino acid derivative of formula (I) or (II) means an amide or ester thereof.
  • the subject of the present invention is a process for the production of a cyclic L-amino acid of formula (I) or of a salt or derivative of an amino acid of formula (I):
  • R 1 represents H or a C 1 -C 6 alkyl group or C 1 -C 6 acyl and X represents a linear saturated hydrocarbon chain or branched in C 2 -C 9 , preferably in C 2 -C 4 , optionally interrupted by one or more heteroatoms or heterogroups chosen from O, S, NR 2 , R 2 representing H or a C 1 -C alkyl or acyl group 4 , and / or optionally substituted by one or more hydroxy, amino or halogen groups, characterized in that a) a L-diamino acid of formula (II) is reacted:
  • X and Ri are as defined above; or a salt or derivative thereof, or an enantiomeric mixture comprising an L-diamine acid of formula (II) and a corresponding D-diamine acid, their salts or derivatives in variable proportions, preferably in an aqueous medium, in the presence of 'an ornithine cyclodeaminase or of a polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase, the enzyme or the homologous polypeptide being obtained from a recombinant expression vector expressing said enzyme or said homologous polypeptide, and b) the the cyclic L-amino acid of formula I or a salt or derivative thereof is recovered in an enantiomeric excess of at least 80%.
  • hydrocarbon chain comprises one or more unsaturations of ethylenic and / or acetylenic nature, these are preferably not carried by the carbon atoms situated in position ⁇ of the nitrogen atoms forming the amino functions of the diamine acid of formula (II).
  • the compounds of formula (I) obtained according to the process of the present invention most often comprise a cycle with 3, 4, 5, 6 or 7 links which are the cycles most frequently encountered in the field of organic chemistry.
  • the compounds of formula (I) for which the cycle has 5, 6 or 7 links are preferred and are those which appear the most accessible to those skilled in the art.
  • the process of the present invention cannot however be limited to the synthesis of these compounds with cycles of 5, 6 or 7 links.
  • (I) comprises a six-link cycle, X representing a four-link hydrocarbon chain. More specifically still, the process is implemented for obtaining a compound of formula (I) in which X is a linear or branched alkylene chain.
  • X is a linear or branched alkylene chain.
  • hydrocarbon chain a chain comprising carbon and hydrogen atoms.
  • the L-diamine acid of formula (II), as defined above is brought into the presence of at least one enzyme and / or at least one polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase, obtained from a recombinant expression vector expressing these enzyme (s) or these homologous polypeptide (s).
  • ornithine cyclodeaminase any enzyme capable of cyclizing a diamine acid, more precisely an amino- ⁇ -amino acid and in particular omithine and lysine.
  • the omithine cyclodeaminase to which reference is made in the remainder of the text is preferably the omithine cyclodeaminase (EC 4.3.1.12) of the Agrobacterium C58 strain.
  • the omithine cyclodeaminase of the C58 ⁇ 'Agrobacterium strain, encoded by a gene carried by the plasmid TiC58, is described by N. Sans et al., Eur. J. Biochem., 173, (1988), 123-130, and its polypeptide sequence is also available on Genbank (gi: 68365).
  • polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase is meant the polypeptides having an amino acid sequence homologous to that of an ornithine cyclodeaminase, in particular that of the C58 strain of Agrobacte um.
  • homologous sequences can be defined as the sequences similar to at least 25% of the amino acid sequence of the ocd ⁇ 'Agrobacterium gene and having ornithine cyclodeaminase activity as described by R. N. Costiiow et al., J. Biol. Chem., 246 (21), (1971), 6655-60.
  • similar refers to the perfect resemblance or identity between the amino acids compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity.
  • This search for similarities in a polypeptide sequence takes into account conservative substitutions which are amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions for the uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid); amino acids with apolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine).
  • amino acid substitutions for the uncharged side chains such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine
  • homologous amino acid sequence any amino acid sequence which differs from the amino acid sequence of omithine cyclodeaminase encoded by the ocd ⁇ 'Agrobacterium gene by substitution, deletion and / or insertion of an amino acid or of a reduced number of amino acids, in particular by substitution of natural amino acids with non-natural amino acids or pseudo-amino acids at positions such that these modifications do not significantly affect the biological activity of the encoded polypeptide.
  • a homologous amino acid sequence is similar to at least 35% of the sequence of the polypeptide encoded by the ocd gene of Agrobacterium, preferably at least 45%.
  • Homology is generally determined using sequence analysis software (e.g., Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705, U.S.A.). Similar amino acid sequences are aligned to obtain the maximum degree of homology (i.e. identity or similarity, as defined above). To this end, it may be necessary to artificially introduce spaces ("gaps") in the sequence. Once the optimal alignment has been achieved, the degree of homology is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical, relative to the total number of positions.
  • sequence analysis software e.g., Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705, U.S.A.
  • polypeptides have in common to exhibit an activity of ⁇ - ⁇ - or ⁇ - ⁇ -diamines-deaminase activity, without this having necessarily been established up to now.
  • homologous sequences are included the sequences of the polypeptides homologous to the omithine cyclodeaminase of Agrobacterium found in microorganisms belonging to the genera Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rizobium Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus, and Streptomyces.
  • Streptomyces lo ⁇ densis ATCC-11415
  • polypeptides homologous to the omithine cyclodeaminase of Agrobacterium found in eukaryotic organisms such as Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus fuliginosus, Mus musculus, and Rattus norvegicus and listed in table 2 below:
  • these polypeptides are encoded by genes homologous to that of the omithine cyclodeaminase of the C58 strain of Agrobacterium.
  • gene homologous to that of the omithine cyclodeaminase of the C58 strain of Agrobacterium is meant any gene having: a) a nucleotide sequence similar to the coding sequence of the omithine cyclodeaminase gene of the C58 strain of Agrobacterium; or b) a nucleotide sequence hybridizing with the coding sequence of the omithine cyclodeaminase gene of the C58 strain of Agrobacterium or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions; or c) a nucleotide sequence coding for a polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase of Agrobacterium as defined above or having an activity of ornithine cyclodeaminase.
  • such a homologous nucleotide sequence according to the invention is similar to at least 75% of the sequence of the ocd gene of Agrobacterium or of the pipA, rapL, pipA * gene of sequence SEQ ID No. 1, rapL * of sequence SEQ ID No. 2 and rapL * L * of sequence SEQ ID No. 5 defined below, more preferably at least 85%, or at least 90%.
  • such a homologous nucleotide sequence hybrid specifically to the sequence complementary to the sequence of the ocd gene of Agrobacterium or of the pipA, rapJL gene, pipA of sequence SEQ ID No. 1, rapL * of sequence SEQ ID No. 2 and rapL * L * of sequence SEQ ID No. 5 defined below, under stringent conditions.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • the hybridization temperature can preferably be 5 to 10 ° C below Tm, and the hybridization buffers used are preferably force solutions high ionic content such as 6xSSC solution for example.
  • similar sequences used above refers to the perfect resemblance or identity between the nucleotides compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity. This search for similarities in the nucleic sequences distinguishes, for example, purines and pyrimidines.
  • a homologous nucleotide sequence therefore includes any nucleotide sequence which differs from one of the identified sequences, by mutation, insertion, deletion or substitution of one or more bases, or by the degeneration of the genetic code.
  • Such homologous sequences can be obtained from microorganisms belonging to the genera Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus. Thermoplasma, Staphylococcus and Streptomyces.
  • Mention may in particular be made of the sequences of the genes coding for polypeptides homologous to the omithine cyclodeaminase of Agrobacterium found in the species or strains listed in Table 1 above.
  • rapL genes of Streptomyces hygroscopicus and pipA of Streptomyces pristinaespirales whose sequence is described respectively by Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92 (17), (1995), 7839-43 and in WO-A1 -9601901.
  • the compound of general formula (II) or the enantiomeric mixture comprising an L-10 amino acid of formula (II) and a corresponding D-amino acid, their salts or derivatives in variable proportions is placed in the presence of a suspension of the microorganism producing the polypeptide homologous to the omithine cyclodeaminase.
  • Preferred homologous genes as described above are synthetic genes obtained by site-directed mutagenesis as described below.
  • the compound of formula (II) or the enantiomeric mixture comprising an L-diamine acid of formula (II) and a corresponding D-diamine acid in variable proportions is brought into contact with an enzyme in a purified state.
  • the compound of formula (II) or the enantiomeric mixture comprising an L-diamine acid of formula (II) and a corresponding D-diamine acid in variable proportions is
  • polypeptides as described above allow, under the conditions of the invention, the stereospecific synthesis of the compounds of formula (I) of the invention without requiring the exogenous addition of NAD to the reaction medium.
  • a compound of formula (II) or a mixture of enantiomers of the compound of formula (II) and of D-diamine acid is added to the enzymatic preparation or to the optionally permeabilized cell suspension. corresponding to a concentration greater than approximately 0.05 M, preferably greater than approximately 01 M, this same concentration being less than approximately and 3M, preferably less than 2.5 M, their salts or derivatives and they are left to incubate at a temperature between 10 ° C and 100 ° C, advantageously between 20 ° C and 70 ° C, preferably between 25 ° C and 45 ° C, for a period between a few hours and several days, with stirring.
  • the compound of formula (I) is in the form of an ammonium salt.
  • the product obtained can be collected by precipitation, crystallization or ion exchange chromatography.
  • L-lysine or a mixture of L- and D-lysine L-thialysine (S-2-aminoethyl-L-cysteine), L-ornithine, a mixture of L- and D- 5- (R, S) -hydroxylysine, a mixture of L- and D - azalysin ( ⁇ -N- 2 aminoethyldiaminopropionic acid).
  • the overproduction of the polypeptide with ornithine cyclodeaminase activity is particularly advantageous.
  • the gene of interest coding for a polypeptide as defined above is introduced into a host microorganism, preferably overexpressing the polypeptide.
  • a vector containing a nucleic acid comprising one of the nucleotide sequences as defined above or a homologous sequence is transferred into a host cell which is cultured under conditions allowing expression, preferably overexpression of the corresponding polypeptide.
  • the nucleic acid sequence of interest can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to elements allowing the regulation of its expression, such as in particular promoters, activators and / or transcription terminators. .
  • the signals controlling the expression of the nucleotide sequences are chosen as a function of the cell host used.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods.
  • the plasmids pTZ18 Sigma, St-Louis
  • pQE70 Qiagen, Kunststoff
  • PQE60 Qiagen, Kunststoff
  • the QIAGEN plasmids When used, the QIAGEN plasmids had the major drawback of involving the formation of polyhistidines in the enzymes obtained. Also, these plasmids must be modified to overcome this drawback. The coding sequences must thus be modified or disrupted. These modifications did not result in a difference in terms of level of expression of the gene coding for cyclodeaminase.
  • the expression vectors are introduced into the host cells and these are cultured under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • Examples of host cells include in particular E. coli, preferably the Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli ⁇ 2033, and Escherichia co // K12 (MG1655) strains.
  • the heterologous gene is modified so as to comprise a proportion of less than 65%, advantageously less than 55% of G + C bases, while coding for the same polypeptide as the native gene or a homologous polypeptide as defined above.
  • the third base of the codon, or even the second base of the codon when the latter is G or C is replaced if appropriate by A or T, when the codon obtained corresponds to the same amino acid as that coded by the native codon.
  • the modified genes which have made it possible to obtain the best levels of expression and also the highest yields of ⁇ -imino-cyclic acids are those in which the native codons have been replaced for a given amino acid of the polypeptide having the activity amino acid cyclodeaminase by the following respective codons shown in Table 3.
  • the modified genes were obtained by assembling sections obtained by PCR and directed mutagenesis from the corresponding native genes.
  • modified pipA * and rapL ** genes having the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 5 respectively, shown in the appendix to the present application.
  • Another object of the invention is the polynucleotides corresponding to these modified genes.
  • the pipA * gene was obtained from the sequence of the polypeptide coded by the pipA gene from Streptomyces pristinaespiralis shown in the appendix as sequence SEQ ID No. 3.
  • the rapL ** gene was obtained from the sequence of the polypeptide encoded by the rapL gene from Streptomyces hygroscopicus shown in the appendix as sequence SEQ ID No. 4.
  • the modified genes are inserted into cloning vectors as described above for the native genes transfected into recombinant hosts.
  • the host microorganisms, where appropriate, recombinant comprising a gene existing in the native state or modified as described above are cultured, optionally in the presence of an expression inducer, for example IPTG.
  • the cells When the cells reach a density of the order of at least one absorbance unit at 600 nm for standard cultures and of the order of a few tens or more of such units for high density cultures, they are separated from their culture medium and subjected to a permeabilization treatment which may be physical (for example, alternative freezing and thawing treatments, ultrasound or French press treatments, mechanical grinding) or chemical (for example, addition of solvent or complexing agents such as EDTA), or enzymatic (for example, addition of lysozyme).
  • a permeabilization treatment which may be physical (for example, alternative freezing and thawing treatments, ultrasound or French press treatments, mechanical grinding) or chemical (for example, addition of solvent or complexing agents such as EDTA), or enzymatic (for example, addition of lysozyme).
