CA2331150A1 - Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede - Google Patents

Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne un procédé industriel de préparation de protéines hétérologues dans E.coli, dans lequel on ensemence et on cultive dans un milieu de culture approprié des bactéries E.coli modifiées avec un système d'expression de protéines hétérologues approprié, caractérisé en ce que la souche de E.coli est une souche E.coli W.

Description

PROCEDE INDUSTRIEL DE PRODUCTION DE PROTEINES HETEROLOGUES
CHEZ E. COL/ ET SOUCHES UTILES POUR LE PROCEDE
La présente invention concerne un nouveau procédé industriel de production de protéines hétérologues chez E. coli. Si pour certaines protéines hétérologues à très haute valeur ajoutée le prix de revient de leur procédé de préparation reste un facteur négligeable par rapport à la finalité de la protéine hétérologue (dans le domaine pharmaceutique notamment), le développement de la production industrielle de 1o protéines hétérologues de moindre valeur ajoutée dans E. coli passe par la prise en compte de facteurs de production tels que la nécessité d'avoir une biomasse élevée et une très forte teneur en protéines hétérologues produites pour un coüt le plus bas possible, lequel coût doit tenir compte de la nature du milieux, du rendement énergétique et en réactifs, et des conditions opératoires. Pour des productions industrielles avec des volumes réactionnels pouvant atteindre plusieurs dizaines de m3, on cherchera les milieux et les conditions opératoires les plus simples possibles. La présente invention consiste en la sélection d'une souche de E. coli appropriée pour répondre aux conditions ci-dessus, essentielles à la production industrielle économiquement satisfaisante de protéines hétérologues, indépendamment de la valeur 2o de la protéine produite.
Les souches d'E. coli les plus couramment utilisées pour les travaux de biologie moléculaire dérivent de la souche K12 (Swartz, 1996, In Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2"d edition, ASM Press Washington, pp1693-1711). Des dérivés d'E. coli B, tels que BL21, sont également utilisés pour la production de protéines à cause de leur propriétés physiologiques. Un tableau des souches les plus couramment utilisées pour la production de protéines recombinantes est donné par Wingfield, 199'7 (Carrent Protocols in Protein Science, Coligan et al. Ed, John Wiley & Sons, Inc, 5Ø1-5Ø3).
De nombreux systèmes d'expression de protéines chez des hôtes bactériens ont 3o été décrits (Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60:512-538; Carrent Opinions in Biotechnology, 1996, 7). Un système d'expression est constitué d'un promoteur, de son régulateur, d'un site de fixation du ribosome suivi d'un site de restriction permettant l'insertion du gène d'interêt, d'une structure pouvant servir de terminateur de FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
2 PCT/FR99/01343 transcritption, éventuellement de gènes dont la coexpression augmentent la qualité de la protéine d'interêt surexprimée et d'un ou plusieurs vecteurs permettant d'introduire dans l'hôte ces combinaisons.
Le promoteur doit présenter au moins trois caractéristiques pour être utilisé
dans s un procédé de production de protéines (Makrides, 1996, précité) - il doit être fort et conduire à l'accumulation de la protéine d'intérêt qui peut représenter 10 à 50 % des protéines totales de la cellule hôte;
- il doit pouvoir être régulé de façon pouvoir autant que possible découpler la phase de production de biomasse de la phase de production de la protéine;
to - il doit être inductible (passage d'un niveau de faible activité
transcriptionnelle à un niveau maximal d'activité transcriptionnelle) avec des conditions de procédé
simples et bon marché.
De nombreux promoteurs ont été décrits pour l'expression chez E. coli (Makrides, 1996, précité; Weickert et al., 1996, Current Opinions in Biotechnology 7 : 494-499). Parmi 15 les promoteurs homologues utilisés pour la production de protéines chez E.
coli, on peut citer les promoteurs lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-1, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA. Parmi les promoteurs hétérologues utilisés pour la production de protéines chez E. coli, on peut citer ies promoteurs PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, ~,PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gene 32, nprM lac, VHb, Proteine A. Un certain nombre 2o d'inconvénients sont liés à ces promoteurs. On peut citer pour certains d'entre-eux l'utilisation de l'IPTG comme molécule inductrice, dont le prix peut représenter plus de 14 % du coût du milieu. D'autres utilisent une régulation par la température, difficile à
mettre en oeuvre à l'echelle d'un fermenteur industriel de 100 m3.
Les vecteurs les plus couramment utilisés pour l'expression de protéines chez E.
25 coli dérivent du plasmide pBR322 (Swartz, 1996, précité; Makrides, 1996, précité). Ils sont présents dans les cellules à un certain nombre de copies, déterminé par l'interaction de deux ARN codés par le plasmide, RNAI et RNAII (Polisky, 1988, Cell 55 : 929-932). L'interaction de l'ARNI avec l'ARNII inhibe la maturation de l'ARNII
en une forme nécessaire à l'initiation de la réplication du plasmide. Cette interaction est 3o modulée par la protéine ROP, dont le gène est présent sur pBR322 mais pas sur certains dérivés tels que les plasmides de type pUC (Lin-Chao et Cohen, 1991, Cell 65 :

1242). En matière de régulation du nombre de copies du plasmide d'expression chez E.
coli, plusieures stratégies sont citées (Swartz, 1996, précité; Makrides, 1996, précité).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
3 PCT/FR99/01343 On retiendra notamment qu'un fort nombre de copies de plasmide d'expression conduit à un niveau élevé d'ARN messagers de la protéine désirée, mais peut être pénalisant pour le métabolisme de la souche hôte (Bailey, 1993, Adv. Biochem. Eng.
Biotechnol.
48 : 29-52).
La stabilité des plasmides d'expression est un critère important d'autant plus que les fermentations industrielles tendent à ne pas utiliser d'antibiotiques dans les fermenteurs. Plusieurs stratégies ont été développées pour stabiliser les piasmides~
d'expression dont le clonage du locus cer du plasmide naturel ColEl. Ce locus a été
caractérisé (Leung et al., 1985, DNA 4 : 351-355) et son insertion sur des plasmides mufti-copies a été décrite comme ayant un effet bénéfique sur la stabilité de ces plasmides (Summers et Sherratt, 1984, Cell 36 : 1097-1103).
Si les souches et les systèmes d'expression ci-dessus permettent d'obtenir de bons rendements de production de protéines hétérologues, leur emploi reste limité à la production de protéines hétérologues à très haute valeur ajoutée pour lesquelles le prix de revient du système de production (souche bactérienne, milieu et conditions de culture, matières premières) est minime comparé à la valeur de la protéine produite.
Comme exemples de telles protéines à très haute valeur ajoutée, on trouve plus particulièrement les protéines hétérologues destinées à un usage pharmaceutique comme par exemple l'hormone humaine de croissance, l'interféron humain consensus alpha, les 2o interleukines humaines 1~3, al, 2, l'interféron leucocytaire humain, l'hormone parathyroïdique humaine, l'insuline humaine, l'albumine sérique humaine, la Proapolipoprotéine humaine A-1 (Lee, 1996, Trends in Biotechnol. 14:98-105 ;
Latta et al., 1987, Bio/Technology 5 :1309-1313).
Toutefois, pour la production d'intermédiaire chimique de masse (Lee, 1997, Nature Biotech. 15:17-18) ou pour la production d'enzymes à usage industriel, notamment des catalyseurs nécessaires à la production de composés chimiques, le prix de revient du système de production devient un facteur dominant à prendre en considération pour évaluer l' intérêt technique du dit système.
Pour la production de protéines hétérologues dans des bactéries, la productivité
du système de culture employé peut être significativement augmentée en utilisant des stratégies de culture à haute densité cellulaire (S. Makrides, 1996, précité;
Wingfield, 1997, précité). Parmi celles-ci se trouve la stratégie de fed-batch (Jung et al., 1988, Ann.
Inst. Pasteur /Micrbiol. 139 : 129-146 ; Kleman et al., 1996, Appl. Environ.
Microbiol.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
4 PCT/FR99/01343 62 : 3502-3507 ; Lee, 1996, précité ; Bauer et White, 1976, Biotechnol.
Bioeng. 18 839-846 ). Cette stratégie, combinée à l'utilisation d'un promoteur Ptyp, a permi d'atteindre des productivités importantes : 5~ g de poids sec par litre et 2,2 g de protéine hétérologue par litre (Jung et al., 1988, précité). Il est fait état de productions en routine s de 35 à SO g de poids sec par litre (Wingfield, 1997, précité).
Cependant, les souches et systèmes ci-dessus ne permettent pas d'obtenir des densités de culture suffisantes pour la production industrielle de protéines hétérologues dont la valeur (prix de revient) doit être négligeable au regard de leur finalité
(notamment pour la préparation de catalyseurs biologiques).
1o La présente invention réside dans la sélection d'une souche de E. coli particulière, appropriée pour la production industrielle de protéines hétérologues. La souche utile pour le procédé selon l'invention est une souche E coli W, plus particulièrement la souche W référencée à l'ATCC sous le numéro 9637.
Cette souche W (ATCC 9637), est bien connue et décrite dans de nombreuses 1 s publications (Davies & Mingioli, 1950, J. Bact., 60: 17-28 ; Doy et Brown, 1965, Biochim. Biophys. Acta, 104: 377-389 ; Brown et Doy, 1966, Biochim. Biophys.
Acta, 118: 1 ~7-172 ; Wilson & Holden, 1969, J. Biol. Chem., 244: 2737-2742 ; Wilson &
Holden, 1969, J. Biol. Chem., 244: 2743-2749 ; White, 1976, J. Gen.
Microbiol., 96:
51-62 ; Shaw & Duncombe, 1963, Ananlyst 88: 694-701 ; Br. Pharmacopoeia, 1993, 2:
2o A164-A169 ; Huang et al., US 3,088,880; Hamsher et al., US 3,905,868;
Takahashi et al., US 3,945,888; Huang et al., US 3,239,427; Burkholder, 1951, Science, 114:

460 ; Prieto et al., 1996, J. Bact., 178: 11-120 ; Lee 1996, précité; Lee &
Chang, 1995.
Can. J. Microbiol. 41: 207-215; Lee et al., 1994, Biotechnol. Bioeng., 44:
1337-1347 ;
Lee & Chang, 1993, Biotechnology Letters, 15: 971-974; Bauer et White, 1976, précité;
25 Bauer et Shiloach, 1974, Biotechnol. Bioeng 16: 933-941 ; Gleiser et Bauer, 1981, Biotechnol. Bioeng., 23: 1015-1021 ; Lee et Chang, 1995, Advances in Biochem.
Engine./Biotech. 52 : 27-58). La souche W (ATCC9637) a ainsi été utilisée pour la production d'acide 3-polyhydroxybutyrique (PHA) après introduction d'un plasmide portant l'opéron d'Alcaligenes eutrophus codant pour des enzymes impliquées dans la 3o biosynthèse du PHA (Lee et, Chang, 1993, précité; Lee et Chang, 1995, précité ; Lee et al., 1994).
La souche W a aussi été utilisée en cultures à haute densité cellulaire (Bauer et White, 1976, précité; Bauer et Shiloach, 1974, précité ; Gleiser et Bauer, 1981, précité ;
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
5 PCT/FR99/01343 Lee et Chang, 1993, précité ; Lee et al., 1997, Biotechnology Techniques 11 :
59-62 ).
Des biomasses de 125 g de poids sec par litre ont ainsi pu être obtenues (Lee et Chang, 1993, précité) en utilisant du saccharose comme source carbonée.
Toutefois, cette souche n'a jamais été décrite pour la production de protéines s recombinantes. En outre, en combinant un plasmide portant l'opéron d Alcaligenes eutrophus codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse du PHA et une stratégie de culture à haute densité cellulaire de la souche W recombinante correspondante, Lee et Chang (1993, précité) ont obtenu de moins bonnes productivité
de PHA qu'avec une souche XL1-Blue dérivée de la souche K12 (Lee et Chang, 1995, I o précité ; Lee, 1996, précité).
La présente invention concerne donc un procédé industriel de préparation de protéines hétérologues dans E coli, dans lequel on ensemence et on cultive dans un milieu de culture approprié des bactéries E coli modifiées avec un système d'expression de protéines hétérologues approprié, caractérisé en ce que la souche de E.
coli est une 15 souche E. coli W. Plus préférentiellement la souche W est la souche W
déposée à
1 'ATCC sous le numéro 9637.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la souche W est un dérivé de la souche déposée à 1 'ATCC sous le numéro 9637 obtenu par sélection clonale ou manipulation génétique.
2o Par procédé industriel, on entend selon l'invention tout procédé dont le volume de culture des bactéries est supérieur au volume de culture usuel employé dans les laboratoires de recherche. De manière générale, on entend par procédé
industriel tout procédé pour lequel le volume de culture est supérieur à 2 litres, de préférence supérieur ou égal à 10 litres, plus préférentiellement supérieur ou égal à 20 litres, encore plus 25 préférentiellement supérieur ou égal à 50 litres. Le procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour des volumes de culture de plusieurs dizaine de m', jusqu'à plus de 100 m3.
Le milieu de culture approprié est un milieu de culture approprié pour l'obtention d'une forte densité de biomasse et une forte teneur en protéines hétérologues 30 produites. Plusieurs types de milieux (définis, complexes et semi-définis) peuvent être utilisés pour la culture à haute densité cellulaire (Lee, 1996, précité). Si les milieux connus de l'état de la technique et en particulier les milieux semi-définis permettent de cumuler une bonne reproductibilité de la composition du milieu et une bonne FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
6 PCT/FR99/01343 productivité de la culture (Lee, 1996, précité) le développement d'un tel milieu requiert toutefois une optimisation empirique pour la prise en compte des contraintes économiques énoncées auparavant (Lee, 1996, précité).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le milieu de culture comprend du saccharose comme principale source de carbone. Par principale source de carbone, on entend selon l'invention que le saccharose représente au moins 50 % en poids du poids total des sources de carbone du milieu de culture, plus préférentiellement au moins 75 % en poids, encore plus préférentiellement au moins 85 % en poids.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention, le milieu de culture ne comprend to substantiellement que du saccharose comme source de carbone. I1 est entendu que pour le procédé selon l'invention, le milieu de culture peut comprendre des additifs appropriés de manière à augmenter le rendement global de l'invention. Ces additifs peuvent avoir comme fonction annexe de se comporter comme source de carbone à
la culture des bactéries. Toutefois, ces additifs ne seront pas considérés comme source de carbone au sens de la présente invention si les bactéries E coli W employées dans le procédé selon l'invention ne peuvent croître sur lesdits additifs comme seule source de carbone.
De manière avantageuse, la quantité de saccharose dans le milieu de culture du procédé selon l'invention est comprise entre 0,1 et 300 g/1 en début de culture (avant l'ensemencement), de préférence entre 0,5 et 200 g/1. I1 est entendu que le saccharose constituant la principale source de carbone du milieu selon l'invention, la quantité de saccharose ira diminuant au cours du procédé. En général, en fin de réaction la quantité
de saccharose dans le milieu de culture en fin de réaction est comprise entre 0 et 10 g/1.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le milieu de culture approprié comprend en outre une source d'azote organique complémentaire. Cette source d'azote organique complémentaire peut être constituée par toutes les sources d'azote organique connues de l'homme du métier. De préférence, la source d'azote organique complémentaire est constituée par des extraits protéiques. Ces extraits protéiques ont plus préférentiellement la composition suivante : (en g acides aminés pour 100g de produit) Alanine entre 10 et 4, Aspartique entre 11 et 4, Glycine entre 22 et 2,5 et Lysine entre 7 et 4. Les peptones ou protéines de viande ou de pomme de terre répondent à un tel profil est sont particulièrement préférées pour le procédé
selon l'invention, plus particulièrement les dérivés de protéines de pomme de terre.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
7 PCT/FR99/01343 Par système d'expression de protéines hétérologues approprié, on entend selon l'invention tout système d'expression comprenant des éléments de régulation appropriés pour l'expression de protéines hétérologues dans E. coli W. Ces éléments de régulation comprennent notamment les promoteurs, les sites de fixation aux ribosomes, les terminateurs de transcription.
De manière avantageuse, le système d'expression comprend un promoteur Ptrp.
Le promoteur Plrp a été utilisé dans plusieurs exemples (Demande EP 0 198 745 ;
Demande CIP N° 08/194,588 ; Demande WO 97/04083 ; Latta et al., 1987, Bio/Technology 5 : 1309-1314 ; Denèfle et al., 1987, Gene 56 : 61-70). En particulier, Latta et al. (1990, DNA Cell. Biol. 9 : 129-137) ont conduit une étude détaillée sur l'influence de séquences régulatrices en amont du promoteur, de séquences promotrices dupliquées en tandem et sur l'influence de la coexpression du represseur TrpR.
Leur construction de référence, pXL534, a servi de base à la construction de pXL642 (Demande CIP N° 08/194,588 ) utilisée dans les exemples qui illustrent la présente invention. De manière préférentielle, le promoteur Prrp comprend la séquence d'acides nucléiques représentée par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO
1).
Selon un mode de réalisation de l' invention, pour améliorer le niveau d'expression de la protéine hétérologue, on effectue une coexpression des chaperons moléculaires d'E. coli GroESL (revue par Makrides, 1996, précité).
L'augmentation de la concentration intracellulaire des protéines GroESL permet en effet d'assister le repliement de la protéine recombinante et améliore ainsi le taux de protéine active (Weicker et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 494-499). Les gènes dont la coexpression favorise l'expression de la protéine hétérologue selon l'invention, et sa qualité , sont compris dans le système d'expression selon l'invention.
Par protéine hétérologue, on entend selon l'invention toute protéine produite par le procédé selon l'invention qui ne se trouve pas naturellement dans E. coli W, dans le système d'expression approprié selon l'invention. Il peut s'agir d'une protéine d'origine non bactérienne, par exemple d'origine animale, notamment humaine ou végétale, ou encore d'une protéine d'origine bactérienne non produite naturellement par E. coli W, ou encore d'une protéine d'origine bactérienne produite naturellement par une autre bactérie que E. coli W ou bien encore d'une protéine produite naturellement par E. coli W, dont l'expression est contrôlée par des éléments de régulation distincts de FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
8 PCT/FR99/01343 ceux du système d'expression selon l'invention, ou enfin d'une protéine dérivant des précédentes après modifications de certains éléments de sa structure primaire.
Bien entendu, le procédé selon l'invention s'applique à toute protéine d'intérêt dont la production nécessite une forte accumulation de protéines, avant soit de les extraire et de les purifier, totalement ou en partie, soit de les employer en mélange avec la biomasse qui aura permis de les produire. C'est le cas par exemple d'enzymes utiles pour la biocatalyse de réactions chimiques, qui peuvent être employés sans opération préalable d'isolement et de purification ou aussi d'enzymes qui sont utilisées dans la bactérie hôte en cours de croissance pour la biotransformation de composés chimiques.
De manière avantageuse, la protéine hétérologue est une enzyme, produite en quantités industrielles pour un usage ultérieur comme catalyseur de réactions chimiques.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'enzyme est une nitrilase, avantageusement une nitrilase d'Alcaligenes faecalis (ATCC8750) décrite dans la demande de brevet WO 98/18941 ou une nitrilase de C:omamonas testosteroni sp.
décrite dans la demande CIP n°08/194,588 , ou une amidase telle que celles décrites dans les demandes WO 97/04083, EP 433 117, EP 488 916, ou encore une hydroxyphenylpyruvate dioxygénase décrite dans la demande WO 96/38567.
La présente invention concerne également une souche E. coli W telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend un système d'expression de protéines 2o hétérologues dont le promoteur est le promoteur P/rp défini ci-dessus.
Les exemples ci-dessous permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
Les figures 1 à 3 en annexe représentent des cartes de plasmides employés dans les différents exemples.
La figure 1 représente la carte du plasmide pRPA-BCAT41. Les sites entre parenthèse sont des sites qui ont été éliminés lors des clonages. Ptrp :
promoteur tryptophane ; nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription ; fin ROP
fin du gène codant pour la protéine ROP (Chambers et al., 1988, Gene 68 : 139-149) ;
ORI : origine de réplication ; RNAI/II : ARN impliqués dans la réplication ( Chambers 3o et al., précité); Tc : gène de resistance à la tétracycline.
La figure 2 reorésente 1 carte du plasmide pRPA-BCAT127. Les sites entre parenthèse ont été éliminés lors des clonages. Ptrp : promoteur tryptophane ;
nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription; ORI : origine de réplication ;
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
9 PCT/FR99/01343 RNAI*/II : ARN mutés impliqués dans la réplication; Cm : gène de resistance au chloramphenicol ; cer : locus cer .
La figure 3 représente la carte du plasmide pRPA-BCAT103. Les sites entre parenthèse ont été éliminés lors des clonages. Sm/Sp : gène de résistance à la s streptomycine et spectinomycine, parABCDE : locus par (Roberte et Helinski, 1992, 3.
Bacteriol. 174 : 8119-8132) ; rep, mob, D20 et ori : régions intervenant dans la réplication et le transfert du plasmide (Scholtz et al., 1989, Gene 75 : 271-288 ; Frey et al., 1992, Gene 113 : 101-106).
La figure 4 représente la carte du plasmide pRPA-BCAT126. Ptrp : promoteur 1o tryptophane ; nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription; ORI
origine de réplication ; RNAI*/II : ARN mutés impliqués dans la réplication;
Tc' : gène de resistance à la tétracycline; cer : locus cer .
La figure 5 représente la carte du plasmide pRPA-BCAT143. Sm/Sp : gène de résistance à la streptomycine et spectinomycine; rep, mob, et ori : régions intervenant Is dans la réplication et le transfert du plasmide (Scholtz et al., 1989, Gene 75 : 271-288 ;
Frey et al., 1992, Gene 113 : 101-106) ; delta se rapporte au nom de la délétion décrite dans le texte.
Les techniques mises en oeuvre sont des techniques classiques de biologie molécuiaire et de microbiologie, connues de l'homme de l'art et décrites par exemple 2o par Ausubel et al., 1987 (Carrent Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York), Maniatis et al., 1982, (Molecular Cloning : a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York), Coligan et al., (Carrent Protocole in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc).
25 Exemple 1: Construction des plasmides d'expression pBCAT29 et pBCAT41.
Le fragment de 1.27 kb contant le promoteur Pt,.p, le site de fixation du ribosome du gène cII du phage ~, (RBScII) et le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 (nitB) a été extrait du plasmide pRPA6BCAT6 (Demande FR
30 96/13077) à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et XbaI pour être cloné
dans le vecteur pXL642 (décrit dans la demande CIP N°08/194,588) ouvert par les mêmes enzymes de restriction. Le plasmide résultant, pRPA-BCAT15 a été ouvert par les enzymes StuI et BsmI et le fragment de 4,3 kb a été ligaturé avec le fragment StuI-BsmI
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
10 PCT/FR99/01343 de 136 bp purifié de pRPA-BCAT4 (Demande FR 96/13077) pour conduire au plasmide pRPA-BCAT19. Le séquençage partiel de pRPA-BCAT19 a confirmé le remplacement du codon du résidu Asp279 de la nitrilase par le codon d'un résidu Asn279. Le fragment de 1,2 kb EcoRI-Xbal de pRPA-BCAT19 contenant la fusion Ptrp : :RBScII : :nitl3 a été ensuite cloné dans le vecteur pRPA-BCAT28 ouvert par les mëmes enzymes pour conduire au plasmide pRPA-BCAT29 de 6,2 kb. Le vecteur pRPA-BCAT28 a été obtenu en ligaturant le fragment de 3,9 kb SspI-ScaI de pXL642 (demande CIP N°08/194,588) avec le fragment de 2,1 kb SmaI de pHP45S2Tc (Fellay et al., 1987, Gene 52: 147-154) afin de remplacer le marqueur de resistance à
l'ampicilline par le marqueur de resistance à la tétracycline. En détruisant !e site NdeI
proche de l'origine de réplication du plasmide pRPA-BCAT29 par digestion partielle NdeI et action de la Polymérase I d'E. coli (Fragment de Klenow), le plasmide pRPA
BCAT41 a été obtenu dont une carte est représentée sur la figure 1. La séquence de la cassette d'expression est représentée par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO
is 2).
Exemple 2 : Expression de la nitrilase d' A. faecalis ATCC 8750 chez E. coli K12, BL21, W en « batch ».
Les plasmides pRPA-BCAT29 et pXL2035 (Levy-Schill et al., 1995, Gene 161 20 15-20) ont été introduits dans les souches d'E. coli DHSa (CLONECH, Référence produit C1021-1), BL21 (Novagen, référence produit 69386-1) et W (ATCC9637) par électroporation classique. Des cultures d'expression ont été réalisées comme décrit dans l'exemple 5 de la demande FR 96/13077 en réduisant le temps de préculture à 8 heures et en fixant le temps d'expression à 16 heures. Les biomasses après expression ont été
25 estimées d'après la densité optique des cultures lue à 660 nm (D0660) en utilisant la relation suivante : biomasse en gramme de poids sec par litre de culture =
D0660 x 0,35. Les mesures d'activité nitrilasique des cultures ont été réalisées comme décrit dans la demande FR 96/13077. Pour chaque souche, deux clones ont été analysés et pour chaque clone, l'expérience a été répétée. Le tableau 1 contient pour chaque souche 30 la moyenne des données obtenues dans les quatre expériences.
Tableau 1 : Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-et pXL2035 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) SOUCHES BIOMASSE (g/I)ACTIVITE (U) PRODUCTIVITE (P) DHSa 0,15 10,4 1,6 BL21 0,37 6,3 2,4 W 0,65 7,0 4,5 ABREVIA1~IUN5 : g/1 : gramme ae posas sec par mre ae cunure ; u : Kg a ruvmrsH
formé par heure et par kg de poids sec ; P : kg d'HMTBA formé par heure et par litre de culture Ces données montrent que la souche d'E. cols W (ATCC9637) est plus performante pour exprimer la nitrilase NitB.
Exemple 3 : Construction de pBCAT43.
Le gène de la polyamide hydrolase de Comamonas acidovorans N 12 décrit dans to la demande WO 97/04083 (pamll) a été cloné dans le vecteur pBCAT41. En introduisant dans les amorces de PCR les sites de resriction EcoRI et NcoI en position 5' du gène et Xbal en position 3', le gène de cette polyamide hydrolase a été
amplifié
par PCR sous ia forme d'un fragment d'ADN de 1,26 kb. Ce fragment a ensuite été
traité successivement par l'enzyme EcoRI et la nucléase Mung Bean. Après extraction des protéines au phenol-chloroforme-alcool isoamilique, le traitement s'est poursuivi avec une digestion XbaI. De façon similaire, le vecteur pRPA-BCAT41 a été
ouvert avec l'enzyme NdeI puis traité à la nucléase Mung Bean. Après extraction des protéines au phenol-chloroforme-alcool isoarnilique, le traitement s'est poursuivi avec une digestion XbaI. Après ligature des ces deux echantillons, le plasmide pRPA-BCAT43 a 2o été obtenu : il contient le promoteur Prrp, le site de fixation RBScII, séparé du codon d'initiation de la traduction du gène pamll par la séquence : AATACTTACACC.
Exemple 4 : Expression de la polyamidase PamII chez E. cols DHSa, BL21 et W en « batch ».
Le plasmide pRPA-BCAT43 a été introduit dans les souches d'E. cols DHSa, L21 et W par électroporation classique. Des cultures d'expression ont été
réalisées comme décrit dans l'exemple 2 ci-dessus et en variant le temps d'expression de 14 à 24 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) heures. Les biomasses après expression ont été estimées comme dans l'exemple 2 ci-dessus. Les mesures d'activité polyamide hydrolase des cultures ont été
réalisées comme décrit dans la demande WO 97/04083 avec les modifications suivantes - les cellules ont été perméabilisées avec du toluène en resuspendant les culots cellulaire dans un tampon 1 OOmMtrs-HCI, 5 mM EDTA pHB, toluène 1 % de façon à
avoir une concentration en cellules sèches d'environ ~ g/1 ; après une vigoureuse agitation, la suspension est incubée une heure à 4°C puis centrifugée et enfin les culots de cellules perméabilisées sont repris dans un tampon phosphate 100 mM , pH7.
- l'activité d'hydrolyse a été mesurée sur l'oligomère AB (une molécule d'acide adipique condensée à une molécule d'hexaméthylène diamine) présent à 2,5 g/1 dans le milieu réactionnel contenant du tampon phosphate de potassium 0,1 M à pH7 et incubé
à 30°C sous agitation ;
- des prélèvements de 100 microlitres sont faits à intervalles réguliers en leur ajoutant le même volume de NaOH 0,2 N ;
- les échantillons sont analysés par HPLC après dilution au dixième dans une solution d'H3P0, à 50 mM.
Pour chaque souche, de 1 à 24 clones ont été analysés et pour chaque clone, une à sept expériences indépendantes ont été conduites. Le tableau 2 contient pour chaque souche la moyenne des données obtenues.
Tableau 2 : Biomasse et activités des souches hébergeant le plasmide pRPA-BCAT~3 SOUCHES NB CULTURES ACTIVITE (U) PRODUCTIVITE (P) DHSa 11 0,77 0,3 BL21 3 1,4 1,8 W 24 2,1 2,6 ABRÉVIATIONS : N13 : nombre ; U : g a~at~ nyaroiyse par neure et par g ae posas sec ; P : g d'AB hydrolysé p8r heure et par litre de culture Ces données montrent que la souche d'E. cols W (ATCC9637) est plus performante pour exprimer la polyamidase PamII.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) Exemple 5 : Construction et caractérisation du plasmide pBCAT41-531.
Le plasmide pRPA-BCAT41 a subi une étape de mutagenèse réalisée avec de l'hydroxylamine comme décrit dans Miller 1992 (Mutagenesis. A short course in s bacterial genetics, o A laboratory manual and handbook for E. coli and related bacteria », Cold Spring Harbour Laboratory Press, Unit 4, pp81-212) et Humphreys et al., 1976 (Mol. Gen. Genet. 145 : 101-108). Cinq microgrammes d'ADN
plasmidique purifié sur gradient de chlorure de Césium ont été incubés 20 minutes à
80°C dans un tampon phosphate de sodium 50 mM pH6 contenant 0,5 mM EDTA et 0,4 M NHZOH.
l0 Après ajout d'un volume identique de tampon phosphate de sodium 50 mM pH6 contenant 0,5 mM EDTA, le mélange réactionnel a été dialysé contre un large excès de tampon Tris-HCl 10 mM pH7,5 contenant 1 mM EDTA et 100 mM NaCI. L'ADN
plasmidique a ensuite été récupéré par précipitation et environ 20 ng d'ADN a été
introduit par électroporation dans la souche DHSa hébergeant le plasmide pXL2035.
15 Parmi les transformants obtenus, un clone a été sélectionné à cause d'une productivité
de la culture 3 fois supérieure à celle d'une culture de la souche DHSa (pRPA-BCAT41, pXL2035). Le plasmide pRPA-BCAT41-531 qu'il hébergeait a été extrait et réintroduit dans un nouvel hôte DHSa hébergeant le plasmide pXL2035. Trois clones ont alors été analysés dans les conditions décrites dans l'exemple 2 en les comparant à 3 2o clones DHSa (pRPA-BCAT41, pXL2035) et les résultats sont présentés dans le tableau dans le tableau 3 Tableau 3 : Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-BCAT41, pRPA-BCAT41-531 et pXL2035 Souches Biomasse ActivitProductivit (P) DHSa (pRPA-BCAT41, pXL2035) 0,21 12 2,5 DHSa (pRPA-BCAT41-531, pXL2035).0,63 12 7,5 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 99/b4b07 14 PCT/FR99/01343 ABRÉVIATIONS : g/1 : gramme de poids sec par litre de culture ; U : kg d'HMTBA
formé par heure et par kg de poids sec ; P : kg d'HMTBA formé par heure et par litre de culture.
Ces résultats indiquent que l'amélioration de la productivité des cultures est corrélée à la présence du plasmide pRPA-BCAT41-531.
Le fragment de 1,27 kb EcoRI-XbaI contenant la fusion Ptrp : :nitB a été
extrait du plasmide pRPA-BCAT41 pour être cloné à la place de celui contenu dans pRPA-BCAT41-531. Le plasmide résultant, pRPA-BCAT86 a été introduit dans la souche DHSa (pXL2035) et 3 transformants ont été étudiés dans des conditions similaires à
celles décrites ci-dessus. Les résultats sont regroupés dans le tableau 4.
Tableau 4 : Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-BCAT41, pRPA-BCAT41-531, pRPA-BCAT86 et pXL2035 Souches Biomasse Activit Productivit (l~) (U) (P) DHSa (pRPA-BCAT41, pXL2035)0,20 13,8 2,7 DHSa (pRPA-BCAT41-531, pXL2035)0,68 11,0 7,4 (pRPA-BCAT86, pXL2035) 0,69 11,9 8,1 DHSa .

