JP5808527B2

JP5808527B2 - 有用物質製造方法

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Publication number: JP5808527B2
Application number: JP2010090255A
Authority: JP
Inventors: 芳充柳原
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2015-11-10
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: JP2011217671A

Description

本発明は、有用物質の製造方法に関する。詳しくは、界面活性剤と細菌とを同時に存在させる事により有用物質を分泌生産させる有用物質の製造方法に関する。

細菌は、アミノ酸、タンパク質等の有用物質を製造するために広く利用されている。有用物質生産に用いる細菌として、大腸菌が多用されており、遺伝子工学技術の進展に伴って医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を大腸菌に導入して有用タンパク質を効率的に製造する技術が知られている。
通常、大腸菌を用いてタンパク質を発現した場合、目的タンパク質を抽出するために、超音波、高圧ホモジナイザー、フレンチプレス等の物理的破砕法が用いられている。しかし、これらの物理的破砕法はタンパク質を取り出す際、大腸菌の細胞内に存在する目的のタンパク質以外の物質も大量に混入するため、純度が低下するという問題がある。
この問題を解決する有用物質の生産方法として、有用物質を分泌生産する方法が知られている。有用物質の分泌生産は、目的の有用物質を高純度で獲得する目的でも、高い生産性を達成する目的でも有効である。

有用物質の分泌生産において、界面活性剤を用いる方法が知られている。例えば、グルタミン酸の生産では、界面活性剤の一種であるポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートが用いられている（特許文献１）。また、セルラーゼ等のタンパク質の生産においても界面活性剤が用いられている（非特許文献１）。
分泌生産を行う際、高い生産性を持続でき、生産時間を長くすることが生産性の向上につながる。しかし、高い生産性を持続させるために必要な因子については知られていない。

国際公開第９９／０７８５３号パンフレット

バイオインダストリー協会発酵と代謝研究会編集、「発酵ハンドブック」、共立出版、２００１年７月、２５３頁

本発明が解決しようとする課題は、界面活性剤を用いる有用物質の分泌生産方法において、細菌の分泌生産を高い状態で持続する培養方法を提供することである。

本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む有用物質の細胞外分泌生産方法であって、工程（ａ）に要する時間の１０％以上の時間の間、工程（ａ）における培養液中のタンパク質濃度が１５〜５００ｇ／Ｌであり、有用物質がペプチド又はタンパク質であり、有用物質を生産する細菌が大腸菌であり、界面活性剤（Ｂ）が両性界面活性剤（Ｂ１）又はアニオン性界面活性剤（Ｂ２）である有用物質製造方法である。
工程（ａ）：有用物質を生産する細菌を培養する培養液と界面活性剤（Ｂ）とを同時に存在させて有用物質を細胞外に分泌させる工程。
工程（ｂ）：細菌と、培養液及び有用物質とを分離する工程。

本発明は以下の効果を奏する。
界面活性剤を用いる有用物質の分泌生産過程で本発明の培養方法を用いることで、有用物質の生産量を増大させる事が出来る。

本発明における細菌として、以下に例を挙げるがこれらに限定するものではない。細菌には、真正細菌及び古細菌が含まれる。真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。また、用いる細菌は特定の遺伝子欠損又は遺伝子の過剰発現をしていても良い。

これらのうち、有用物質の生産性の観点から、エシェリチア属菌が好ましく、さらに好ましくは大腸菌である。

本発明における有用物質は、特に限定されないが、組み換えタンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、オリゴ糖及び核酸等が含まれる。

組み換えタンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝、ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝、抗体｛１本鎖抗体、ＩｇＧラージサブユニット、ＩｇＧスモールサブユニット等｝、抗原タンパク質｛Ｂ型肝炎表面抗原等｝、機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）等｝、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）等が挙げられる。ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。

オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。

核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。

これらの有用物質のうち、有用物質の生産性の観点から、ペプチド及びタンパク質が好ましく、さらに好ましくは組み換えタンパク質であり、次にさらに好ましくは酵素、一本鎖抗体、ホルモンタンパク質及び抗原タンパク質である。