  • the cell suspension can then be used to prepare the products of formula (II) as described above where the protein of interest produced can then be recovered and purified.
  • concentrations expressed in grams of dry cells per liter of cell suspension, are obtained greater than approximately 10 g / L, advantageously greater than 30 g / L. These same concentrations are, as a general rule, less than 60 g / L, or even less than 50 g / L, without this however indicating an impassable limit.
  • concentrations expressed in grams of dry cells per liter of cell suspension, are obtained greater than approximately 10 g / L, advantageously greater than 30 g / L. These same concentrations are, as a general rule, less than 60 g / L, or even less than 50 g / L, without this however indicating an impassable limit.
  • the purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide obtained can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques at using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • the host cells producing the polypeptide having the desired enzymatic activity are destroyed so that their cytoplasmic content is released in the medium containing the diamino acid substrate whose two amino functions are distant (by the shortest route when several paths are possible) of four or five links, in L form or in the form of a mixture of enantiomers and so as to allow the enzyme and its substrate to be brought into contact.
  • Example 1 PCR amplification of the Streptomyces pristinaespiralis pipA gene from the total DNA of the strain.
  • the Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486 strain was cultured at 28 ° C for 24 h in TSB medium (DIFCO), then 10 ml of the culture thus obtained were centrifuged for 5 min at 11000 g. The centrifugation pellet was taken up in 1 ml of a 10 mM Tris pH 8.0 solution containing 2 mM EDTA and 5 mg / ml of lysozyme. The suspension thus obtained was allowed to stir for 30 min at 37 ° C, then 100 ⁇ L of a 20% SDS solution was added. After incubation at 30 ° C for a few minutes, 125 ⁇ L of a proteinase K solution at 2 mg / ml was further added.
  • TSB medium DIFCO
  • the DNA extraction was continued using the reagents of the DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Kunststoff) and respecting the supplier's instructions.
  • the DNA thus extracted was purified by phenol / chloroform extraction, precipitated with ethanol and taken up in 100 ⁇ l of water.
  • the pipA gene was amplified by PCR from the total DNA thus prepared using, for the synthesis of the primers, its sequence described in patent WO-A1 -96/01901.
  • the reaction was carried out in a volume of 50 ⁇ L of 20 mM Tris-HCI buffer pH 8.8 containing 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 2 mM MgS0 4 , 0.1% Triton X-100, 2 ⁇ L of total DNA solution, 250 ⁇ M of each of the four dNTPs, 1 unit of Vent DNA Polymerase (BioLabs) and 500 nM of each of the following two oligodeoxynucleotides: 5 'CCCGAATTCCGACACCACGCACGGACGAGAAG 5' CCCTGCAGGCATCTCTCTCCTCGCGAGGGC.
  • the PCR protocol applied started with a denaturation step at 97 ° C for 4 min followed by an incubation at 80 ° C for 1 min, and continued with 5 cycles characterized by a 1 min denaturation sequence at 97 ° C, followed by 1 min of hybridization at 55 ° C, then 1 min 30 sec of elongation at 72 ° C. Then 40 cycles characterized by a sequence of 1 min of denaturation at 97 ° C, followed by 1 min of hybridization at 50 ° C, then 1 min 30 sec of elongation at 72 ° C were carried out. The protocol ended with an elongation step at 72 ° C for 10 min.
  • the fragment thus amplified was purified on the column of the Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), then digested with EcoRI and Pstl and cloned in the vector pTZ18 (SIGMA, St-Louis, MO) previously cut.
  • Two plasmid constructs (pKT 35, pKT 36) obtained following independent PCR amplifications were sequenced. The sequences of these two fragments thus cloned were identical.
  • the specified protein, of sequence SEQ ID No. 3 however differs from an amino acid (alanine) at position 87 relative to the sequence published in WO-A1 -96/01901 (glycine).
  • SEQ ID No. 3 differs from an amino acid (alanine) at position 87 relative to the sequence published in WO-A1 -96/01901 (glycine).
  • the Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 strain was cultured at 28 ° C for 24 h in TSB medium (DIFCO). 50 ⁇ L of the cell suspension thus obtained were subjected to the following heating and cooling stages: 30 sec at 65 ° C, 30 sec at 8 ° C, 90 sec at 65 ° C, 180 sec at 97 ° C, 60 sec at 8 ° C, 180 sec at 65 ° C, 60 sec at 97 ° C, 60 sec at 65 ° C, 20 min at 80 ° C.
  • the amplification of the rapL gene was carried out by PCR from a suspension of cells using for the synthesis of the primers its sequence described (Schwecke et al., 1995).
  • the reaction was carried out in a volume of 50 ⁇ L of 20 mM Tris-HCI buffer pH 8.8 containing 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4d 2 mM MgS0 4 , 0.1% Triton X-100, 10 ⁇ L of the suspension of cells previously treated, 250 ⁇ M of each of the four dNTPs, 1 unit of Vent DNA Polymerase (BioLabs) and 500 nM of each of the following two oligodeoxynucleotides: 5'CCCGAATTCGAGGTTGCATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAG 5'CCCAAGCTTAGATCTTTATTACAGCGAGAGAC
  • the PCR protocol applied started with a denaturation step at 97 ° C for 4 min followed by an incubation at 80 ° C for 1 min, and continued first with 5 cycles characterized by a sequence of 1 min denaturation at 97 ° C, followed by 1 min hybridization at 60 ° C, then 1 min 30 sec elongation at 72 ° C, then by 5 new cycles characterized by a sequence of 1 min denaturation at 97 ° C, followed by 1 min of hybridization at 52 ° C, then 1 min 30 sec of elongation at 72 ° C.
  • the fragment thus amplified was purified on the column of the Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), then digested with EcoRI and Hindlll and cloned in the vector pTZ18 previously cut.
  • Three plasmid constructs obtained (pKT30, pKT31, pKT34) following independent PCR amplifications were sequenced. The sequences of these three fragments thus cloned were identical.
  • the protein of the invention contains in positions 50, 84, 102, 127 and 129 respectively a residue of threonine, glutamine, aspartic acid, alanine and alanine.
  • the pipA gene with a size of 1066 bp derived from Streptomyces pristinaespiralis and whose sequence is described in patent WO-A1 -96/01901, is composed of a G + C proportion of 69.6%.
  • This gene has been rewritten according to the optimized genetic code for expression in Escherichia coli described in Table 3.
  • the rewritten gene pipA *, of sequence SEQ ID No. 1 is now composed of a G + C proportion of 38% .
  • the threonine residue 97 was coded by ACC instead of ACT provided by the code in Table 3.
  • Two TAA translation termination codons were also added at positions 15 and 1080 ( 1st codon nucleotide), respectively of the sequence SEQ ID No. 1, and unique restriction sites EcoRI and Ncol on the one hand, Hindlll on the other hand, were introduced respectively 5 'and 3' of the gene thus allowing its insertion into a cloning vector.
  • the synthesis of the pipA * gene was carried out by assembling two sections EcoRI - Kpnl (section 1 of 305 bp - nucleotide 1 to nucleotide 304) and Kpnl - Hindlll (section 2 of 798 bp - nucleotide 305 to nucleotide 1092). Each section was synthesized by extension of single-stranded oligonucleotides with a length of 50 to 60 overlapping nucleotides ("sense" strands and "anti-sense” strands), followed by amplification with 5 'end oligonucleotides and 3 '.
  • the PCR reaction was carried out in a volume of 100 ⁇ L of 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.8 containing 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 2 mM MgS0 4 , 0.1% Triton X-100, 0.01 ⁇ M of the oligonucleotides listed below, 0.3 mM of each of the four dNTPs and 2 units of Vent DNA Polymerase (BioLabs).
  • the PCR protocol applied was composed of 30 cycles characterized by a 30 sec sequence of denaturation at 96 ° C, followed by 30 sec of hybridization at 55 ° C, then 30 sec of elongation at 72 ° C.
  • cycle number 10 the oligonucleotides of the 5 '(PIPAUP) and 3' (PIPAD1) ends were added at a final concentration of 0.5 ⁇ M. At the end of cycle 30, an elongation period of 2 minutes at 72 ° C was added.
  • oligonucleotides were used for the reaction: PipaVO, PipaV2, PipaV4, PipaV6, PipaV ⁇ , PipaD4, PipaD5, PipaD ⁇ and PipaD7.
  • the sequences of these oligonucleotides are described in Table 4.
  • the PCR product thus obtained was purified on the column of the Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), then digested successively with the restriction enzymes Kpnl and EcoRI, and again purified on agarose gel. An apparent size band of 300 bp was extracted from the gel using the Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN).
  • This purified PCR product was then ligated to the vector pTZ18, previously digested with the enzymes EcoRI and Kpnl and purified on agarose gel, by T4 DNA ligase (BioLabs). The ligation reaction was carried out overnight at 16 ° C in the ligation buffer provided with the enzyme.
  • the ligation product was then transformed into strain E, dialJi DH5 ⁇ CIP104738 (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166, (1983), 557-580) by thermal shock and selected recombinant clones on LB medium. (DIFCO) agar supplemented with ampicillin (100 mg / L).
  • the plasmids contained in the ampicillin-resistant transformants were isolated using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) plasmid preparation system. For four of these plasmids whose analysis by appropriate restriction enzymes showed an insert of expected size, the EcoRI-Kpn1 fragments were sequenced. Each of the sequences of the four constructs contained between one and three deviations from the expected sequence.
  • Plasmid pSP39 was thus obtained.
  • the sequencing of the EcoRI-Kpn1 fragment of the plasmid pSP39 was carried out and the sequence obtained was found to be in conformity with that expected.
  • section 2 The PCR reaction for the synthesis of the Kpnl-Hindlll section was carried out as described for section 1 with the exception of the elongation period, the duration of which was extended to 1 minute for the 30 cycles and to 4 min at the end of the protocol.
  • cycle number 10 the oligonucleotides of the 5 '(PIPAV29) and 3' (PIPAD3) ends were added to a final concentration of 0.5 ⁇ M.
  • oligonucleotides were used for the reaction: PipaV ⁇ , PipaVIO, PipaV12, PipaV14, PipaV16, PipaV18, PipaV20, PipaV22, PipaV24, PipaV26, PipaV28, PipaD8, PipaD9, PipaDIO, PipaD11, PipaDa, PipaD12, PipaDa PipaD17.
  • the sequences of these oligonucleotides are described in Table 4.
  • the PCR product was purified on the column of the Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), then digested with the restriction enzymes Kpnl and Hindlll and ligated to the vector pTZ18 previously digested with the same enzymes.
  • the transformation of the E. coli DH5 ⁇ strain, and the selection of the transformants and the analysis of the plasmids were carried out as described above for section 1.
  • the plasmid pSP25 for which the sequence of Kpnl-Hindlll fragment had five deviations from the expected sequence was subjected to several stages of site-directed mutagenesis (Ansaldi et al., 1996, ibid.) to correct these errors. Plasmid pSP42 was thus obtained.
  • PipaV4 5 'CAGAAATTGGTCGTGGTGAACGTCATTTATCTCCATTACGTGGTGGTTTA
  • Example 4 Total synthesis by ligation of the rapL * gene, and obtaining the rapL ** variant
  • the rapL gene 1029 bp in size, derived from Streptomyces hygroscopicus and the sequence of which has been published (Schwecke et al., 1995, ibid.), Is composed of a G + C proportion of 68%.
  • This gene was rewritten by following the genetic code used for the synthesis of the pipA * gene in Example 3.
  • the rewritten gene rapL *, of sequence SEQ ID No. 2 is now composed of a G + C proportion of 38 %.
  • the threonine 97 residue was coded by ACC instead of ACT as provided by the code shown in Table 3.
  • Two TAA translation termination codons were also added and restriction sites unique EcoRI and SphI on the one hand, Hindlll on the other hand were introduced respectively in 5 ′ and 3 ′ of the gene thus allowing its insertion into different cloning vectors.
  • the total synthesis of the rapL * gene was carried out by assembling the three sections EcoRI-Kpnl (section 1 of 305 bp), Kpnl-Pstl (section 2 of 316 bp), and Pstl-Hindlll (section 3 of 440 bp). Each section was synthesized by ligation of phosphorylated single stranded oligonucleotides in 5 ′ with a length of 50 nucleotides on average, covering the entire sequence to be cloned (“sense” strands and “antisense” strands) and overlapping . The sequences and positions of these oligonucleotides are described in Table 5.
  • oligonucleotides mixed equimolarly (1 ⁇ M) in the overlap buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8; 0.08 M NaCl) in a final volume of 20 ⁇ L, were heated 10 minutes to 70 ° C and kept in the heating block until the temperature returned to room temperature.
  • the product thus obtained was then ligated by T4 DNA ligase overnight at 16 ° C in the presence of vector pTZ18 (vector / oligonucleotide molar concentration ratio 1/100) previously digested with the appropriate restriction enzymes.
  • the ligation product was used to transform by electroporation the ⁇ 2033 strain (E. çoli K12, pjro, thj, rpsL, hsdS, ⁇ laçZ, F '( ⁇ lacZM15. Iacl q , traD36. ProA +, proB +)) and the recombinant clones have were selected on LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, 0.5 mM IPTG and 30 ⁇ g / ml X-Gal.