ABRVIATIONS
:
g/1 :
gramme de poids sec par litre de culture ;
U
:
kg d'HMTBA
form par heure et par kg de poids sec ;
P
:
kg d'HMTBA
form par heure et par litre de culture Les résultats montrent que l'amélioration de la productivité des cultures hébergeant pRPA-BCAT41-531 n'est pas due à une amélioration de l'activité
spécifique 2o de la souche et que cette amélioration n'est pas causée par une mutation dans le fragment portant le promoteur Ptrp et le gène nitB.
Exemple 6: Caractérisation d'une mutation portée par le plasmide pBCAT41-531 responsable de l'amélioration de la productivité des cultures de souches exprimant la nitrilase.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) L'analyse de la quantité de protéine produite par les souches de l'exemple 5 par électrophorèse en gel de poiyacrylamide en présence de SDS a montré que toutes ces constructions conduisaient à des taux de synthèse de polypeptide nitrilasique comparables entre les souches décrites dans cet exemple. En revanche, des préparations d'ADN plasmidique de pRPA-BCAT41 et pRPA-BCAT41-531 réalisées à partir de quantités de biomasse équivalentes ont mis en évidence que le plasmide pRPA-BCAT41-531 est présent à plus faible nombre de copie que son parent pRPA-BCAT41:
Le séquençage de la région de 994 bp de pRPA-BCAT41-531 qui s'étend depuis le site Tth111I et qui couvre l'origine de réplication du plasmide a mis en évidence deux différences par rapport à la séquence de la région correspondante de pBR322 (GeneBank #J01749, nom : SYNPBR322). En se référant à la numérotation donnée dans la séquence J01749 (0 est le milieu de l'unique site EcoRI), nous avons trouvé
qu'une insertion d'un A avait eu lieu après la base 2319 et que le C de la position 3039 est remplacé par un T chez pRPA-BCAT41-531. La première différence est imputable à
une erreur lors de l'action de la polymerase Klenow qui a servi à détruire un des sites NdeI de pRPA-BCAT29 et se situe dans une région qui n'est pas décrite comme jouant un rôle dans la réplication de pBR322 (Chambers et al., 1988, Gene 68 : 139-149). La deuxième erreur correspond à une transition, effet caractéristique de l'hydroxylamine sur l'ADN (Drake et Baltz, 1976, Annu. Rev. Biochem. 45 : 11-37), et se situe au 2o niveau du deuxième nucléotide de la région transcrite en ARN I impliquée dans la réplication de pBR322 (Chambers et al., précité). C'est cette dernière mutation qui est responsable du plus faible nombre de copies de pRPA-BCAT41-531 dans DHSa et qui est responsable de la meilleure productivité nitrilasique des cultures de la souche DHSa (pRPA-BCAT41-531, pXL2035).
Exemple 7 : Expression de la nitrilase de A. faecalis ATCC 8750 chez E. coli BL21 et E. coli W en « fed-batch » (culture serai-continue).
Les plasmides pRPA-BCAT41-531 et pXL2035 ont été introduits par électroporation dans les souches BL21 (référence précitée) et W (ATCC9637) pour 3o donner respectivement les, souches RPA-BIOCAT594 [BL21 (pRPA-BCAT41-531, pXL2035)] et RPA-BIOCAT714 [W (pRPA-BCAT41-531, pXL2035)]. Les recombinants E. coli BIOCAT 594 et E. coli BIOCAT 714 ont été cultivés dans des FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) fermenteurs de 3,5 litres contenant 2 litres de milieu dont la composition est la suivante Compos Concentration en g/ I