本発明において界面活性剤（Ｂ）は、両性界面活性剤（Ｂ１）、アニオン性界面活性剤（Ｂ２）ノニオン性界面活性剤（Ｂ３）及びカチオン性活性剤（Ｂ４）が含まれる。

両性界面活性剤（Ｂ１）としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ｂ１−１）、硫酸エステル塩型両性界面活性剤（Ｂ１−２）、スルホン酸塩型両性界面活性剤（Ｂ１−３）及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ｂ１−４）が含まれる。

カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ｂ１−１）は、アミノ酸型両性界面活性剤（Ｂ１−１−１）、ベタイン型両性界面活性剤（Ｂ１−１−２）及びイミダゾリン型両性界面活性剤（Ｂ１−１−３）等が挙げられる。
アミノ酸型両性界面活性剤（Ｂ１−１−１）は、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、下記一般式（１）で示される化合物等が挙げられる。
［Ｒ−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯ］_mＭ（１）
一般式（１）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。ｎは１又は２の整数である。ｍは１又は２の整数である。Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
また、（Ｂ１−１−１）は、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）及びＮ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。

ベタイン型両性界面活性剤（Ｂ１−１−２）は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤であり、下記一般式（２）で示されるもの等のアルキルジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、アミドベタイン（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等）及びアルキルジヒドロキシアルキルベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）等が挙げられる。
Ｒ−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₂−ＣＨ₂ＣＯＯ^- （２）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。

イミダゾリン型両性界面活性剤（Ｂ１−１−３）としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。

その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤；ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤；コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）；ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。

アニオン性界面活性剤（Ｂ２）としては、エーテルカルボン酸（Ｂ２−１）及びその塩、硫酸エステル（Ｂ２−２）又はその塩、エーテル硫酸エステル（Ｂ２−３）及びその塩、スルホン酸塩（Ｂ２−４）、スルホコハク酸塩（Ｂ２−５）、リン酸エステル（Ｂ２−６）及びその塩、エーテルリン酸エステル（Ｂ２−７）及びその塩、脂肪酸塩（Ｂ２−８）、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）等が挙げられる。

エーテルカルボン酸（Ｂ２−１）又はその塩としては炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテルカルボン酸及びその塩が含まれ、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。

硫酸エステル（Ｂ２−２）及びその塩としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する硫酸エステル及びその塩が含まれ、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。

エーテル硫酸エステル（Ｂ２−３）及びその塩としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が含まれ、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。

スルホン酸塩（Ｂ２−４）としては、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。

スルホコハク酸塩（Ｂ２−５）としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。

リン酸エステル（Ｂ２−６）としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。

エーテルリン酸エステル（Ｂ２−７）としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。

脂肪酸塩（Ｂ２−８）としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。

ノニオン性界面活性剤（Ｂ３）としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物（Ｂ３−１）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ｂ３−２）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ３−３）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ｂ３−４）等が含まれる。

高級アルコールＡＯ付加物（Ｂ３−１）としては、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含まれ、アルキルエーテル炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）等が挙げられる。

アルキルフェノールＡＯ付加物（Ｂ３−２）としては、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールのＡＯ付加物が含まれ、オクチルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物並びにノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等が挙げられる。また、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４、ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−５２０及びｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０等が市場から容易に入手できる。

脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ３−３）としては、炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物が含まれ、オレイン酸ＥＯ９モル付加物、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物等が挙げられる。

多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ｂ３−４）としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物、並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等）及びこれらのＡＯ付加物が含まれ、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ付加物及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ付加物等が挙げられる。

カチオン性界面活性剤（Ｂ４）としては、アミン塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ４−１）及び第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ４−２）等が挙げられる。

アミン塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ４−１）としては、ラウリルアミン、ステアリルアミン、トリエタノールアミンモノステアリン酸エステル、ステアラミドエチルジエチルアミン、ステアリン酸とアミノエチルエタノールアミンの縮合物にさらに尿素を縮合させたもの、硬化牛脂アミン及びロジンアミン等のギ酸、酢酸及び塩酸等の酸中和物が挙げられる。

第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ４−２）としては、ステアラミドメチルピリジニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ベンジルラウリルジメチルアンモニウムクロライド及びセチルピリジニウムブロマイド等があげられる。