  • Plasmids contained in several ampicillin-resistant dual transformants were isolated using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) plasmid preparation system. For each section, the inserts of two to four plasmids whose analysis by appropriate restriction enzymes showed a fragment of expected size, were sequenced.
  • section 1 The plasmid pTZ18 cut with EcoRI and Kpnl was ligated with the following oligonucleotides (whose sequence is illustrated in Table 5): lcdV-1, lcdV-2, lcdV-3, lcdV-4, lcdV-5 , lcdV-6, lcdVrev-16, lcdVrev-17, IcdVrev- 18, lcdVrev-19, lcdVrev-20, lcdVrev-21, lcdVrev-22.
  • the plasmid pSP3 the insert sequence of which had only two deviations from the expected sequence, was retained. Both errors were corrected by site-directed mutagenesis according to a published method (Ansaldi et al., 1996, ibid.) And the corrections confirmed by sequencing the insert of the resulting plasmid pSP14.
  • the plasmid pSP8 the insert sequence of which included only a deviation from the expected sequence, was retained.
  • the error was corrected by site-directed mutagenesis (Ansaldi et al., 1996, ibid.) And the correction confirmed by sequencing the insert of the resulting plasmid pSP15.
  • the plasmid pSP12 the insert sequence of which included only a deletion of 25 bp and a point deviation was retained.
  • the two errors were corrected by site-directed mutagenesis (Ansaldi et al., 1996, ibid.) And the corrections confirmed by sequencing the insert of the resulting plasmid pSP26.
  • the rapL ** variant was obtained from the rapL * gene of the plasmid pSP33 by introducing by directed mutagenesis (Ansaldi et al., 1996, ibid.)
  • the five changes necessary so that the protein coded by the rapL ** gene is the same as that coded by the amplified gene and sequence described in Example 2 and corresponds to the sequence SEQ ID No. 4, while respecting the genetic code described in Table 3.
  • a plasmid pSP36 derived from plasmid pTZ18 and containing the rapL ** gene was thus obtained.
  • Anti-sense" strand lcdVrev-16: 5 'p-CAACAATAG TTGGTAAATTAAAA-3' lcdVrev-17: 5 'p-CGTTCAAAATTTTCTGGAGAATAAGAAACAGTTTTCATAGTAACACCAAT- 3' lcdVrev-18: 5 '
  • GCA GTT GCA TCT GTT A -3 'lcdV-9 5' p-CT ACT CGT TTATTAGCACGTCCAGGT TCT ACT ACT TTA GCA TTA ATT GGT -3 'lcdV-10: 5' p- GCA GGT GCACAA GCAGTTACT CAA GCA CAT
  • TGTGCTTGAGTAACTGCTTGTGCACCTGCACCAATTAATGCTAAAGTAGTA-3 lcdVrev-13: 5 'p- GAACCTGGACGTGCTAATAAACGAGTAGTAACGA-TAG' ACT-ACGATATAT ' Pstl-Hindlll fragment
  • AAAATGTCTATT GAAT -3 'lcdV-21 5' p-CTACT CCA GAA GAT GTT TTA GAT CCA TAT
  • Example 5 Overexpression of the pipA * gene in Escherichia coli.
  • the pipA * gene was cloned into the vector pQE60 (QIAGEN) (plasmid whose coding sequences have been previously modified as indicated above), between the Ncol and HindIII restriction sites from the plasmid pSP43 constructed in Example 3.
  • the resulting plasmid pSP47 was introduced into a strain of E. coli K12 MG1655 (Vidal et al., 1998) expressing the lacl gene from the helper plasmid pREP4 (QIAGEN).
  • the +75 strain thus obtained was cultured in LB medium and the expression of the pipA * gene was induced by the addition of IPTG according to the supplier's protocol.
  • Total cell proteins were separated by polyacrylamide / SDS gel electrophoresis and stained with Coomassie blue. A protein with a molecular weight of 36 kD was detected and its expression level was estimated at approximately 5% of total proteins.
  • Example 6 Overexpression of the pipA, rapL, rapL *, and rapL ** genes in Escherichia coli.
  • a strain of E. coli overexpressing the pipA gene (strain +353) was obtained by introducing the plasmid pKT37.
  • This plasmid was obtained from the plasmid pKT36, described in Example 1, by cloning of the gene of interest between the Ncol and HindIII restriction sites of the vector pQE60.
  • strains of E. coli overexpressing the rapL (strain +38), rapL * (strain +60), or rapL ** (strain +73) genes were obtained by respectively introducing the plasmids pSP32, pSP37, or pSP45.
  • These plasmids pSP32, pSP37, or pSP45 were obtained respectively from the plasmids pKT30, pSP33, or pSP36, described in Examples 2 and 4, by cloning of the gene of interest between the SphI and Hindlll restriction sites of the vector pQE70.
  • Example 7 Amplification by PCR and overexpression of the ocd gene Agrobacterium tumefaciens in Escherichia coli.
  • CIP 104333 was carried out as described elsewhere (Hayman et al., Mol. Gen. Genêt, 223, (1990), 465-473).
  • the oçd gene (Sans et al., (1988), ibid.) was amplified by PCR from this preparation of the plasmid Ti-C58.
  • the reaction was carried out in a volume of 50 ⁇ L of 20 mM Tris-HCI buffer pH 8.8 containing 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 2 mM MgS0 4 , 0.1% Triton X-100, 2 ng of plasmid Ti-C58, 200 ⁇ M of each of the four dNTPs, 1 unit of Vent DNA Polymerase (BioLabs) and 500 nM of each of the following two oligodeoxynucleotides: 5'CCCGCATGCCTGCACTTGCCAACC 5'CCCAGATCTTAACCACCCAAACGTCGGAAA
  • the PCR protocol applied started with a denaturation step at 94 ° C for 2 min followed by 30 cycles characterized by a 30 sec sequence of denaturation at 94 ° C, followed by 30 sec hybridization at 52 ° C, then 1 min 30 sec of elongation at 72 ° C.
  • the fragment thus amplified was digested with Ncol and Bg] ll and cloned into the vector pQE70 (QIAGEN) (plasmid whose coding sequences have been previously modified as indicated above) previously cut.
  • the Ncol-Bqll1 fragment of the plasmid pKR7 thus obtained was sequenced.
  • the specified protein differs by two amino acids from the published sequence (Sans et al., (1988), ibid.), Namely the residue 212Gln replaced by the lysine and residue 29711e replaced by leucine. The two deviations were confirmed by sequencing a PCR amplification product obtained independently.
  • strain +78 was obtained by introducing the plasmid pKR7.
  • the level of expression of the protein encoded by the oçd gene was determined as described in Example 5.
  • a protein of molecular weight conforming to that expected was detected with an expression level of approximately 5% of the total protein.
  • the +75 strain constructed in Example 5, is cultivated in the MS mineral medium (Richaud et al., J. Biol. Chem., 268, (1993), 26827-35) containing 2 g / L glucose, 50 mg / L ampicillin and 30 mg / L kanamycin. After 14 hours of culture, 400 mL of MS mineral medium containing 2 g / L glucose are seeded 1/10 with the preculture of the +75 strain. This culture is placed at 37 ° C. with stirring until reaching an OD 6 6 ohm of 0.7. The pipA * gene is then induced for 4 hours at 37 ° C by the addition of 1 mM IPTG to 200 ml of culture.
  • a control culture of 200 ml without adding IPTG is also carried out.
  • the two cultures are centrifuged at 13,000 g and the cell pellets are taken up in MS mineral medium so as to concentrate the cells 100 times.
  • the cells are then permeabilized by two stages of freezing / thawing at -20 ° C promoting access of the substrate to the enzyme.
  • the enzymatic reaction is carried out at 37 ° C. with stirring.
  • a 300 ⁇ L sample of each culture is taken and centrifuged at 13,000 g so as to recover the supernatant.
  • a diluted solution supernatants is then deposited on a thin layer of silica and in parallel dosed by HPLC.
  • HPLC assay (conditions described below) indicates a concentration of 40 g / L of L-pipecolate after 20 hours. The enantiomeric excess is greater than 95%.
  • L-lysine were produced with the strains +38, +60, +73, +78 and +353 constructed in Examples 6 and 7, under the same conditions as those applied above for the strain +75.
  • Analysis by chromatography of the respective supernatants on a thin layer of silica after staining with ninhydrin only revealed production of L-pipecolic acid with the strains
  • L-thiomorpholine-2-carboxylic acid was carried out from a cell suspension of the strain +75 prepared as described in Example 8.
  • L-thialysine S- (2-aminoethyl) -L -cysteine) (SIGMA) is added to a final concentration of 1 M.
  • L-pipecolic was produced from a cell suspension of the +75 strain prepared as described in Example 8.
  • 5-R, S-hydroxy-D, L-lysine (SIGMA) is added to 1 M final .

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule (I), caractérisé en ce que l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule (II), ou un mélange énantiomère comprenant un tel L-acide diaminé et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables, en présence d'une ornithine cyclodéaminase ou d'un polypeptide homologue à l'ornithine cyclodéaminase.

Description

PREPARATION STEREOSELECTIVE DE L-ACIDES AMINES CYCLIQUES
La présente invention concerne la préparation stéréosélective de L-acides aminés cycliques ou de leurs sels et dérivés.
Il existe une demande grandissante d'acides aminés cycliques notamment la L-proline, l'acide L-pipécolique ou l'acide L-pipérazine-2- carboxylique et leurs sels en raison de leur utilisation pour la synthèse de nouveaux médicaments. Étant donné qu'il s'agit de molécules chirales, les synthèses en sont difficiles.
D'un point de vue biosynthétique, seule la formation du cycle de la
L-proline a été élucidée et décrite. Elle peut s'effectuer selon deux voies :
- soit par cyclisation de l'acide glutamique semialdéhyde pour former l'acide Δ1-pyrroline-5-carboxylique, suivie d'une réduction du cycle insaturé; - soit directement à partir de la L-ornithine par cyclodéamination.
Toutefois, ces procédés n'apportent pas de solution satisfaisante pour la synthèse des acides aminés cycliques chiraux à l'échelle industrielle.
Par ailleurs, une activité enzymatique de conversion directe de la L-ornithine en L-proline a été décrite pour la première fois chez Clost dium (R. N. Costiiow et al., J. Biol. Chem., 246 (2±), (1971 ), 6655-60 ; W. L. Muth et al., J. Biol. Chem., 249 (23), (1974), 7457-62) et une conversion totale de 20 mM de L-ornithine en L-proline a été obtenue in vitro en présence de l'enzyme partiellement purifiée. Cette ornithine cyclodéaminase (ocd) de Clostndium possède la particularité d'être activée par le NAD, un cofacteur impliqué habituellement dans les réactions d'oxydation, et semble être assez est inhibée en présence de 40 mM de D-omithine, tandis qu'en présence de 40 M de L-lysine son activité n'est pas réduite. La possibilité que la cyclodéaminase agisse sur la L-lysine n'a ainsi même pas été envisagée par ces auteurs, probablement parce qu'il est très souvent admis que les enzymes du métabolisme sont très spécifiques.
Quelques années plus tard, la corrélation entre l'expression d'un gène û'Agrobacterium impliqué dans la dégradation de la nopaline et une activité ocd a été établie (N. Sans et al., Eur. J. Biochem., 173, (1988), 123- 130), et le gène codant pour ocd a alors été séquence.
Un deuxième gène très homologue a par la suite été trouvé dans une autre souche û'Agrobacterium par les mêmes auteurs (U. Schindler et al., J. Bacte ol., 171, (1989), 847-854). Les propriétés des deux cyclodéaminases ont été étudiées et seule une activité sur la L-ornithine a été mise en évidence. Ainsi, de nouveau la possibilité que la L-Lysine soit un substrat de la cyclodéaminase n'a pas été envisagée, seul son effet inhibiteur a été examiné (Schindler et al., ibid.).
Depuis, le séquençage total ou partiel de nombreux organismes a permis d'identifier plusieurs nouveaux gènes ayant une homologie forte avec ce gène ocd û'Agrobacterium. Cependant, ni l'activité enzymatique du polypeptide codé par chacun de ces gènes, ni son spectre d'activité n'ont été étudiées, cette enzyme étant réputée spécifique de l'omithine. En particulier, la spécificité de ces enzymes et leur niveau d'activité catalytique restent inconnus alors que ce sont des éléments déterminants pour la productivité d'un procédé enzymatique.
Pour trois de ces gènes trouvés chez des Streptomyces producteurs de métabolites dérivés de l'acide L-pipécolique, une activité lysine cyclodéaminase pour le polypeptide codé a été postulée (WO-A1 -96/01901 ; L. E. Khaw et al., J. Bacteriol., 180, (1998), 809-814 ; I. Molnar et al., Gène, 169, (1996), 1-7 ; H. Motamedi ét al., Eur. J. Biochem., 249, (1998), 528-534).