KHZP04 $

K,HP04 6,3 (NH4)zS04 0,75 MgS0~7H,0 2.5 Sulfate de fer 0,04 CaC12.2H,0 0,05 Sulfate de manganse 0,01 Chlorure de Co 0,004 Sulfate de Zn 0,002 Molybdate de Na 0,002 Chlorure de cuivre 0,002 Acide borique 0,0005 Citrique.H20 1,7 Glucose monohydrat 95 L-tryptophane 0,1 Peptone de viande 5 Extrait de levure 3 Le pH est maintenu à 7,0 par ajout d'ammoniaque. La saturation en oxygène est s maintenue à 20% par ajout d'air à raison de 1 volume/ volume de milieu/
minute et par agitation. Le glucose est introduit au début à une concentration finale de 2 g/ 1. Après être totalement consommé, il est introduit de manière continu à partir d'une solution mère dont la composition est la suivante : glucose 700 g/ I ; MgS04.7H,0 19,6 g/ 1. La vitesse d'addition est de 2,2 g de glucose/h. 1 de milieu.
1o Après 24 heures de fermentation, le milieu est récupéré, centrifugé et le poids sec est estimé en g/ 1. L'activité enzymatique est mesurée suivant un protocole donné
dans le brevet W096/09403. Elle est exprimée en kilos de 3-hydroybutanoate d'ammonium formées par heure et par kilo de cellules sèches.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Souche Biomasse finaleActivit finaleRendement sur glucose BIOCAT 594 (BL2127 g/ 1 13 23%
) BIOCAT 714 (W) 40 g/ 1 17 40%