界面活性剤（Ｂ）としては、分泌効率の観点から、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ｂ１−１）、エーテルカルボン酸（Ｂ２−１）、スルホン酸塩（Ｂ２−４）、高級アルコールＡＯ付加物（Ｂ３−１）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ｂ３−４）が好ましく、さらに好ましくはラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、コカミノプロピオン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル及びヤシ油脂肪酸ジエタノールアミドである。

本発明において界面活性剤（Ｂ）は、使用に当たっては、界面活性剤（Ｂ）をそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いることができる。
水性希釈液における、界面活性剤（Ｂ）の合計濃度は、対象となる細菌、生理活性物質の種類及び分泌方法の種類によって適宜選択されるが、有用物質の分泌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜５０重量％である。

後述する工程（ａ）における培養液に含まれる界面活性剤（Ｂ）の使用量（重量％）は、対象となる細菌、生産される有用物質の種類及び分泌方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、分泌効率及びタンパク質の変性のさせにくさの観点から、０．０００１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜１０、次にさらに好ましくは０．０１〜５である。

界面活性剤（Ｂ）はあらかじめ培養液と混合して使用する以外に、細菌を懸濁させた培養液に後から添加しても良い。培養液との混合は、４℃〜９９℃で培養液に界面活性剤（Ｂ）を添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。後から混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。

界面活性剤（Ｂ）の使用にあたっては、上記界面活性剤（Ｂ）を単独で用いる以外に、数種類を混合して用いても良い。

本発明の有用物質製造方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含んでなる。
工程（ａ）：有用物質を生産する細菌を培養する培養液と界面活性剤（Ｂ）とを同時に存在させて有用物質を細胞外に分泌させる工程。
工程（ｂ）：細菌と、培養液及び有用物質とを分離する工程。

上記工程（ａ）の開始時点は、培養液中に培養されている細菌と界面活性剤（Ｂ）との両方が含まれた時点である。また、工程（ａ）は、工程（ｂ）の開始により終了する。

本発明の有用物質の細胞外分泌生産方法において、培養液とは、細菌が増殖するための成分を含有する液体である。

培養液中には、水、炭素源及び窒素源等が含まれる。炭素源としては、細菌がＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を合成できなおかつ代謝により同化できる物であり、グルコース等の糖、脂質及びタンパク質等が挙げられる。窒素源としては、細菌がタンパク質や核酸の生合成に用いることができる物であり、タンパク質、アミノ酸、アンモニア及び尿素等が挙げられる。

工程（ａ）における培養液中のタンパク質濃度は、培養液中にタンパク質を加え、その量を調整することで容易に調製できる。
培養液中に加えるタンパク質としては、ポリペプトン、バクトトリプトン、ラクトアルブミン、大豆フレーク、酵母エキス、肉エキス、血液、血清、コーンスティープリカー、ホエー、ピーナッツミル、綿実ミル、カゼイン、ゼラチン、魚粉及びこれらの分解物であるタンパク質が挙げられる。

培養液中に加えるタンパク質としては、有用物質の生産性向上の観点から、ポリペプトン、バクトトリプトン、ラクトアルブミン、肉エキス、ホエー及びカゼインが好ましく、さらに好ましくはラクトアルブミン、ホエー及びカゼインである。

本発明の有用物質の細胞外分泌生産方法において、工程（ａ）に要する時間の１０％以上の時間の間、工程（ａ）における培養液中のタンパク質濃度は、１５〜５００ｇ／Ｌである。タンパク質濃度は、培養液の体積を基準として１５〜５００ｇ／Ｌであり、生産量増大の観点から、好ましくは２０〜２００ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは２５〜１５０ｇ／Ｌである。タンパク質濃度が１５ｇ／Ｌ未満では組み換えタンパク質の生産効率が悪くなり、５００ｇ／Ｌを超えると菌の増殖もしくは生存に悪影響を及ぼす。

本発明におけるタンパク質濃度は、ＢＣＡ法を用いてＢＳＡを検量線として測定した値である。

上記工程（ａ）に要する時間のうち、タンパク質濃度が上記の範囲内である時間は、１０％以上であり、生産量増大の観点から５０％〜１００％が好ましく、さらに好ましくは８０％〜１００％である。工程（ａ）に要する時間の１０％未満である場合、組み換えタンパク質の生産量低下を招く。