Ainsi, il a été suggéré qu'une cyclodéaminase codée par le gène rapL (Khaw et al., ibid.) ou pipA (WO-A-9601901 ) pourrait être impliquée dans la voie de synthèse de la Rapamycine via une transformation de la lysine en acide pipécolique. À ce jour, même si elle a été parfois suggérée obiter dictum, aucune activité de cyclodéamination de L-lysine en acide L-pipécolique n'a toutefois été mise en évidence, exemplifiée, ou quantifiée. Cette méconnaissance de la réaction réellement catalysée par ces gènes est démontrée par la diversité des hypothèses sur la voie biologique menant à l'acide pipécolique par certains de ces auteurs qui relatent également dans ces publications que la conversion de lysine en acide pipécolique pourrait se faire via la D-lysine (Khaw et al., ibid.).
D'autres études biochimiques ont décrit la formation d'acide L-pipécolique à partir d'acide α-aminoadipique par réduction d'un cycle insaturé (A. J. Aspen et al., Biochemistry, 7(4), (1962), 606-612) chez Aspergillus et, sur la base d'expériences de marquages isotopiques, de telles voies de biosynthèse avaient été également proposées chez un Streptomyces par les hommes de l'art (J. W. Reed et al., J. Org. Chem., 54(5), (1989), 1161-65).
Le fait que les enzymes de biosynthèse de la L-proline, et en particulier l'omithine cyclodéaminase, n'aient pas été proposées pour fabriquer de nouveaux acides aminés cycliques constitue une preuve supplémentaire que, de l'opinion générale des hommes de métier, il n'était pas possible de réaliser la biosynthèse de l'acide pipécolique de cette façon. Ainsi plusieurs procédés biotechnologiques de bioconversion conduisant aux formes énantiomériquement pures, et plus particulièrement à la forme L de l'acide pipécolique ou de l'acide pipérazine-2-carboxylique ont été protégés par des brevets depuis quelques années. Les exemples figurant dans ces publications font état d'une production maximale de 15 g/L de l'acide aminé cyclique : aucune mention n'a été trouvée de l'emploi d'une cyclodéaminase.
Tous ces documents, à l'exception d'un seul, décrivent la résolution d'un substrat racémique. Ils emploient des activités de type
N-acylase (WO 95/10604, WO 99/07873), amidase (EP-A-0 686 698), aminoacide oxydase (JP 06030789), nitrilase (JP 06038781 , JP 11127885) ou estérase (WO 00/12745) agissant sur des substrats adéquats.
L'ensemble de ces méthodes comporte par ailleurs un certain nombre d'inconvénients parmi lesquels on peut citer une limitation du rendement maximal à 50% sur le mélange racémique, la nécessité d'une séparation du produit ainsi formé et du substrat non transformable par l'enzyme pour récupérer la forme énantiomérique recherchée, et la nécessité du développement éventuel d'un recyclage de l'autre forme énantiomérique. Seul JP 06030781 décrit la conversion de la L-lysine, un substrat chiral commercialement disponible et peu onéreux, en acide L-pipécolique par divers isolats bactériens non-recombinants mais sans la séquence de réactions chimiques empruntée pour effectuer cette bioconversion. Les performances, en termes de rendement et de productivité, mentionnées dans ce document - à savoir une production en 7 jours d'environ 4,2 g/L d'acide L-pipécolique à partir de 10 g/L de L-Lysine - restent tout à fait insuffisantes pour qu'un tel procédé soit avantageux et économiquement compétitif. Un des buts de l'invention vise à obtenir des performances supérieures à celle connue de l'art antérieur, et notamment des productions en acide aminés cycliques de l'ordre de 5, 10 voire 20 fois supérieures ou plus à celles divulguées dans l'état de la technique.
La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de convertir avec des rendements élevés des solutions concentrées d'acides di-aminés en des solutions d' acides -imino-cycliques, notamment en solution aqueuse de sels d'ammonium d'acides α-imino-cycliques, en mettant en œuvre une enzyme codée par le gène de l'omithine cyclodéaminase (EC 4.3.1.12) de la souche û'Agrobacterium C58 ou par un gène homologue à celui-ci, ou des microorganismes recombinants surproduisant de telles enzymes.
L'invention a pour objet un procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule (I) ou d'un sel ou dérivé d'un acide aminé de formule (I) :
dans laquelle : * R-i est choisi parmi l'atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié comportant de 1 à 6 atomes de carbone et un radical acyle linéaire ou ramifié comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
* X représente une chaîne hydrocarbonée saturée, ou partiellement ou totalement insaturée, linéaire ou ramifiée en C1-C9, de préférence en C2-C4, comprenant éventuellement dans la chaîne et/ou en bout de chaîne un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi O, S,
P, NR2, R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en C1-C4, la dite chaîne étant également éventuellement substituée par un ou plusieurs radicaux, identiques ou différents choisis parmi -R, -OR, -SR, =0, -C(0)OR, -C(S)OR, -C(0)NR'R", -C(S)NR'R", -CN, -N02, -X', -MgX' (X' étant un atome d'halogène choisi parmi fluor, chlore, brome et iode), -NR'R", -NR'C(0)R, -SiR et -SiOR, R,
R' et R", identiques ou différents, représentant l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé, ou totalement ou partiellement insaturé, et comportant de 2 à 20 atomes de carbone, étant entendu que R' et R" peuvent former un cycle avec l'atome qui les porte, caractérisé en ce que : a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule (II) :
dans laquelle X et R-i sont tels que définis ci-dessus ; ou un sel ou dérivé de celui-ci, ou un mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule (II) et un D-acide diaminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables, de préférence en milieu aqueux, en présence d'une ornithine cyclodéaminase, ou d'un polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase, l'enzyme ou le polypeptide homologue étant obtenu à partir d'un vecteur d'expression recombinant exprimant la dite enzyme ou le dit polypeptide homologue, b) l'on récupère le L-acide aminé cyclique de formule (I) ou un sel ou dérivé de celui-ci en un excès énantiomérique d'au moins 80 %.
Par "dérivé d'acide aminé de formule (I) ou (II)", on entend un amide ou ester de ceux-ci.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet un procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule (I) ou d'un sel ou dérivé d'un acide aminé de formule (I) :
dans laquelle Ri représente H ou un groupe alkyle en Ci-Ce ou acyle en Cι-C6 et X représente une chaîne hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée en C2-C9, de préférence en C2-C4, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi O, S, NR2, R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en C1-C4, et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy, amino, ou halogène, caractérisé en ce que a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule (II) :
dans laquelle X et Ri sont tels que définis ci-dessus ; ou un sel ou dérivé de celui-ci, ou un mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule (II) et un D-acide diaminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables, de préférence en milieu aqueux, en présence d'une ornithine cyclodéaminase ou d'un polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase, l'enzyme ou le polypeptide homologue étant obtenu à partir d'un vecteur d'expression recombinant exprimant la dite enzyme ou le dit polypeptide homologue, et b) l'on récupère le L-acide aminé cyclique de formule I ou un sel ou dérivé de celui-ci en un excès énantiomérique d'au moins 80%.
Lorsque la chaîne hydrocarbonée comporte une ou plusieurs insaturations de nature éthylénique et/ou acétylénique, celles-ci ne sont de préférence pas portées par les atomes de carbone situés en position α des atomes d'azote formant les fonctions aminés de l'acide diaminé de formule (II).
On préfère également que, lorsque la chaîne hydrocarbonée comporte deux ou plus hétéroatomes, les dits hétéroatomes soient séparés par au moins deux atomes de carbone. Les composés de formule (I) obtenus selon le procédé de la présente invention comportent la plus souvent un cycle à 3, 4, 5, 6 ou 7 maillons qui sont les cycles les plus fréquemment rencontrés dans le domaine de la chimie organique. Les composés de formule (I) pour lesquels le cycle possède 5, 6 ou 7 maillons sont préférés et sont ceux qui paraissent les plus accessibles pour l'homme du métier. Le procédé de la présente invention ne saurait cependant se limiter à la synthèse de ces composés à cycles de 5, 6 ou 7 maillons.
On préfère en outre le procédé pour lequel le composé de formule
(I) comprend un cycle à six maillons, X représentant une chaîne hydrocarbonée à quatre maillons. Plus spécifiquement encore, le procédé est mis en oeuvre pour l'obtention d'un composé de formule (I) dans lequel X est une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée. Dans la présente invention, il doit être compris, par chaîne hydrocarbonée, une chaîne comportant des atomes de carbone et d'hydrogène.
Pour le procédé selon la présente invention, il doit être compris que le L-acide diaminé de formule (II), tel que défini ci-dessus, est mis en présence d'au moins une enzyme et/ou d'au moins un polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase, obtenus à partir d'un vecteur d'expression recombinant exprimant ces enzyme(s) ou ces polypeptide(s) homologue(s).
Par ornithine cyclodéaminase, on entend toute enzyme susceptible de cycliser un acide diaminé, plus précisément un amino-α- aminoacide et notamment l'omithine et la lysine. L'omithine cyclodéaminase à laquelle on se réfère dans la suite du texte est de préférence l'omithine cyclodéaminase (EC 4.3.1.12) de la souche d'Agrobacterium C58.
L'omithine cyclodéaminase de la souche C58 ό'Agrobacterium, codée par un gène porté par le plasmide TiC58, est décrite par N. Sans et al., Eur. J. Biochem., 173, (1988), 123-130, et sa séquence polypeptidique est également accessible sur Genbank (gi : 68365).
Par polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase, on entend les polypeptides ayant une séquence d'acides aminés homologues à celle d'une ornithine cyclodéaminase, notamment celle de la souche C58 d'Agrobacte um.
Ces séquences homologues peuvent être définies comme les séquences similaires à au moins 25 % de la séquence d'acides aminés du gène ocd ά'Agrobacterium et ayant une activité d'ornithine cyclodéaminase telle que décrite par R. N. Costiiow et al., J. Biol. Chem., 246 (21), (1971), 6655-60.
Le terme "similaires" se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
Plus généralement, par "séquence d'acides aminés homologue", on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence d'acides aminés de l'omithine cyclodéaminase codée par le gène ocd ά'Agrobacterium par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique du polypeptide codé. Avantageusement, une telle séquence d'acides aminés homologue est similaire à au moins 35 % de la séquence du polypeptide codé par le gène ocd d'Agrobacterium, de préférence au moins 45 %.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705, U.S.A.). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude, comme défini plus haut). À cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ("gaps") dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
Ces polypeptides ont en commun de présenter une activité d'acide α-δ- ou α-ε-diaminés-déaminase, sans que celle-ci ait nécessairement été établie jusqu'à présent.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium trouvés chez les microorganismes appartenant aux genres Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus, et Streptomyces.
On peut citer en particulier les séquences des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium trouvés chez les espèces ou souches listées dans le tableau 1 suivant : Tableau 1 : Microorganismes avant des séquences de polypeptides homologues à celle de l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium
On peut citer en outre le polypeptide codé par le gène pipA de Streptomyces p stinaespiralis (ATCC-25486) dont la séquence est décrite dans WO-A1 -9601901 et les séquences des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium susceptibles d'être trouvés chez les espèces ou souches productrices de rapamycine, d'ascomycine, et de FK-506, ainsi que les Streptomyces ou autres microorganismes producteurs de streptogramines, en particulier Streptomyces loïdensis (ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis (ATCC-15297), Streptomyces olivaceus (ATCC-12019), Streptomyces ostréogήseus (ATCC-27455), Streptomyces virginiae (ATCC-13161 ).
On peut citer également les polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium trouvés chez des organismes eucaryotes tels que Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus fuliginosus, Mus musculus, et Rattus norvegicus et listées dans le tableau 2 suivant :
Tableau 2 : Organismes supérieurs avant des séquences de polypeptides homologues à celle de l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ces polypeptides sont codés par des gènes homologues à celui de l'omithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium.
Par gène homologue de celui de l'omithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium, on entend tout gène ayant : a) une séquence nucléotidique similaire à la séquence codante du gène de l'omithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium ; ou b) une séquence nucléotidique hybridant avec la séquence codante du gène de l'omithine cyclodéaminase de la souche C58 d'Agrobacterium ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation ; ou c) une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium tel que défini ci- dessus ou ayant une activité d'ornithine cyclodéaminase. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue selon l'invention est similaire à au moins 75% de la séquence du gène ocd d'Agrobacterium ou du gène pipA, rapL, pipA* de séquence SEQ ID n° 1, rapL* de séquence SEQ ID n° 2 et rapL*L* de séquence SEQ ID n° 5 définis ci-après, de préférence encore au moins 85%, ou au moins 90%. De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence du gène ocd d'Agrobacterium ou du gène pipA, rapJL, pipA de séquence SEQ ID n° 1 , rapL* de séquence SEQ ID n° 2 et rapL*L* de séquence SEQ ID n° 5 définis ci-après, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (%formamide) - (600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989). Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple. Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucléotidique homologue inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de l'une des séquences identifiées, par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique. De telles séquences homologues peuvent être obtenues à partir de microorganismes appartenant aux genres Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, . Thermoplasma, Staphylococcus et Streptomyces.
On peut citer en particulier les séquences des gènes codant pour des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium trouvés chez les espèces ou souches listées dans le tableau 1 précédent.