Il apparaît clairement dans cet exemple, que la nitrilase s'exprime beaucoup mieux dans E. coli W que dans E. coli BL21 et que le recombinant E. coli W
BIOCAT
714 pousse beaucoup mieux que le recombinant E. coli BL21 BIOCAT 594.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 99/64607 1 g PCT/FR99/01343 Exemple 8 : Influence de la source d'azote organique d'origine animale.
La souche E. coli W BIOCAT 714 est cultivée dans un fermenteur de 3,5 litres contenant 2 litres de milieu dont la composition est la suivante Compos Concentration dans le milieu en g/ 1 (NH4)zSO4 0,75 MgS047H20 2,5 Sulfate de fer 0,04 CaClz.2H20 0,04 Sulfate de manganse0,026 Chlorure de Co 0,004 Sulfate de Zn 0,013 Molybdate de Na 0,001 Chlorure de cuivre0,001 Acide borique 0,00025 A1C13 0,00125 Citrique.HzO 1,7 Glucose monohydrat95 L-tryptophane 0,1 Extrait de levure 3 Le pH est maintenu à 7,0 par ajout d'ammoniaque. La saturation en oxygène est maintenue à 20% par ajout d'air à raison de 1 volume/ volume de milieu/ minute et par agitation. Le glucose est introduit au début à une concentration imale de 2 g/
1. Après to être totalement consommé, il est introduit de manière continu à partir d'une solution mère dont la composition est la suivante : glucose 700 g/ 1 ; MgS04.7Hz0 19,6 g/ 1. La vitesse d'addition est de 2,2 g de glucose/h. 1 de milieu.
A ce milieu, on ajoute une source d'azote organique d'origine animale.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Source d'azote organique Biomasse Activit Rendement d'origine finale finale sur animale glucose Aucune 30 2 40%

2,5 g/ 1 de peptone de 33 12 40%
viande g/ I de peptone de viande40 25 45%

5 g/ 1 de casine 35 20 43%

L'utilisation de concentration croissante en azote organique d'origine animale augmente de manière significative l'activité spécifique des cellules.

Exemple 9 : Influence de l'azote organique d'origine végétale.
Les conditions de culture sont identiques à celles de l'exemple 8. Dans cet exemple, on ajoute de l'azote organique d'origine végétal.
Source d'azote organique Biomasse Activit Rendement d'origine finale finale sur vgtale glucose Aucune 30 2 40%

5 g/ 1 de peptone de soja 31 4 40%

5 g/ 1 de peptone de bl 32 5 40%

7,5 g/ 1 d'hydrolysat sodique35 17 43%
de protine de pomme de terre (Alburex SP ; Roquette) l0 L'ajout d'azote organique végétal ne donne pas des résultats identiques suivant l'origine.
De manière surprenante, l'ajout de protéine de pomme de terre, donne d'aussi bon résultat que l'azote organique d'origine animale.
Exemple 10 : influence de la source de carbone.
La souche E. coli W BIOCAT 714 est cultivée dans un fermenteur de 3,5 litres contenant 2 litres de milieu dont la composition est la suivante FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Compos Concentration dans le milieu en g/ 1 Trempe de Mas 40 LAB2218 (Roquette) Extrait de levure 3 MgS047H,0 2,5 Le pH est maintenu à 7,0 par ajout d'ammoniaque. La saturation en oxygène est maintenue à 20% par ajout d'air à raison de 1 volume/ volume de milieu/ minute et par agitation. La source de carbone est introduite au début à une concentration finale de 2 g/
!. Après être totalement consommée, elle est introduite de manière continu à
partir d'une solution mère dont la composition est la suivante : source de carbone 700 g/ 1 ;
MgS04.7Hz0 19,6 g/ 1. La vitesse d'addition est de 2,2 g de glucose ou de saccharose/h.
1 de milieu.
t0 La source de carbone est variée dans cet exemple.
Source de carbone Biomasse Activit Rendement finale finale sur carbone Glucose monohydrat 90 g/ 38 11 45%

Sirop zro (EUROSUCRE) 90 38 17 45%
g/ 1 Dans cet exemple, on observe que l'emploi de saccharose (sirop zéro) comme source de carbone augmente de manière significative l'activité spécifique des cellules.
Exemple 11 : Construction d'un plasmide de co-expression du régulateur TrpR
Un fragment d'ADN de 434 bp porteur du gène dpR et de son promoteur a été
extrait du plasmide pRPG9 (Gunsalus et Yanofsky, 1980, Proc. Natl. Aca. Sci.
USA
77 : 7117-7121) à l'aide des enzymes de restriction AatII et StuI. Ce fragment a été
cloné dans le plasmide pSL301 (Brosius, 1989, DNA 8 : 759-777) en le ligaturant au fragment d'environ 3,I kb AatII-StuI pour donner le plasmide pRPA-BCAT30. Le gène trpR et son promoteur ont alors été extraits de pRPA-BCAT30 sous la forme d'un fragment dEcoRI-NotI de 475 bp pour être cloné dans le plasmide pXL2035 à la place FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) d'un fragment de 240 bp EcoRI-NotI. Le plasmide résultant,pRPA-BCAT34, est donc un dérivé de pKT230 permettant 1 'expression des chaperons GroESL et du régulateur TrpR.
Exemple 12 : Influence de la co-expression de GroESL et de TrpR .
Le plasmide pRPA-BCAT34 a été introduit par électroporation dans les souche DHSa (pRPA-BCAT29), BL21 (pRPA-BCAT29) et W (pRPA-BCAT29). Des cultures d'expression de différentes souches ont été menées comme décrit dans l'exemple 2 et les résultats sont présentés dans le tableau 5.
Tableau S : Biomasse et activités des souches hébergeant des combinaisons les plasmides pRPA-BCAT29, pXL203~ et pRPA-BCAT34 CombinaisonspRPA-BCAT29 pRPA-BCAT29 pRPA-BCAT29 pXL2035 pRPA-BCAT34 HOTE U P U P U P