上記工程（ｂ）は、細菌と培養液及び有用物質とを分離する工程である。分離する方法としては、例えば、連続遠心機の使用やホロファイバー、フィルタープレスなど膜を用いて細菌と培養液及び有用物質とを分離する方法が一般的であり、本発明においても用いることができる。

本発明の有用物質製造方法において、工程（ａ）及び（ｂ）は複数回交互に繰り返しても良い。工程（ａ）及び（ｂ）を複数回交互に繰り返す場合は、いずれかの工程（ａ）において、当該工程（ａ）に要する時間の１０％以上の時間の間、当該工程（ａ）における培養液中のタンパク質濃度が１５〜５００ｇ／Ｌを満たせば良く、全ての工程（ａ）において満たすのが好ましい。

以下に細菌を使用する有用物質の生産方法の一例を示す。
（i）遺伝子組み換え
（ｉ−１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、ＤＮＡをファージ又はプラスミドに組み込む。もしくは、ゲノムＤＮＡ上の有用遺伝子を直接ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）等の方法で増幅し、該ＤＮＡをファージ又はプラスミドに組み込む。
（ｉ−２）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパク質遺伝子の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉ−３）その組み換えファージＤＮＡ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズム間隙に目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。

上記のプラスミドの例としては、ｐＵＣ１９などのｐＵＣシリーズ、ｐＥＴ−２２ｂなどのｐＥＴシリーズ、ｐＢＡＤシリーズ、ｐＢＲ３２２などが挙げられる。

（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）有用物質生産用細菌を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）培養に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地に培養した組み換え細菌を植菌し本培養を開始する。本培養は、通常１５〜４３℃で１２〜７２時間行う。本工程で界面活性剤（Ｂ）を添加する。培養の始めから界面活性剤（Ｂ）を使用する場合は、（Ｂ）と培養液を混合し均一化したものを、培養液として用いる。培養を開始した後（Ｂ）を使用する場合は、培養開始直後から培養開始後７２時間後までの間に界面活性剤（Ｂ）を加えて培養を５〜１００時間継続する。
本培養において、培養の始めから（Ｂ）を使用する場合は本培養は工程（ａ）を指し、培養を開始した後（Ｂ）を使用する場合は（Ｂ）を加えた時点からが工程（ａ）である。
工程（ａ）においてタンパク質濃度を測定する。細菌と界面活性剤（Ｂ）の両方が含まれた時点及びその時点から、０．５〜１２時間おきにサンプリングし、タンパク質濃度を測定し、縦軸をタンパク質濃度、横軸を時間としてグラフを描き、タンパク質濃度が上記の濃度である時間の割合を確認する。タンパク質濃度は、タンパク質又は培養液を加え、その量を調整することで調製する。
（ｉｉ−２）において、細菌の濃度は１〜１０¹³細胞／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０²〜１０¹¹細胞／ｍｌである。
（ｉｉ−２）において、界面活性剤（Ｂ）の使用量（重量％）は、上記の通りである。

（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ−１）遠心分離、中空糸分離、ろ過等により細菌と培養液及び有用物質とに分離される。
（ｉｉｉ−２）有用物質及び培養液は、さらにイオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜おこなうにことよって有用物質と培養液に分離精製される。

（ｉｉｉ−１）で分離された細菌は、その後、培養釜に戻し、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらに（ｉｉｉ）の工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。

上記の（ｉｉｉ）の有用物質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。

上記の（ｉｉｉ）の菌体や有用物質の分離・取り出し工程における膜としては、中空糸型の分離装置、平膜型の膜分離装置などが挙げられる。市販品としては、ＣＦＰ−２−Ｅ−５５などＣＦＰシリーズ（ＧＥ社）、ＵＦＰ−１０−Ｅ−６５などＵＦＰシリーズ（ＧＥ社）、ＭＦシリーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＵＦシリーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）等が入手可能である。