On peut citer en outre la séquence du gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis (ATCC-25486) décrite dans WO-A1 -9601901 et les séquences des gènes codant pour des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium susceptibles d'être trouvés chez les espèces ou souches productrices de rapamycine, d'ascomycine, et de FK-506, ainsi que les Streptomyces ou autres microorganismes producteurs de streptogramines, en particulier Streptomyces ioïdensis (ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis (ATCC-15297), Streptomyces olivaceus (ATCC-12019), Streptomyces ostréogriseus (ATCC-27455), Streptomyces virginiae (ATCC-13161).
On peut citer également les séquences des gènes eucaryotes de Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus fuliginosus, Mus musculus, et Rattus norvegicus qui sont décrits comme codant pour des polypeptides homologues à l'omithine cyclodéaminase d'Agrobacterium et listés dans le tableau 2 précédent.
Parmi les gènes convenant bien au procédé de l'invention, on 5 peut citer notamment les gènes rapL de Streptomyces hygroscopicus et pipA de Streptomyces pristinaespirales dont la séquence est décrite respectivement par Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(17), (1995), 7839-43 et dans WO-A1 -9601901. Selon un mode de réalisation de l'invention, le composé de formule générale (II) ou le mélange énantiomère comprenant un L- 10 acide aminé de formule (II) et un D-acide aminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables est mis en présence d'une suspension du microorganisme producteur du polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase.
Des gènes homologues préférés tels que décrits ci-dessus sont 15 des gènes synthétiques obtenus par mutagénèse dirigée tel que décrit plus bas.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le composé de formule générale (II) ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide aminé
20 de formule (II) et un D-acide aminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables est mis en présence d'une enzyme isolée du microorganisme producteur.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule (II) ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de 25 formule (II) et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme à l'état purifié.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule (II) ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule (II) et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est
30. mis en présence d'une enzyme recombinante, ce dernier mode de réalisation étant préféré. On a pu constater de manière surprenante que les polypeptides tels que décrits ci-dessus permettaient dans les conditions de l'invention la synthèse stéréospécifique des composés de formule (I) de l'invention sans nécessiter l'addition exogène de NAD au milieu réactionnel.
Dans un mode de réalisation de l'invention, on ajoute à la préparation enzymatique ou à la suspension cellulaire éventuellement perméabilisée, un composé de formule (II) ou un mélange d'énantiomères du composé de formule (II) et de D-acide diaminé correspondant en une concentration supérieure à environ 0,05 M, de préférence supérieure à environ 01 M, cette même concentration étant inférieure à environ et 3 M, de préférence inférieure à 2,5 M, leurs sels ou dérivés et on laisse incuber à une température comprise entre 10°C et 100°C, avantageusement entre 20°C et 70°C, préférentiellement entre 25°C et 45°C, pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours, sous agitation.
On peut de la sorte obtenir des rendements molaires en composé de formule (I) d'au moins 20, avantageusement d'au moins 80, de préférence d'au moins 90% avec un excès énantiomère supérieur à 80, avantageusement supérieur 90, de préférence supérieur à 95%. Avantageusement, le composé de formule (I) est sous la forme d'un sel d'ammonium.
En variante, on peut également mettre à incuber les enzymes extraites du milieu de culture ou purifiées avec le composé de formule (II) ou un mélange d'énantiomères du composé de formule (II) ou de D-acide diaminé correspondant dans un milieu tamponné ou non à un pH compris entre 6 et 11 et de préférence entre 7 et 10.
Le produit obtenu peut être recueilli par précipitation, cristallisation ou chromatographie d'échanges d'ions.
Parmi les substrats préférés pour la préparation d'un composé de formule (I), on peut citer en particulier la L-lysine ou un mélange de L- et D-lysine, la L-thialysine (S-2-aminoéthyl-L-cystéine), la L-ornithine, un mélange de L- et D- 5-(R,S)-hydroxylysine, un mélange de L- et D- azalysine (acide γ-N- 2aminoéthyldiaminopropionique).
Afin de rendre le procédé plus particulièrement efficace, la surproduction du polypeptide à activité d'ornithine cyclodéaminase est particulièrement avantageuse.
Dans cette optique, on introduit le gène d'intérêt codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus dans un microorganisme hôte, de préférence surexprimant le polypeptide.
À cet effet, un vecteur contenant un acide nucléique comprenant l'une des séquences nucléotidiques telle que définie ci-dessus ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression, de préférence la surexpression du polypeptide correspondant.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (parmi lesquels on peut citer les promoteurs, les activateurs, et les séquences de terminaison) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. À cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard. Parmi les vecteurs préférés, on peut citer les plasmides pTZ18 (Sigma, St-Louis), pQE70 (Qiagen, Munich) et PQE60 (Qiagen, Munich).
Lorsqu'ils ont été utilisés, les plasmides QIAGEN ont présenté l'inconvénient majeur d'impliquer la formation de polyhistidines dans les enzymes obtenues. Aussi, ces plasmides doivent-ils être modifiés pour s'affranchir de cet inconvénient. Les séquences codantes doivent être ainsi modifiées ou disruptées. Ces modifications n'ont pas entraîné de différence en terme de niveau d'expression du gène codant pour la cyclodéaminase.
Les vecteurs d'expression sont introduits dans les cellules hôtes et celles-ci sont mises en culture dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment E. coli, de préférence les souches Escherichia coli DH5α, Escherichia coli β2033, et Escherichia co// K12 (MG1655).
Toutefois, d'autres organismes hôtes appartenant à des genres différents conviennent également.
Des résultats particulièrement intéressants sont obtenus lorsqu'on transfecte E. coli avec des gènes modifiés par rapport aux gènes correspondants natifs de façon à permettre une expression optimale du gène d'intérêt dans E. coli.
Le gène hétérologue est modifié de façon à comprendre une proportion inférieure à 65%, avantageusement inférieure à 55% de bases G + C, tout en codant pour le même polypeptide que le gène natif ou un polypeptide homologue tel que défini précédemment.
Ainsi, pour un acide aminé donné codé par un codon de l'ADN natif, on remplace le cas échéant la troisième base du codon, voire la seconde base du codon lorsque celle-ci est G ou C par A ou T, lorsque le codon obtenu correspond au même acide aminé que celui codé par le codon natif. Les gènes modifiés qui ont permis d'obtenir les meilleurs taux d'expression et également les rendements les plus élevés en acides α-imino- cycliques sont ceux dans lesquels les codons natifs ont été remplacés pour un acide aminé donné du polypeptide ayant l'activité acide aminé cyclodéaminase par les codons respectifs suivants représentés au tableau 3.
Tableau 3 : Code de conversion utilisé
Les gènes modifiés ont été obtenus par assemblage de tronçons obtenus par PCR et mutagénese dirigée à partir des gènes natifs correspondants.
Parmi les gènes modifiés ayant donné les meilleurs résultats, on peut citer les gènes modifiés pipA* et rapL** ayant respectivement les séquences SEQ ID n° 1 et SEQ ID n° 5 représentées en annexe de la présente demande.
Les polynucléotides correspondant à ces gènes modifiés constituent un autre objet de l'invention. Le gène pipA* a été obtenu à partir de la séquence du polypeptide codé par le gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis représentée en annexe en tant que séquence SEQ ID n° 3.
Le gène rapL** a été obtenu à partir de la séquence du polypeptide codé par le gène rapL de Streptomyces hygroscopicus représentée en annexe en tant que séquence SEQ ID n° 4.
Les gènes modifiés sont insérés dans des vecteurs de clonage comme décrit ci-dessus pour les gènes natifs transfectés dans des hôtes recombinants. Les microorganismes hôtes, le cas échéant, recombinants comportant un gène existant à l'état natif ou modifié comme décrit ci-dessus sont cultivés, éventuellement en présence d'un inducteur d'expression, par exemple l'IPTG.
Lorsque les cellules atteignent une densité de l'ordre de au moins une unité d'absorbance à 600 nm pour des cultures standards et de l'ordre de quelques dizaines ou plus de telles unités pour des cultures à haute densité, elles sont séparées de leur milieu de culture et soumises à un traitement de perméabilisation qui peut être physique (par exemple, traitements alternatifs de congélation et décongélation, traitements aux ultrasons ou à la presse de French, broyage mécanique) ou chimique (par exemple, ajout de solvant ou d'agents complexants tels l'EDTA), ou enzymatique (par exemple, ajout de lysozyme).
La suspension cellulaire peut alors être utilisée pour réaliser la préparation des produits de formule (II) comme décrit ci-dessus où la protéine d'intérêt produite peut ensuite être récupérée et purifiée. À titre d'exemple, en utilisant un procédé de type "Fed-batch" ou équivalent, on obtient des concentrations, exprimées en grammes de cellules sèches par litre de suspension cellulaire, supérieures à environ 10 g/L, avantageusement supérieure à 30 g/L. Ces mêmes concentrations sont, en règle générale, inférieures à 60 g/L, ou bien encore inférieures à 50 g/L, sans toutefois que ceci n'indique un limite infranchissable. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
Toutefois, il n'est pas nécessaire de récupérer cette protéine.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules hôtes produisant le polypeptide ayant l'activité enzymatique recherchée sont détruites afin que leur contenu cytoplasmique soit libéré dans le milieu contenant le substrat acide diaminé dont les deux fonctions aminés sont distantes (par la voie la plus courte lorsque plusieurs chemins sont possible) de quatre ou cinq chaînons, sous forme L ou sous forme d'un mélange d'énantiomères et de manière à permettre la mise en présence de l'enzyme et de son substrat.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1 : Amplification par PCR du gène pipA de Streptomyces pristinaespiralis à partir de l'ADN total de la souche.
1.1.Extraction de l'ADN total.
La souche Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486 a été cultivée à 28°C pendant 24 h dans le milieu TSB (DIFCO), puis 10 mL de la culture ainsi obtenue ont été centrifugés pendant 5 min à 11000 g. Le culot de centrifugation a été repris par 1 mL d'une solution de 10 mM Tris pH 8,0 contenant 2 mM d'EDTA et 5 mg/mL de lysozyme. La suspension ainsi obtenue a été laissée sous agitation pendant 30 min à 37°C, puis 100 μL d'une solution de SDS à 20% ont été ajoutés. Après incubation à 30°C pendant quelques minutes, 125 μL d'une solution de protéinase K à 2 mg/mL ont été encore ajoutés. Ensuite l'extraction de l'ADN a été poursuivie en utilisant les réactifs du kit DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Munich) et en respectant les indications du fournisseur. L'ADN ainsi extrait a été purifié par extraction phénol/chloroforme, précipité par de l'éthanol et repris dans 100 μl d'eau.
1.2.Amplification du gène pipA.
Le gène pipA a été amplifié par PCR à partir de l'ADN total ainsi préparé en utilisant, pour la synthèse des amorces, sa séquence décrite dans le brevet WO-A1 -96/01901. La réaction a été effectuée dans un volume de 50 μL de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100, 2 μL de la solution d'ADN total, 250 μM de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5' CCCGAATTCCGACACCACGCACGGACGAGAAG 5' CCCTGCAGGCATCTCTCTCCTCGCGAGGGC. Le protocole de PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 97°C pendant 4 min suivie d'une incubation à 80°C pendant 1 min, et s'est poursuivi par 5 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97°C, suivie de 1 min d'hybridation à 55°C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C. Ensuite 40 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97°C, suivie de 1 min d'hybridation à 50°C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C ont été effectués. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 72°C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par EcoRI et Pstl et clone dans le vecteur pTZ18 (SIGMA, St-Louis, MO) préalablement coupé. Deux constructions plasmidiques (pKT 35, pKT 36) obtenues suite à des amplifications PCR indépendantes ont été séquencées. Les séquences de ces deux fragments ainsi clones étaient identiques. La protéine spécifiée, de séquence SEQ ID n° 3, diffère cependant d'un acide aminé (alanine) à la position 87 par rapport à la séquence publiée dans WO-A1 -96/01901 (glycine). Exemple 2 :
Amplification par PCR du gène rapL de Streptomyces hygroscopicus à partir d'une suspension de cellules de la souche.
La souche Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 a été cultivée à 28°C pendant 24 h dans le milieu TSB (DIFCO). 50 μL de la suspension cellulaire ainsi obtenue ont été soumis à des étapes d'échauffement et de refroidissement suivants : 30 sec à 65°C, 30 sec à 8°C, 90 sec à 65°C, 180 sec à 97°C, 60 sec à 8°C, 180 sec à 65°C, 60 sec à 97°C, 60 sec à 65°C, 20 min à 80°C.