DHSalpha 0,37 0,16 10,4 1,6 2,0 0,7 BL21 0 0,0 6,4 2,4 5,6 2,0 W 1,7 0,96 7,0 4,5 8,9 6,5 ABREVIATIONS : U : Activité, kg d'HM I tiA forme par heure et par kg de poids ~5 sec ; P : Productivité, kg d'HMTBA formé par heure et par litre de culture Les résultats montrent que la coexpression de GroESL permet d'augmenter la productivité des cultures quelle que soit la souche considérée en améliorant l'activité
spécifique des cultures. Cet effet est corrélé avec une augmentation de la solubilité du 2o polypeptide nitrilasique comme le montre une analyse des protéines par électrophorèse telle que décrite dans la demande FR 96/13077. L'effet de la coexpression du régulateur TrpR est variable selon les souches mais permet chez W d'améliorer la productivité des cultures.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Exemple 13 : Influence de la présence d'un locus cer sur pRPA-BCAT41 Le fragment de 382 bp HpaII contenant le locus cer du plasmide ColEl (Leung et al., 1985, DNA 4 : 3~1-3~~) a été cloné dans la forme replicative du phage M13mp7 au niveau d'un des 2 sites AccI. La construction obtenue a alors permis d'extraire avec l'enzyme EcoRI un fragment d'environ 430 bp contenant le locus cer qui a été
cloné
dans pRPA-BCAT41 au site EeoRI, ce qui a conduit au plasmide pRPA-BCAT66. Ce plasmide a été introduit par électroporation dans la souche W hébergeant le plasmide pRPA-BCAT34. Des cultures d'expression de différentes souches ont été menées comme décrit dans l'exemple 2 en allongeant la durée des cultures d'expression à 24 1o heures et en étudiant trois clones de chaque souche dans une unique expérience. Les résultats moyennés sont présentés dans le tableau 6.
Tableau 6 : Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-BCAT41, pRPA-BCAT66 et pRPA-BCAT34 Souches Biomasse ActivitProductivit (P) W (pRPA-BCAT41, pRPA-BCAT 2,1 6,9 14,5 34) DHSa (pRPA-BCAT66, pRPA-BCAT34)1,8 10,0 18,0 ABRÉVIATIONS : g/1 : gramme de poids sec par litre de culture ; U : kg d'HMTBA
formé par heure et par kg de poids sec ; P : kg d'HMTBA formé par Ces résultats montrent que l'ajout du locus cer sur le plasmide d'expression de la 2o nitrilase conduit à améliorer la productivité des cultures.
Exemple 14 : Construction du plasmide pRPA-BCAT127 Après élimination du site unique NdeI du plasmide pRPA-BCAT30 par digestion et formation d'extremités franches avec de la polymérase I (Fragment de Klenow), le gène trpR a été extrait de ce dernier plasmide sous la forme d'un fragment d'environ 300 bp préparé par un traitement avec l'enzyme AatII suivi de l'action de la polymérase I (Fragment de Klenow), puis, après inactivation du mélange réactionnel, FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) par une digestion avec l'enzyme SacII. Ce fragment a été cioné dans le plasmide pRPA-BCAT66 après ouverture de celui-ci avec Tthlll suivi d'un traitement à la polymérise I Fragment de Klenow) et, après inactivation, avec SacII. Le plasmide pRPA-BCAT$2 a ainsi été obtenu. Son origine de réplication a été remplacée par celle du plasmide pRPA-BCAT41-531 en remplaçant le fragment Bst1107I-Eam1105I
d'environ 1,12 kb. La construction sélectionnée lors de ce clonage, le plasmide pRPA-BCAT99, présente un artefact qui se manifeste sous la forme d'une délétion d'un.
nucléotide au niveau du site Eam1105I, transformant ce site en un site unique PshAI.
Le marqueur de resistance du plasmide pRPA-BCAT99 a alors été changé en clonant t0 entre les sites AatII et PshAl un fragment AatII-PshAI d'environ 1,07 kb préparé après ampüficiation PCR du gène codant pour la resistance au chloramphenicol à
partir de la matrice pACYC184 (New England Biolabs #401-M) en utilisant les amorces Crnl et Cm2 dont la séquence est Cm 1 : 5'-CCCCCCGACAGCTGTCTTGCTTTCGAATTTCTGCC
Cm2:5'-TTGACGTCAGTAGCTGAACAGGAGGG
Le plasmide ainsi obtenu a été appelé pRPA-BCAT123. Il a été ensuite modifié
en éliminant le gène trpR sous la forme d'un fragment SacI-Bstl 107I d'environ 0,525 kb, et refermeture du plasmide après formation d'extremités franches avec de la polymérise Pfu (15 minutes à 75°C dans le tampon recommandé par le fournisseur Stratagène et en 2o présence de 0,2 mM de deoxynucléotides). Le plasmide ainsi obtenu est le plasmide pRPA-BCAT127 dont la carte est schématisée sur la figure 2.
Exemple 15: Construction des plasmides pRl'A-BCAT98 et pRPA-BCAT103 .
Le plasmide pRPA-BCAT37, décrit dans la demande FR 96/13077, a été
modifié en remplaçant le fragment SfiI-ScaI d'environ 3,2 kb par le fragment SfiI-ScaI
d'environ 2,42 kb du plasmide RSFIOlOD20 (Frey et al., 1992, Gene 113 :101-106).
Ce fragment contient une délétion dans la partie S' du gène codant pour la primase RepB et réduit de 6 log la fréquence de transfert du plasmide (Frey et al., précité). Le plasmide ainsi obtenu, pRPA-BCAT98, possède plusieurs avantages : la perte de ses fonctions de mobilisation le rend conforme aux règles de biosécurité
industrielle tout en lui gardant ses caractéristiques de réplication chez les bactéries Gram-négatives.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Le locus par (Gerlitz et al., 1990, J. Bacteriol 172 : 6194-6203) a ensuite été
cloné sur pRPA-BCAT98 comme suit. Le fragment SphI-BamHI d'environ 2,3 kb de pGMA28 (Gerlitz et al., précité) a d'abord été cloné dans le vecteur pUCl8, ce qui a permis de l'extraire sous la forme d'un fragment HindIII-EcoRI pour le cloner dans le vecteur pMTL22 (Chambers et al., 1988, Gene 68:139-49). Le site HindIII a ensuite été détruit par digestion HindIII et traitement à la Klenow. Un fragment d'environ 2,38 kb a alors été extrait avec les enzymes PstI et BgIII pour être cloné dans le vecteur pXL2426 aux sites PstI et BamHI et conduire au vecteur pXL2572. Le vecteur pXL2426 provient du remplacement du fragment de 2,38 kb SfiI-EcoRV de pXL2391 (demande FR 96/13077) par le fragment SfiI-EcoRV de 1,47 kb de RSF1010D20. Le clonage sur le plasmide pXL2572 aux sites NdeI et BamHI d'un fragment d'environ 0,960 bp NdeI-BamHI de pRR71 (Weinstein et al., 1992, J. Bacteriol. 174 : 7486-7489) a permis de reconstituer le locus par en entier sur le plasmide pXL2573. Ce locus a alors été extrait de pXL2573 sous la forme d'un fragment de 2,6 kb EcoRI-extremité
franche (après traitement par PstI et Klenow) afin d'être cloné sur le plasmide pRPA-BCAT98 ouvert par EcoRI et SacI, cette dernière extremité ayant été traitée par Ia polymerase Pfu. Le plasmide résultant a été appelé pRPA-BCAT103 et sa carte est schématisée sur la figure 3.
2o Exemple 16 : Utilisation des plasmides pRPA-BCAT98, pRPA-BCAT103 et pRPA-BCAT127 pour l'expression de la nitrilase chez W.
Les plasmides pRPA-BCAT127, pRPA-BCAT98, pRPA-BCAT103, pXL2035 et pXL2231 (demande FR 96/13077) ont été introduits dans la souche d'E. coli W
par électroporation et des cultures d'expression ont été menées dans les conditions décrites dans l'exemple 2 en utilisant les antibiotiques suivants : Tétracycline 12 pg/ml pour pXL2231, kanamycine 50 p.g/ml pour pXL2035, Streptomycine 100 qg/mi pour pRPA-BCAT98 et pRPA-BCAT103, Chloramphenicol 20 pg/ml pour pRPA-BCAT127. Pour chaque combinaison de plasmides, deux à trois clones ont été analysés et Ies résultats moyens sont présentés dans le tableau 7.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Tableau 7: Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-BCAT~1-531, pRPA-BCATl2 ï, pRPA-BCAT98, pRPA-BCAT103, pXL203~ et pXL2231 s Combinaison Biomasse ActivitProductivit (g/1) (i1) (P) pBCAT127 / pXL2231 1,43 4,9 7 pBCATI27 / pBCAT 103 1,'75 7 12 pBCAT127 / pBCAT98 1,72 11,2 19 pBCAT127 / pXL2035 1,'70 7,2 12 pBCAT4I-531 / pXL2035 1,36 5,9 8 ABREVIA1~IUN5 : g/1 : gramme de poids sec par litre de culture ; U
kg d'HMTBA formé par heure et par kg de poids sec ; P : kg d'HMTBA
formé par heure et par litre de culture 1o Les combinaisons pRPA-BCAT127/pRPA-BCAT98 et pRPA-BCAT127/pRPA-BCAT103 permettent une productivité au moins équivalente en utilisant des plasmides conformes aux critères de biosécurité européens.
Exemple 17 : Construction du plasmide pRPA-BCAT126 Le marqueur de résistance du plasmide pRPA-BCAT99 décrit dans l'exemple 15 14 a été changé comme suit. Le vecteur a été ouvert par les enzymes PshAI
et AatII
puis traité avec de la polymérase Pfu (5 min à 75°C dans le tampon recommandé par le fournisseur Stratagene et en présence de 0,2 mM de deoxynucléotides) et le fragment d'environ 3,95 kb a été extrait d'un gel d'agarose à l'aide du kit Quiaex (Quiagen) [d'autres systèmes de récupération d'ADN peuvent aussi être utilisés, notamment ceux 2o de type chromatographiqueJ. I1 a été mis en ligation selon une méthode classique avec le fragment de 1,32 kb HindIII-BsmI extrait du plasmide pBR322 (New England Biolabs, ref 303-3S) puis traité comme ci-dessus .avec la polymérase Pfu.
Parmi les plasmides obtenus, le plasmide contenant l'insert porteur du gène de résistance à la tétracycline orienté dans le même sens de transcription que la cassette d'expression de la FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) nitrilase a été nommé pRPA-BCAT1 I 1. Ce plasmide a alors été ouvert par les enzymes NsiI et BstZl7I puis traité à la polymérase Pfu et religué afin d'éliminer le fragment de 0,47 kb porteur du gène trpR. Le plasmide obtenu a été nommé pRPA-BCAT126 dont une carte est représentée sur la figure 4.
Exemple 1$ : Construction du plasmide pRPA-BCAT143 Le plasmide pRPA-BCAT98 décrit dans l'exemple 15 a été ouvert par les enzymes SfiI et ScaI pour remplacer le fragment de 2,42 kb porteur de la délétion dans la partie 5' du gène codant pour la primase RepB par le fragment de 2,96 kb SfiI-ScaI
1 o extrait du plasmide RSF 1 O 1 OD 18 portant une délétion en phase de 267 bp dans la partie 5' du gène repB ( Frey et al., 1992, Gene 113 : 101-106). La délétion introduite sur pRPA-BCAT 143 réduit la fréquence de transfert du plasmide à 10-6 ( Frey et al., 1992, Gene 113 : 101-106) et le rend conforme aux exigences des règles de biosécurité.
Contrairement au plasmide pRPA6BCAT98 décrit précédemment, ce nouveau plasmide conserve un nombre de copies voisin du plasmide non modifié pXL2035 (Lévy-Schill et al., 1995, Gene 161 : 15-20). IL est représenté sur la figure 2.
Exemple 19 : Utilisation des plasmides pRPA-BCAT126 et pRPA-BCAT143 pour l'expression de la nitrilase chez W
2o Les plasmides pRPA-BCAT126, pRPA-BCAT127 (décrits ci-dessus), pRPA-BCAT143, pRPA-BCAT98, pXL2035 ont été introduits dans la souche d'E. coli W
par électroporation et des cultures d'expression ont été menées dans les conditions décrites dans l'exemple 2 en utilisant les antibiotiques suivants : Tétracycline 12 pg/ml pour pRPA-BCAT41-531 et pRPA-BCAT126, kanamycine 50 pg/ml pour pXL2035, Streptomycine 100 pg/ml pour pRPA-BCAT98 et pRPA-BCAT143, Chloramphenicol 20 pg/ml pour pRPA-BCAT127. Pour chaque combinaison de plasmides, deux à trois clones ont été analysés et les résultats moyens sont présentés dans le tableau 8.
Tableau 8: Biomasse et activités des souches hébergeant les plasmides pRPA-BCAT41-531, pRPA-BCATI26, pRPA-BCATI27, pRPA-BCAT98, pRPA-BCATI43, pXL2035.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Combinaison Biomasse ActivitProductivit N) ~P) pBCAT41-531 / pXL2035 2,3 9,5 22 pBCAT41-531 / pBCAT1432,5 8,9 22 pBCAT126 / pXL2035 2,2 9.8 21 pBCAT126 / pBCAT98 1,3 3,5 4,5 pBCAT126 / pBCAT 143 2,5 8,1 20 pBCAT127 / pBCAT143 2,g 7,1 20 ABREVIATIONS : g/1 : gramme de poids sec par litre de culture ; U
kg d'HMTBA formé par heure et par kg de poids sec ; P : kg d'HMTBA
formé par heure et par litre de culture Contrairement au plasmide pBCAT98, les combinaisons du plasmide pRPA-BCAT143 avec l'un des plasmides pRPA-BCAT41-531, pRPA-BCAT127 ou pRPA-BCAT126 permettent de conserver la productivité des cultures réalisées avec les lo souches hébergeant le plasmide pXL2035.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) LISTE DE SEQUENCES