本発明の生産方法で得られる有用物質は、従来よりも純度が高い。また生産性に優れているので高い収量を得ることができる。

以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜製造例１＞
プライマー１と２（表１）を用いてＰＣＲ法によりＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎＣａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、プロテアーゼを発現する大腸菌（α）を作成した。

＜製造例２＞
プライマー３と４（表１）を用いてＰＣＲ法によりＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｂｇｌＣ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、セルラーゼを発現する大腸菌（β）を作成した。

＜製造例３＞
プライマー５と６（表１）を用いてＰＣＲ法によりＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓのｌｉｐ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、リパーゼを発現する大腸菌（γ）を作成した。

＜製造例４＞
プライマー７と８（表１）を用いてＰＣＲ法によりＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのａｍｙＫ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＥｃｏＲＩ制限酵素サイトに結合した。その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、アミラーゼを発現する大腸菌（δ）を作成した。

＜比較例１〜４＞
大腸菌（α）〜（δ）をＬＢ培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ）１０ｍｌに白金耳で植菌して３７℃で一夜振とう培養を行った。この培養液を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）２００ｍｌに植菌し３７℃で培養を行った。培養液の濁度が２．０になったときに、０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、０．３重量％になるようにポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩（三洋化成工業（株）製、商品名「ビューライトＬＣＡ−２５Ｎ」）を添加した。その後もさらに培養を継続し、１時間おきに１５ｍｌずつサンプリングを行い、遠心分離を行い上清を回収し、生産した組み換えタンパク質の量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により定量を行い、培養液中のタンパク質濃度はＢＣＡ法（ＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社））により定量を行った。生産したタンパク質を定量した結果は、比較例１〜４の定量値を１．００とし、実施例１〜１０の結果を、比較例１〜４の定量値を基準とする相対値で示した。結果を表２〜４にまとめた。

＜実施例１〜３＞
比較例１において、ＬＢ培地で終夜培養を行った大腸菌（α）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液にラクトアルブミンを加えた事以外は比較例１と同様にして培養し、比較例１と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びプロテアーゼ量の比較例１との定量値を基準とする相対値の結果を表２にまとめた。

＜実施例４＞
比較例１において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（α）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液に肉エキス（和光純薬工業製）を加えた事以外は比較例１と同様にして培養し、比較例１と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びプロテアーゼ量の比較例１との定量値を基準とする相対値の結果を表２にまとめた。

＜実施例５＞
比較例１において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（α）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液にポリペプトン（日本製薬製）を加えた事以外は比較例１と同様にして培養し、比較例１と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びプロテアーゼ量の比較例１との定量値を基準とする相対値の結果を表２にまとめた。

＜実施例６＞
比較例１において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（α）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液に大豆タンパク質（和光純薬工業製）を加えた事以外は比較例１と同様にして培養し、比較例１と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びプロテアーゼ量の比較例１との定量値を基準とする相対値の結果を表２にまとめた。

＜実施例７〜８＞
比較例２において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（β）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液にラクトアルブミン（和光純薬工業製）を加えた事以外は比較例２と同様にして培養し、比較例２と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びセルラーゼ量の比較例２との定量値を基準とする相対値の結果を表３にまとめた。

＜実施例９＞
比較例３において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（γ）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液にラクトアルブミンを加えた事以外は比較例３と同様にして培養し、比較例３と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びリパーゼ量の比較例３との定量値を基準とする相対値の結果を表４にまとめた。

＜実施例１０＞
比較例４において、ＬＢ培地で一夜培養を行った大腸菌（δ）をＴＢ培養液に植菌する前のＴＢ培養液にラクトアルブミンを加えた事以外は比較例４と同様にして培養し、比較例４と同様の方法を用いて評価をおこなった。培養液中のタンパク質濃度及びアミラーゼ量の比較例４との定量値を基準とする相対値の結果を表５にまとめた。

＜製造例５＞
ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、ペプチドを発現する大腸菌（ε）を作成した。