L'amplification du gène rapL a été réalisée par PCR à partir d'une suspension de cellules en utilisant pour la synthèse des amorces sa séquence décrite (Schwecke et al., 1995). La réaction a été effectuée dans un volume de 50 μL de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04j 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100, 10 μL de la suspension de cellules préalablement traitée, 250 μM de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5'CCCGAATTCGAGGTTGCATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAG 5'CCCAAGCTTAGATCTTTATTACAGCGAGTACGGATCGAGGACG
Le protocole PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 97°C pendant 4 min suivie d'une incubation à 80°C pendant 1 min, et s'est poursuivi tout d'abord par 5 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97°C, suivie de 1 min d'hybridation à 60°C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C, puis par 5 nouveaux cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97°C, suivie de 1 min d'hybridation à 52°C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C. Ensuite 30 cycles caractérisés par une séquence de 1 min de dénaturation à 97°C, suivie de 1 min d'hybridation à 50°C puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C ont été effectués. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 72°C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par EcoRI et Hindlll et clone dans le vecteur pTZ18 préalablement coupé. Trois constructions plasmidiques obtenues (pKT30, pKT31 , pKT34) suite à des amplifications PCR indépendantes ont été séquencées. Les séquences de ces trois fragments ainsi clones étaient identiques. La protéine spécifiée, de séquence SEQ ID n° 4, diffère cependant de cinq acides aminés par rapport à la séquence publiée par Schwecke et al., à savoir que la protéine de l'invention contient en positions 50, 84, 102, 127 et 129 respectivement un résidu de thréonine, glutamine, acide aspartique, alanine et alanine.
Exemple 3 : Synthèse totale par PCR du gène pipA*
Le gène pipA d'une taille de 1066 pb issu de Streptomyces pristinaespiralis et dont la séquence est décrite dans le brevet WO-A1 -96/01901 , est composé d'une proportion en G + C de 69,6%. Ce gène a été réécrit suivant le code génétique optimisé pour l'expression dans Escherichia coli décrit dans le tableau 3. Le gène réécrit pipA*, de séquence SEQ ID n° 1 est désormais composé d'une proportion en G + C de 38%. Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT prévu par le code du tableau 3. Deux codons de terminaison de la traduction TAA ont été également ajoutés en position 15 et 1080 (1er nucleotide du codon), respectivement de la séquence SEQ ID n° 1 , et des sites de restriction uniques EcoRI et Ncol d'une part, Hindlll d'autre part, ont été introduits respectivement en 5' et en 3' du gène permettant ainsi son insertion dans un vecteur de clonage.
La synthèse du gène pipA* a été effectuée en assemblant deux tronçons EcoRI — Kpnl (tronçon 1 de 305 pb - nucleotide 1 à nucleotide 304) et Kpnl - Hindlll (tronçon 2 de 798 pb - nucleotide 305 à nucleotide 1092). Chaque tronçon a été synthétisé par extension d'oligonucléotides simple brin d'une longueur de 50 à 60 nucléotides se chevauchant (brins "sens" et brins "anti-sens"), suivie d'une amplification par des oligonucléotides d'extrémité 5' et 3'.
Synthèse du tronçon 1 : La réaction PCR a été effectuée dans un volume de 100 μL de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100, 0,01 μM des oligonucléotides listés ci-après, 0,3 mM de chacun des quatre dNTP et 2 unités de Vent DNA Polymérase (BioLabs). Le protocole PCR appliqué était composé de 30 cycles caractérisés par une séquence de 30 sec de dénaturation à 96°C, suivie de 30 sec d'hybridation à 55°C, puis de 30 sec d'élongation à 72°C. Au cycle numéro 10, les oligonucléotides des extrémités 5' (PIPAUP) et 3' (PIPAD1 ) ont été ajoutés à une concentration finale de 0,5 μM. A la fin du cycle 30, une période d'élongation de 2 minutes à 72°C a été ajoutée.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour la réaction : PipaVO, PipaV2, PipaV4, PipaV6, PipaVδ, PipaD4, PipaD5, PipaDβ et PipaD7. Les séquences de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 4.
Le produit PCR ainsi obtenu a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré successivement par les enzymes de restrictions Kpnl et EcoRI, et à nouveau purifié sur gel d'agarose. Une bande de taille apparente de 300 pb a été extraite du gel en utilisant le Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN). Ce produit PCR purifié a été ensuite ligué au vecteur pTZ18, préalablement digéré par les enzymes EcoRI et Kpnl et purifié sur gel d'agarose, par la T4 DNA ligase (BioLabs). La réaction de ligation s'est effectuée pendant une nuit à 16°C dans le tampon de ligation fourni avec l'enzyme. Le produit de la ligation a été ensuite transformé dans la souche E, çoJi DH5α CIP104738 (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166, (1983), 557- 580) par choc thermique et des clones recombinants sélectionnés sur milieu LB (DIFCO) agar supplementé avec ampicilline (100 mg/L). Les plasmides contenus dans les transformants résistants à l'ampicilline ont été isolés en utilisant le système de préparation de plasmides QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Pour quatre de ces plasmides dont l'analyse par des enzymes de restriction appropriés montrait un insert de taille attendue, les fragments EcoRI-Kpnl ont été séquences. Chacune des séquences des quatre constructions contenait entre une et trois déviations par rapport à la séquence attendue. Le plasmide pSP23 pour lequel la séquence du fragment était correcte à l'exception d'une délétion de 6 pb a été soumis à une étape de mutagénese dirigée suivant une méthode publiée (Ansaldi et a/., Anal. Biochem., 234, (1996), 110-111 ) pour corriger cette délétion. Le plasmide pSP39 a été ainsi obtenu. Le séquençage du fragment EcoRI-Kpnl du plasmide pSP39 a été réalisé et la séquence obtenue a été trouvée conforme à celle attendue.
Synthèse du tronçon 2 : La réaction PCR pour la synthèse du tronçon Kpnl— Hindlll a été effectuée comme décrit pour le tronçon 1 à l'exception de la période d'élongation dont la durée a été allongée à 1 minute pour les 30 cycles et à 4 min à la fin du protocole. Au cycle numéro 10, les oligonucléotides des extrémités 5' (PIPAV29) et 3' (PIPAD3) ont été ajoutés à une concentration finale de 0,5 μM.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour la réaction : PipaVδ, PipaVIO, PipaV12, PipaV14, PipaV16, PipaV18, PipaV20, PipaV22, PipaV24, PipaV26, PipaV28, PipaD8, PipaD9, PipaDIO, PipaD11 , PipaD12, PipaD13, PipaD14, PipaD15, PipaD16 et PipaD17. Les séquences de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 4.
Le produit PCR a été purifié sur la colonne du Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN), puis digéré par les enzymes de restriction Kpnl et Hindlll et ligué au vecteur pTZ18 préalablement digéré par les mêmes enzymes. La transformation de la souche E. coli DH5α, et la sélection des transformants et l'analyse des plasmides ont été réalisés comme décrit ci-dessus pour le tronçon 1. Le plasmide pSP25 pour lequel la séquence du fragment Kpnl-Hindlll comportait cinq déviations par rapport à la séquence attendue a été soumis à plusieurs étapes de mutagénese dirigée (Ansaldi et al., 1996, ibid.) pour corriger ces erreurs. Le plasmide pSP42 a été ainsi obtenu.
Assemblage des 2 tronçons : Le gène entier pipA* a été assemblé par clonage du fragment Kpnl-Hindlll extrait du plasmide pSP42 dans le plasmide pSP39 préalablement coupé par les enzymes Kpnl et Hindlll. Un des plasmides résultant, le plasmide pSP43 contenant un fragment EcoRI— Hindlll de taille attendue a été séquence et la séquence du gène ainsi vérifiée.
Tableau 4 : Synthèse du gène pipA* séquence des oligonucléotides
Fragment EcoRI-Kpnl :
Pipa V0 5' TTCCAAGGAATTTGTTTACCCAATCTTCAGTCCGTTCGAATTCGAGGTTCC
PipaV2 5' TGATGTTGCAGAAGTTGTTGCAGCAGTTGGTCGTGATGAATTAATGCGTC
PipaV4 5' CAGAAATTGGTCGTGGTGAACGTCATTTATCTCCATTACGTGGTGGTTTA
PipaVβ 5' GAATGGATGCCACATCGTGAACCAGGTGATCATATTACTTTAAAAACTGT
PipaV8 5' TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG
Pipa D4 5 ' ATA GTT GGT AAA CCA AAA CGA CCT GGA TTT GCT GGA GAA TAA CCA
ACA GTT TTT AAA GTA
Pipa D5 5 ' ATG TGG CAT CCA TTC CCA AAT ACC TGG AAC TGG TTC AGA ACG TTC
TAA ACC ACC ACG TAA 3'
Pipa D6 5' CAC GAC CAA TTT CTG CTA AAC CAC CAG TTA AAC GAT CGA TAA TAC
GAC GCA TTA ATT CAT 3'
Pipa D7 5 ' ACT TCT GCA ACA TCA CGA CGA CCT AAA ACC CAA GTT TCC ATG GAA
CCT CGA ATT CG 3'
Oligos externes :
PIPAUP 5' CCCGAATTCGAGGTTCCATGGAAAC
PIPAD1 5' CAGTAGTATCATCATAACGTGC Fragment Kpnl-Hindlll :
PipaVδ TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG
PipaVI 0 TATTAACTGCATTACGTACTGGTGCAGCATCTGCTGTTGCATCTCGTTTA
PipaVI 2 TTAATTGGTACTGGTGCACAAGCAGTTACTCAATTACATGCATTATCTTT
Pi paV14 GGATACTGATCCAGCACATCGTGAATCTTTTGCACGTCGTGCAGCATTTA
PipaVI 6 CACGTATTGCAGCAGAAGCAGATGTTATTTCTACTGCAACTTCTGTTGCA
Pi paV18 GGTGTTCGTGAACATTTACATATTAATGCAGTTGGTGCAGATTTAGTTGG
PipaV20 ACGTGCATTTGTTACTGCAGATCATCCAGAACAAGCATTACGTGAAGGTG
PipaV22 GTCCACAATTAGCACATTTATGTGCAGATCCAGCAGCAGCAGCAGGTCGT
PipaV24 GGTTTTGCATTTGAAGATGCATTAGCAATGGAAGTTTTTTTAGAAGCAGC
PipaV26 TATTGAACATCATCCAGGTGATGCATTAGATCCATATGCATTACAACCAT
Pipa V28 5 ' ATA AAG ATC TAA GCT TCC CC
Pipa D8 5' GGGG AAG CTT AGA TCT TTA TTA ATG TGC TGG TGC TGC TAA TGG TAATGGTAATGGTTGTAATGCAT 3'
Pipa D9 5' GGA TGA TGT TCAATA CCA ACA CGAATA CCT AAATCA CGT TCT GCT GCT GCT TCTAAAAAA 3'
Pipa D10 5' TTC AAA TGCAAAACCAGTAGAATCAAAAACAGA TAAAGTATC TTG ACGACCTGCTGC TGC 3'
Pipa D11 5' GTG CTAATT GTG GAC CTAAAC GAT CAG CAG ATAATT GTT GAC ATT CAC CTT CAC GTAATG 3'
Pipa D12 5' GTA ACAAAT GCA CGT TCT AAT AAA CCT AAT GGT AAT TCA GTT TTA CCAACT AAATCT GCA 3'
Pipa D13 5' ATG TTC ACG AAC ACC AGT ATC TGG TAAAAC TGG ACC TTGACC AAC
TGCAACAGAAGTTGC 3'
Pipa D14 5' CTG CTG CAATAC GTG CTG GTT CTG CAA TTT CAA CAG AAA CAC CAG TAAATG CTG CAC GAC 3' Pipa D15 5' GCT GGA TCA GTATCC CAAACT AAT GCA CGT TGT AAT GGT AAAACT AAA GATAAT GCATGC 3'
Pipa D16 5' ACC AGT ACC AAT TAAACC TAAAGT ATG AGAATC TGGACG TGC TAA TAAACGAGATGCAAC 3'
Pipa D1 5' GTAATG CAG TTAATAAAA CAC CAT CCA TTAATG CAG TTAATG CAC CAG TAG TAT CAT CAT 3'
Oligos externes :
PIPAV29 5' CTATTT TAG GTACCGTTG CA PIPAD3 5' CCCAAGCTTAGATCTTTATTAATGTG
Exemple 4 : Synthèse totale par ligation du gène rapL*, et obtention du variant rapL**
Le gène rapL d'une taille de 1029 pb issu de Streptomyces hygroscopicus et dont la séquence a été publiée (Schwecke et al., 1995, ibid.), est composé d'une proportion en G + C de 68%. Ce gène a été réécrit en suivant le code génétique employé pour la synthèse du gène pipA* à l'exemple 3. Le gène réécrit rapL*, de séquence SEQ ID n° 2 est désormais composé d'une proportion en G + C de 38%. Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT prévu par le code représenté au tableau 3. Deux codons TAA de terminaison de la traduction ont été également ajoutés et des sites de restriction uniques EcoRI et SphI d'une part, Hindlll d'autre part ont été introduits respectivement en 5' et en 3' du gène permettant ainsi son insertion dans différents vecteurs de clonage.
La synthèse totale du gène rapL* a été effectuée en assemblant les trois tronçons EcoRI-Kpnl (tronçon 1 de 305 pb), Kpnl-Pstl (tronçon 2 de 316 pb), et Pstl— Hindlll (tronçon 3 de 440 pb). Chaque tronçon a été synthétisé par ligation d'oligonucléotides simple brin phosphorylés en 5' d'une longueur de 50 nucléotides en moyenne, recouvrant la totalité de la séquence à cloner (brins "sens" et brins "anti-sens") et se chevauchant. Les séquences et positions de ces oligonucléotides sont décrites au tableau 5. Les oligonucléotides, mélangés de façon equimolaire (1 μM) dans le tampon de chevauchement (20 mM Tris-HCI, pH 8 ; 0,08 M NaCI) dans un volume final de 20 μL, ont été chauffés 10 minutes à 70°C et maintenus dans le bloc chauffant jusqu'à retour à la température ambiante. Le produit ainsi obtenu a été ensuite ligué par la T4 DNA ligase pendant une nuit à 16°C en présence de vecteur pTZ18 (rapport de concentration molaire vecteur/oligonucléotides 1/100) préalablement digéré par les enzymes de restriction appropriés.