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i.) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 121 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

TGGCTGCAGG

AAATACTTAC

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1793 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire () TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:123..1190 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

TGGCTGCAGG

AAATACTTAC

CAG GCC GCC

Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala ATT GAG CTG

Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu ACC TGG CTG CCC GGC TAT CCC TTC CAC GTC TGG.CTG GGC GCA CCG GCC 311 Thr Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Trp Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly g0 85 90 95 Ile Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Gln Met Leu Trp Ser Arg AAA AAA GGT
CCT

ArgLys LeuLysProThrHis ValGluArgThr ValPheGlyGlu Gly TyrAla ArgAspLeuIleVal SerAspThrGlu LeuGlyArgVal Gly AlaLeu CysCysTrpGluHis LeuSerProLeu SerLysTyrAla Leu TyrSer GlnHisGluAlaIle HisIleAlaAla TrpProSerPhe Ser LeuTyr SerGluGlnAlaHis AlaLeuSerAla LysValAsnMet Ala AlaSer GlnIleTyrSerVal GluGlyGlnCys PheThrIleAla Ala Ser Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly Leu Ile Ile Ala Asp L8u Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) LeuValLeu AspLeuGlyHisArg GluProMetThr ArgValHisSer LysSerVal IleGlnGluGluAla ProGluProHis ValGlnSerThr AlaAlaPro ValAlaValSerGln ThrGlnAspSer AspThrLeuLeu TGACAAGGCC
CGGGCAAACT

ValGlnGlu ProSer (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES.DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) (ü) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Procédé industriel de préparation de protéines hétérologues dans E coli, dans lequel on ensemence et on cultive dans un milieu de culture approprié des bactéries E coli modifiées avec un système d'expression de protéines hétérologues approprié, caractérisé en ce que la souche de E. coli est une souche E. coli W.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche W est la souche W déposée à l'ATCC sous le numéro 9637.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche W est un dérivé de la souche déposée à l'ATCC sous le numéro 9637 obtenu par sélection clonale ou manipulation génétique.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié est un milieu de culture approprié pour l'obtention d'une forte densité de biomasse et une forte teneur en protéines hétérologues produites.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend du L-tryptophane.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la quantité de L-tryptophane dans le milieu de culture est comprise entre 0,05 et 0,5 g/l, de préférence entre 0,1 et 0,3 g/l
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend du saccharose comme principale source de carbone.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu de culture ne comprend substantiellement que du saccharose comme source de carbone.
9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la quantité de saccharose dans le milieu de culture est comprise entre 0,1 et 300 g/l en début de culture, de préférence entre 0,5 et 200 g/l.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend en outre une source d'azote organique complémentaire.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la source d'azote organique complémentaire est constituée par des extraits protéiques.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'extrait protéique a la composition suivante : (en g acides aminés pour 100g de produit) Alanine entre 10 et 4, Aspartique entre 11 et 4, Glycine entre 22 et 2,5 et Lysine entre 7 et 4
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la source d'azote organique complémentaire est constituée par les peptones ou protéines de viande ou de pomme de terre, plus particulièrement les dérivés de protéines de pomme.
de terre.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le système d'expression de protéines hétérologues approprié comprend un promoteur P trp.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le promoteur P trp comprend la séquence d'acides nucléiques représentée par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1).
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la protéine hétérologue est une enzyme.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'enzyme est utile pour la biocatalyse de réactions chimiques.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'enzyme est une nitrilase.
19. Souche E. coli W, caractérisée en ce qu'elle comprend un système d'expression de protéines hétérologues dont le promoteur est le promoteur P trp
20. Souche selon la revendication 19, caractérisée ne ce que le promoteur P
trp comprend la séquence d'acides nucléiques représentée par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1).
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