＜比較例５＞
大腸菌（ε）をＬＢ培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ）１０ｍｌに白金耳で植菌して３７℃で一夜振とう培養を行った。この培養液を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）２００ｍｌに植菌し３７℃で培養を行った。培養液の濁度が２．０になったときに、０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、０．３重量％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。その後もさらに培養を継続し、１時間おきに１５ｍｌずつサンプリングを行い、遠心分離を行い上清を回収し、生産したペプチドの量はウエスタンブロット法により抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて定量を行い、培養液中のタンパク質濃度はＢＣＡ法（ＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社））により定量を行った。生産したペプチドを定量した結果は、比較例５の定量値を１．００とし、実施例１１の結果は、比較例５の定量値を基準とする相対値で示した。結果を表６にまとめた。

＜実施例１１＞
集菌した大腸菌（ε）を用いたこと以外は実施例１と同様に行い、比較例５の定量値を基準とする相対値を算出し、結果を表６にまとめた。

＜比較例６＞
製造例２で得た大腸菌（β）の終夜培養液１０ｍｌを作製し、２５０ｍｌ培養液（ＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）、０．７重量％硫酸アンモニウム、０．０５重量％クエン酸２アンモニウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム）に植菌し１Ｌ微生物培養装置（エイブル社）を用いてｐＨ７．０、３７℃で維持したまま培養を行った。培養開始３時間後に、１ＭＩＰＴＧを０．７５ｍｌと０．３重量％になるようにヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン（三洋化成工業（株）製、商品名「レボン２０００」）を加えた。培養開始８時間後から、５０％グリセリンを２ｍｌ／時間の速度で滴下して、１２時間おきに１５ｍｌずつサンプリングを行い、遠心分離を行い上清を回収し、生産したセルラーゼの量は６０時間目に回収したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析してバンドの定量を行い、培養液中のタンパク質濃度はＢＣＡ法（ＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社））により定量を行った。生産したセルラーゼを定量した結果は、比較例６の定量値を１．００とし、実施例１２及び１３の結果は、比較例６の定量値を基準とする相対値で示した。結果を表７にまとめた。
＜実施例１２、実施例１３＞
微生物培養装置中の培養液に培養開始時からラクトアルブミンを加えていたこと以外は、比較例６と同様に行い、比較例６の定量値を基準とする相対値を算出し表７にまとめた。

表２〜６から、本発明の方法を用いた実施例１〜１１は、それぞれ対応する比較例で生産した有用物質の定量値を基準とする相対値が１よりも大きいことから、培養液中のタンパク質濃度を１５ｇ／Ｌ以上に保つことで有用物質の生産量が増大することが分かる。
表７の培養時間が長時間（６０時間）の場合も同様に、本発明の方法を用いた実施例１２及び１３は、培養液中のタンパク質濃度を１５ｇ／Ｌ以上にすることで、比較例６よりも有用物質の生産量が増大することが分かる。さらに、培養液中のタンパク質濃度を１５ｇ／Ｌ以上で長時間保つ方が有用物質の生産量が増大することが分かる。

本発明の有用物質の製造方法は、タンパク質などの有用物質を生産する際に使用できる。タンパク質としては酵素、ホルモンタンパク質、抗体、ワクチン及びペプチド等が挙げられる。また、細菌のペリプラズム画分の抽出試薬としても使用できる。さらに、本発明の方法を用いてプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、グルコースオキシダーゼ等を生産することが可能で、洗剤用途、繊維加工用途、紙加工用途、食品用途、バイオ燃料生産用途、酵素変換用途、飼料用途、化粧品用途、遺伝子工学用途、診断薬用途、医薬品用途などで用いることが可能である。

Claims

下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む有用物質の細胞外分泌生産方法であって、工程（ａ）に要する時間の１０％以上の時間の間、工程（ａ）における培養液中のタンパク質濃度が１５〜５００ｇ／Ｌであり、有用物質がペプチド又はタンパク質であり、有用物質を生産する細菌が大腸菌であり、界面活性剤（Ｂ）が両性界面活性剤（Ｂ１）又はエーテルカルボン酸（Ｂ２−１）及びその塩であるアニオン性界面活性剤（Ｂ２）である有用物質製造方法。
工程（ａ）：有用物質を生産する細菌を培養する培養液と界面活性剤（Ｂ）とを同時に存在させて有用物質を細胞外に分泌させる工程。
工程（ｂ）：細菌と、培養液及び有用物質とを分離する工程。