Le produit de ligation a été utilisé pour transformer par électroporation la souche β2033 (E. çoli K12, pjro, thj, rpsL, hsdS, ΔlaçZ, F'(ΔlacZM15. Iaclq, traD36. proA+, proB+)) et les clones recombinants ont été sélectionnés sur milieu LB agar contenant 100 μg/mL ampicilline, 0,5 mM IPTG et 30 μg/mL X-Gal.
Les plasmides contenus dans plusieurs transformants biancs résistants à l'ampicilline ont été isolés en utilisant le système de préparation de plasmides QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Pour chaque tronçon, les inserts de deux à quatre plasmides dont l'analyse par enzymes de restriction appropriés montrait un fragment de taille attendue, ont été séquences.
Synthèse du tronçon 1 : Le plasmide pTZ18 coupé par EcoRI et Kpnl a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) : lcdV-1 , lcdV-2, lcdV-3, lcdV-4, lcdV-5, lcdV-6, lcdVrev-16, lcdVrev-17, IcdVrev- 18, lcdVrev-19, lcdVrev-20, lcdVrev-21 , lcdVrev-22. Le plasmide pSP3 dont la séquence de l'insert comportait seulement deux déviations par rapport à la séquence attendue a été retenu. Les deux erreurs ont été corrigées par mutagénese dirigée suivant une méthode publiée (Ansaldi et al., 1996, ibid.) et les corrections confirmées par séquençage de l'insert du plasmide pSP14 résultant.
Synthèse du tronçon 2 : Le plasmide pTZ18 coupé par Kpnl et Pstl a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) : lcdV-7, lcdV-8, lcdV-9, lcdV-10, lcdV-11 , lcdV-12, lcdVrev-9, lcdVrev-10, lcdVrev-11 , lcdVrev-12, lcdVrev-13, lcdVrev-14, lcdVrev-15. Le plasmide pSP8 dont la séquence de l'insert comportait seulement une déviation par rapport à la séquence attendue a été retenu. L'erreur a été corrigée par mutagénese dirigée (Ansaldi et al., 1996, ibid.) et la correction confirmée par séquençage de l'insert du plasmide pSP15 résultant.
Synthèse du tronçon 3 : Le plasmide pTZ18 coupé par Pstl et Hindlll a été ligaturé avec les oligonucléotides suivants (dont la séquence est illustrée au tableau 5) : lcdV-13, lcdV-14, lcdV-15, lcdV-16, lcdV-17, lcdV-18, lcdV-19, lcdV-20, lcdV-21 , lcdVrev-1 , lcdVrev-2, lcdVrev-3, lcdVrev-4, lcdVrev-5, lcdVrev-6, lcdVrev-7, lcdVrev-8. Le plasmide pSP12 dont la séquence de l'insert comportait seulement une délétion de 25 pb et une déviation ponctuelle a été retenu. Les deux erreurs ont été corrigées par mutagénese dirigée (Ansaldi et al., 1996, ibid.) et les corrections confirmées par séquençage de l'insert du plasmide pSP26 résultant.
Assemblage des 3 tronçons : Les fragments corrigés Kpnl-Pstl, puis Pstl-Hindlll sont sous-clonés successivement dans le plasmide pSP14 contenant déjà le fragment EcoRI-Kpnl, reconstituant ainsi le gène synthétique rapL*. La séquence du gène rapL* du plasmide résultant pSP33 a été confirmée par séquençage. Obtention du variant rapL** (Séquence SEQ ID n° 5) : Le variant rapL** a été obtenu à partir du gène rapL* du plasmide pSP33 en introduisant par mutagénese dirigée (Ansaldi et al., 1996, ibid.) les cinq changements nécessaires pour que la protéine codée par le gène rapL** soit la même que celle codée par le gène amplifié et séquence décrit à l'exemple 2 et corresponde à la séquence SEQ ID n° 4, tout en respectant le code génétique décrit au tableau 3. Un plasmide pSP36 dérivé du plasmide pTZ18 et contenant le gène rapL** a été ainsi obtenu.
Tableau 5 : Synthèse du gène rapL* séguence des oligonucléotides
Fragment EcoRI-Kpnl :
Brin "sens" : lcdV-1 : 5'-AATTCGAGGTTGCATGCAAACTAAAGTTTTATGTCAACGTGATATTAA-3' lcdV-2: 5'p-ACGTATTTTATCTGTTGTT GGTCGTGATGTT ATG ATG GAT CGT TTA ATT T-3' lcdV-3: 5' p-CTGAAGTTCAT GCA GGT TTT GCA CGT TTA GGT CGT GGT GAAACT GATGAA-3' lcdV-4: 5'p-CCACCA CCA CGT CCA GGT TTT GCA CGT GGT GGT GAT GTT CCAGGT GTTAT -3' lcdV-5: 5'p-T GAA TTT ATG CCA CAT CGT GCA TCT GGT ATT GGT GTTACT ATGAAA ACTG -V lcdV-6: 5'p-TT TCT TAT TCT CCA GAA AAT TTT GAA CGT
TTTAATTTACCA ACT ATT GTT GGT AC-3'
Brin "anti-sens" : lcdVrev-16 : 5' p-CAACAATAG TTGGTAAATTAAAA-3' lcdVrev-17 : 5' p-CGTTCAAAATTTTCTGGAGAATAAGAAACAGTTTTCATAGTAACACCAAT- 3' lcdVrev-18 : 5' p-ACCAGATGCACGATGTGGCATAAATTCAATAACACCTGGAACATCACCA-
3' lcdVrev-19 : 5' p- CCACGTGCAAAACCTGGACGTGGTGGTGGTTCATCAGTTTCACCACGACCT-3' lcdVrev-20 : 5' p-
AAACGTGCAAAACCTGCATGAACTTCAGAAATTAAACGATCCATCATAAC-3' lcdVrev-21 : 5' p-ATCACGACCAACAACAGATAAAATACGTTTAATATCACGTTGA-3' lcdVrev-22 : 5' p-CATAAAACTTTAGTTTGCATGCAACCTCG-3 '
Fragment Kpnl-Pstl :
Brin "sens" : lcdV-7 : 5' p-CGTTTCT CGT TTA GGT GAT GATTCT GGTTCT
ATG GTT GCA TTA GC -3' lcdV-8 : 5' p-A GAT GCA GCAACTATT ACT GCAATGCGTACT GGT
GCA GTT GCA TCT GTT A -3' lcdV-9 : 5' p-CT ACT CGT TTATTAGCACGTCCAGGT TCT ACT ACT TTA GCA TTA ATT GGT -3' lcdV-10 : 5' p- GCA GGT GCACAA GCAGTTACT CAA GCA CAT
GCA TTA TCT CGT GTT TTA CC -3' lcdV-11 : 5' p-A TTA GAACGT ATTTTA ATTTCTGAT ATT AAA
GCA GAA CAT GCA GAA TCT T -3' lcdV-12 : 5' p-TTGCAGGTCGT GTT GCA TTTTTAGAA TTA CCA GTT
GAA GTT ACT GATGCAGCAACT GCA ATG GCA ACT GCA-3'
Brin "anti-sens" : lcdVrev-9 : 5' p-GTTGCCATTGCAGTTGCTGCATCAGTAACTTCAA-3' lcdVrev-10 : 5' p- CTGGTAATTCTAAAAATGCAACACGACCTGCAAAAGATTCTGCATGTTCTGCTTT-3' lcdVrev-11 : 5' p-AATATCAGAAATTAAAATACGTTCTAATGGTAAAACACGAGATAATGCA-
3' lcdVrev-12 : 5' p-
TGTGCTTGAGTAACTGCTTGTGCACCTGCACCAATTAATGCTAAAGTAGTA-3' lcdVrev-13 : 5' p- GAACCTGGACGTGCTAATAAACGAGTAGTAACAGATGCAACTGCACCAGT-3' fcdVrev-14 : 5' p-ACGCATTGCAGTAATAGTTGCTGCATCTGCTAATGCAACC-3' lcdVrev-15 : 5' p-ATAGAACCAGAATCATCACCTAAACGAGAAACGGTAC-3 ' Fragment Pstl-Hindlll
Brin "sens" '• lcdV-13 : 5' p-GATGTTTTA TGT ACT GTT ACTTCTGTTCC -3' lcdV-14 : 5' p-A GTT GGT GGT GGT CCAGTTGTTCCA GCA GAA
CCA CGTCAAGCACAT TTA C -3' lcdV-15 : 5' p-AT GTT AAT GGT ATT GGT GCA GATGAACAi
AAAACTGAA TTA CCA AAA -3' lcdV-16 : 5' p-GCA TTA TTA GAT GAT GCA TTT ATT TGT
GTTGATCAT CCA GGT CAA GCA CG -3' lcdV-17 : 5' p-T GCA GAA GGT GAA TTT CAACAA
TTACCAGATCGTGAA TTA GGT CCA TCT T -3' lcdV-18 : 5' p-TA GCA GAT TTA TGT GCAGCACCAGAA ATT GCA GCACCACAT CCA GAA CGT -3' lcdV-19 : 5' p- TTA TCT GTT TTTGATTCTACT GGT TCT GCA
TTT GCA GAT C ATATTGCA TTA GAT GTTTTATTA -3' lcdV-20 : 5' p-GGT TTT GCA GAT GAA TTA GGT TTA GGT CAT
AAAATGTCTATT GAAT -3' lcdV-21 : 5' p-CTACT CCA GAA GAT GTT TTA GAT CCA TAT
TCT . TTATAATAAAGATCTA-3'
Brin "anti-sens" : lcdVrev-1 : 5' p-
AGCTTAGATCTTTATTATAAAGAATATGGATCTAAAACATCTTCTGGAGTAGATT CAATA GACATTTTATGAC -3' lcdVrev-2 : 5' p-
CTAAACCTAATTCATCTGCAAAACCTAATAAAACATCTAATGCAATATGA-3' lcdVrev-3 : 5' p-
TCTGCAAATGCAGAACCAGTAGAATCAAAAACAGATAAACGTTCTGGATG-3' lcdVrev-4 : 5' p-TGGTGCTGCAATTTCTGGTGCTGCACATAAATCTGCTAAAGATGGACCT- 3' lcdVrev-5 : 5' p-
AATTCACGATCTGGTAATTGTTGAAATTCACCTTCTGCACGTGCTTGACCT-3' lcdVrev-6 : 5' p-GGATGATCAACACAAATAAATGCATCATCTAATAATGCTTTTGGTAATT- 3' lcdVrev-7 : 5' p- CAGTTTTACCTTGTTCATCTGCACCAATACCATTAACATGTAAATGTGCTT-3' lcdVrev-8 : 5' p-
GACGTGGTTCTGCTGGAACAACTGGACCACCACCAACTGGAACAGAAGTAACAGT ACATAAAACATCTGCA-3'
Exemple 5 : Surexpression du gène pipA* chez Escherichia coli.
Le gène pipA* a été clone dans le vecteur pQE60 (QIAGEN) (plasmide dont les séquences codantes ont été préalablement modifiées comme indiqué précédemment), entre les sites de restriction Ncol et Hindlll à partir du plasmide pSP43 construit à l'exemple 3. Le plasmide pSP47 résultant a été introduit dans une souche d'E. coli K12 MG1655 (Vidal et al., 1998) exprimant le gène lacl à partir du plasmide auxiliaire pREP4 (QIAGEN). La souche +75 ainsi obtenue a été cultivée dans le milieu LB et l'expression du gène pipA* a été induite par l'ajout d'IPTG suivant le protocole du fournisseur. Les protéines totales des cellules ont été séparées par électrophorèse en gel polyacrylamide/SDS et colorées par le bleu de Coomassie. Une protéine au poids moléculaire de 36 kD a été détectée et son taux d'expression a été estimé à environ 5% de protéines totales.
Exemple 6 : Surexpression des gènes pipA, rapL, rapL*, et rapL** chez Escherichia coli.
En procédant comme décrit à l'exemple 5 une souche d'E. coli surexprimant le gène pipA (souche +353) a été obtenue en introduisant le plasmide pKT37. Ce plasmide a été obtenu à partir du plasmide pKT36, décrit à l'exemple 1 , par clonage du gène d'intérêt entre les sites de restriction Ncol et Hindlll du vecteur pQE60.
De même, des souches d'E. coli surexprimant les gènes rapL (souche +38), rapL* (souche +60), ou rapL** (souche +73) ont été obtenues en introduisant respectivement les plasmides pSP32, pSP37, ou pSP45. Ces plasmides pSP32, pSP37, ou pSP45 ont été obtenus respectivement à partir des plasmides pKT30, pSP33, ou pSP36, décrits dans les exemples 2 et 4, par clonage du gène d'intérêt entre les sites de restriction SphI et Hindlll du vecteur pQE70.
Le taux d'expression des ces différentes protéines à été déterminé comme décrit à l'exemple 5. Pour chaque souche, une protéine au poids moléculaire attendu a été détectée avec un taux d'expression d'environ 5% de protéines totales.
Exemple 7 : Amplification par PCR et surexpression du gène ocd Agrobacterium tumefaciens chez Escherichia coli. Une préparation du plasmide Ti-C58 d'Agrobacterium tumefaciens
CIP 104333 a été réalisée comme décrit par ailleurs (Hayman et al., Mol. Gen. Genêt, 223, (1990), 465-473). Le gène oçd (Sans et al., (1988), ibid.) a été amplifié par PCR à partir de cette préparation du plasmide Ti-C58.
La réaction a été effectuée dans un volume de 50 μL de tampon 20 mM Tris-HCI pH 8.8 contenant 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100, 2 ng du plasmide Ti-C58, 200 μM de chacun des quatre dNTP, 1 unité de la Vent DNA Polymérase (BioLabs) et 500 nM de chacun des deux oligodésoxynucléotides suivants : 5'CCCGCATGCCTGCACTTGCCAACC 5'CCCAGATCTTAACCACCCAAACGTCGGAAA
Le protocole PCR appliqué a débuté par une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 min suivie par 30 cycles caractérisés par une séquence de 30 sec de dénaturation à 94°C, suivie de 30 sec d'hybridation à 52°C, puis de 1 min 30 sec d'élongation à 72°C. Le protocole s'est achevé par une étape d'élongation à 72°C pendant 10 min.
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par Ncol et Bg]ll et clone dans le vecteur pQE70 (QIAGEN) (plasmide dont les séquences codantes ont été préalablement modifiées comme indiqué précédemment) préalablement coupé. Le fragment Ncol-Bqlll du plasmide pKR7 ainsi obtenu a été séquence. La protéine spécifiée diffère de deux acides aminés par rapport à la séquence publiée (Sans et al., (1988), ibid.), à savoir le résidu 212Gln remplacé par la lysine et le résidu 29711e remplacé par la leucine. Les deux déviations ont été confirmées par séquençage d'un produit d'amplification par PCR obtenu indépendamment.
En procédant comme décrit à l'exemple 5 une souche d'E. coli surexprimant le gène oçd. (souche +78) a été obtenue en introduisant le plasmide pKR7. Le taux d'expression de la protéine codée par le gène oçd a été déterminé comme décrit à l'exemple 5. Une protéine de poids moléculaire conforme à celui qui était attendu a été détectée avec un taux d'expression d'environ 5% des protéines totales.
Exemple 8 :
Production d'acide L-pipécolique à partir de la L-lysine par des suspensions cellulaires des souches d'E. coli recombinantes.
La souche +75, construite à l'exemple 5, est cultivée dans le milieu minéral MS (Richaud et al., J. Biol. Chem., 268, (1993), 26827-35) contenant 2 g/L glucose, 50 mg/L ampicilline et 30 mg/L kanamycine. Au bout de 14 heures de culture, 400 mL de milieu minéral MS contenant 2 g/L glucose sont ensemencées au 1/10 avec la préculture de la souche +75. Cette culture est placée à 37°C sous agitation jusqu'à atteindre une D06oonm de 0,7. Le gène pipA* est alors induit pendant 4 heures à 37°C par l'ajout de 1 mM d'IPTG à 200 mL de culture. Une culture témoin de 200 mL sans ajout d'IPTG est également réalisée. À la fin de cette étape, les deux cultures sont centrifugées à 13000 g et les culots cellulaires sont repris dans du milieu minéral MS de façon à concentrer les cellules 100 fois. Les cellules sont alors perméabilisées par deux étapes de congélation/décongélation à -20°C favorisant l'accès du substrat à l'enzyme. La L-lysine monohydrochloride (pH = 7) est alors ajoutée à une concentration finale de 1 M dans les suspensions cellulaires (volume final = 2 mL). La réaction enzymatique se fait à 37°C sous agitation. Au bout de 20 heures on prélève un échantillon de 300 μL de chaque culture que l'on centrifuge à 13000 g de façon à récupérer le surnageant. Une solution diluée des surnageants est ensuite déposée sur couche mince de silice et en parallèle dosée par CLHP.
Un composé à la migration chromatographique (Rf = 0.22 ; éluant : butanol/acide acétique/eau 4/1/1 en CCM) et à la coloration par la ninhydrine indiscernables de celles de l'acide L-pipécolique est détecté dans le cas de la culture induite à l'IPTG et absent dans le cas de la culture témoin non induite.
Le dosage par CLHP (conditions décrites ci-dessous) indique une concentration de 40 g/L de L-pipécolate au bout de 20 heures. L'excès énantiomérique est supérieur à 95%.
Des essais de production d'acide L-pipécolique à partir de la
L-lysine ont été réalisés avec les souches +38, +60, +73, +78 et +353 construites aux exemples 6 et 7, dans les mêmes conditions que celles appliquées ci-dessus pour la souche +75. L'analyse par chromatographie des surnageants respectifs sur couche mince de silice après coloration par la ninhydrine n'a révélé une production d'acide L-pipécolique qu'avec les souches
+73, +78 et +353.
Description de la méthode CLHP utilisée
- Colonne Phenomenex Synergi Polar-RP-80 4μ (250 x 4,6 mm) thermostatée à 30°C
- Détection UV à 210 nm
- Volume d'échantillon injecté : 10 μL - Élution isocratique par une solution de 0,05% de TFA dans l'eau pendant 5 minutes suivi d'un lavage de la colonne par 80% d'acetonitrile et 0,05% de TFA dans l'eau.
- Temps de rétention : lysine à 2,98 min et acide pipécolique à 4,62 min. Exemple 9 :
Production d'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique à partir de la
L-thialysine
La production d'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique a été réalisée à partir d'une suspension cellulaire de la souche +75 préparée comme décrit à l'exemple 8. La L-thialysine (S-(2-aminoethyl)-L-cysteïne) (SIGMA) est ajoutée à une concentration finale de 1 M. Une chromatographie sur couche mince de silice du surnageant de la suspension incubée est réalisée et elle révèle un composé à la migration (Rf = 0,28 ; éluant butanol/acide acétique/ eau 4/1/1 ) et à la coloration par la ninhydrine distinctes de celles de la L-thialysine et de l'acide L-pipécolique.
Dans les mêmes conditions, la souche +78 décrite à l'exemple 7 produit un composé identique à celui produit par la souche +75.
Exemple 10:
Production d'un mélange d'acides 5-R- et 5-S- hydroxy-L-pipécolique à partir d'un mélange de L- et D- 5-(R,S) hydroxylysine
La production d'un mélange d'acides 5-R- et 5-S- hydroxy-
L-pipécolique a été réalisée à partir d'une suspension cellulaire de la souche +75 préparée comme décrit à l'exemple 8. La 5-R,S-hydroxy-D, L-lysine (SIGMA) est ajoutée à 1 M final. Une chromatographie sur couche mince de silice du surnageant de la suspension incubée est réalisée et elle révèle deux composés présents en proportions équivalentes, à la migration (Rfι = 0,14 ; Rf2 = 0,20 ; éluant butanol/acide acétique/eau 4/1/1 ) et à la coloration par la ninhydrine distinctes de celles de la 5-R,S-hydroxy-D, L-lysine et de l'acide L-pipécolique.
Dans les mêmes conditions, la souche +78 décrite à l'exemple 7 produit deux composés identiques à ceux produits par la souche +75. Exemple 11 : Préparations d'autres acides aminés cycliques
La grande polyvalence du procédé selon la présente invention peut être illustrée grâce aux acides aminés cycliques suivant, obtenus en opérant selon le mode opératoire décrit à l'exemple 8, en modifiant la nature de l'acide diaminé de départ :

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'un L-acide aminé cyclique de formule (I) ou d'un de ses sels ou dérivés :
dans laquelle :
* Ri est choisi parmi l'atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié comportant de 1 à 6 atomes de carbone et un radical acyle linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
* X représente une chaîne hydrocarbonée saturée, ou partiellement ou totalement insaturée, linéaire ou ramifiée en C-i-Cg, de préférence en C-2-C4, comprenant éventuellement dans la chaîne et/ou en bout de chaîne un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi O, S, P, NR2, R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en Cι-C4, la dite chaîne étant également éventuellement substituée par un ou plusieurs radicaux, identiques ou différents choisis parmi -R, -OR, -SR, =0, -C(0)OR, -C(S)OR,
-C(0)NR'R", -C(S)NR'R", -CN, -N02, -X, -MgX, -NR'R", -NR'C(0)R, -SiR et
-SiOR, R, R' et R", identiques ou différents, représentant l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifiée, saturé, ou totalement ou partiellement instauré, et comportant de 2 à 20 atomes de carbone, étant entendu que R'et R" peuvent former un cycle avec l'atome qui les porte, caractérisé en ce que : a) l'on fait réagir un L-acide diaminé de formule (II) :
dans laquelle X et R-i sont tels que définis ci-dessus ; ou un sel ou dérivé de celui-ci, ou un mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule (II) et un D-acide diaminé correspondant, leurs sels ou dérivés en proportions variables, de préférence en milieu aqueux, en présence d'une ornithine cyclodéaminase, ou d'un polypeptide homologue à l'omithine cyclodéaminase, l'enzyme ou le polypeptide homologue étant obtenus à partir d'un vecteur d'expression recombinant exprimant la dite enzyme ou le dit polypeptide homologue, b) l'on récupère le L-acide aminé cyclique de formule (I) ou un sel ou dérivé de celui-ci en un excès énantiomérique d'au moins 80 %
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé de formule (I) comprend un cycle à six maillons, X représentant une chaîne hydrocarbonée à quatre maillons.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la chaîne hydrocarbonée X est une chaîne alkylene linéaire ou ramifiée.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé de formule (II) ou le mélange énantiomère comprenant un L-acide diaminé de formule (II) et un D-acide diaminé correspondant en proportions variables est mis en présence d'une enzyme à l'état purifié.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé de formule générale (I) est sous la forme d'un sel d'ammonium en solution aqueuse.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on prépare l'acide L-pipéridine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de L-lysine.
s 7. Procédé selon l'une des revendications 1 , 2, 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on prépare l'acide L-pipérazine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de L-azalysine.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 , 2, 4 ou 5, caractérisé 0 en ce que l'on prépare l'acide L-thiomorpholine-2-carboxylique ou un de ses sels à partir de L-thialysine.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est une ornithine cyclodéaminase 5 d'Agrobacterium ou un peptide ayant une activité homologue à celle de ladite ornithine cyclodéaminase.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'omithine cyclodéaminase est celle de la souche 0 d'Agrobacterium C 58.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'enzyme est une enzyme recombinante exprimée par le gène ocd de la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58 ou pipA de Streptomyces 5 pristinaespiralis ou rapL de Streptomyces hygroscopicus ou un gène homologue dans un microorganisme hôte.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que l'enzyme recombinante est exprimée dans E. coli. 0
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'enzyme recombinante est obtenue par expression d'un gène modifié d'une ornithine cyclodéaminase native, dans lequel certaines bases G ou C sont remplacées par des bases A ou T, de manière à obtenir des codons modifiés codant pour le même acide aminé que le codon natif.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les gènes modifiés comportent moins de 65, avantageusement moins de 55 % de bases G + C.
15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le gène modifié est le gène pipA* de séquence SEQ ID n° 1 ou le gène
** rapL* de séquence SEQ ID ° 2, ou le gène rapL de séquence SEQ ID n° 5.
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il n'est pas ajouté de NAD exogène au milieu réactionnel.
17. Polynucléotide comprenant la séquence SEQ ID n° 1 ;
18. Polynucléotide comportant la séquence SEQ ID n° 2.
19. Polynucléotide comportant la séquence SEQ ID n° 5.
20. Composé de formule (I) ou sel ou dérivé du composé de formule (I) :
dans laquelle * Ri est choisi parmi l'atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone et un radical acyle linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;et
* X représente une chaîne hydrocarbonée saturée, ou partiellement ou totalement insaturée, linéaire ou ramifiée en C Cg, de préférence en C2-C4, comprenant éventuellement dans la chaîne et/ou en bout de chaîne un ou plusieurs hétéroatomes ou hétérogroupes choisis parmi O, S, P, NR2) R2 représentant H ou un groupe alkyle ou acyle en Cι-C , la dite chaîne étant également éventuellement substituée par un ou plusieurs radicaux, identiques ou différents choisis parmi
-R, -OR, -SR, =0, -C(0)OR, -C(S)OR, -C(0)NR'R", -C(S)NR'R", -CN, -N02, -X, -MgX, -NR'R", -NR'C(0)R, -SiR et -SiOR, R, R' et R", identiques ou différents, représentant l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifiée, saturé, ou totalement ou partiellement instauré, et comportant de 2 à 20 atomes de carbone, étant entendu que R'et R" peuvent former un cycle avec l'atome qui les porte, substantiellement obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 16.
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