CN107641628A

CN107641628A - 人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用

Info

Publication number: CN107641628A
Application number: CN201610577111.8A
Authority: CN
Inventors: 朱惠霖; 丁雪峰; 陈令伟; 娄向弟
Original assignee: NANJING NUOYUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING NUOYUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2018-01-30

Abstract

本发明涉及人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用，特别是涉及一种根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用，属于基因工程领域。本发明提供的基因为根据大肠杆菌密码子偏好性对原野生型基因进行优化后的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3‑序列7所示。与优化前的野生型基因序列相比，本发明公开的基因序列可以在大肠杆菌内高效表达，形成高效率全细胞催化体系。

Description

人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用，特别是涉及一种根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成的Arenimonas donghaensisiDSM 18418蛋白编码基因及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

我们发现来源于Arenimonas donghaensis DSM 18148的氨基酸序列为序列表中序列2所示的Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白可以作为一种催化剂用于L-2-哌啶甲酸的合成。将编码其的基因序列克隆到某一菌体中，从而通过这一重组菌体以全细胞催化剂的形式来实现其催化效果。

但是用于其编码的如序列表中序列1所示的野生型基因序列无法满足上述需求。因此，为了更好地实现这一蛋白的催化效果，我们就需要提供一种方式，使其可以在某一菌体中高效表达。

发明内容

首先我们选择大肠杆菌作为用于高效表达Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白的菌体。并通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，采用大肠杆菌偏好性密码子对其进行优化，从而实现大肠杆菌中的高效表达。

具体来说我们利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内。按照设计好的引物合成，得到目标引物后，将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。

利用这一方法，我们获得了如序列表中序列3-序列7所示的5条优化合成的DNA序列。其中基因表达最优选为NYPDc。

具体的：

当引物如下时，所获得的DNA序列为SEQ ID NO.3，命名为NYPDa：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGACCA

2 GGGTAGCAACGATCTGGGTCAGGTCCTGGGTGGTCAGCTGGGTCATGG

3 ACCCAGATCGTTGCTACCCACGGTCTGCCGACCCTGCTGGGTCGTCTG

4 AACGACGGAAGTCAGCTTCCAGGTAGTCAACCAGACGACCCAGCAGGG

5 GAAGCTGACTTCCGTCGTTGGGAAGACTTCGACAAATCTCCGCGTTCT

6 TCGATAACACCACCCGGAGAGTGAGCAGCAGAACGCGGAGATTTGTCG

7 TCCGGGTGGTGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCTGACACCAAAGAATA

8 GGTGACCGTTAACGTATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCAGCAACCG

9 TTTCAAATACGTTAACGGTCACCCGGGTAACACCAAACTGGGTCTGTC

10 GCCAGAACACCGAAAGCAACAACGGTAGACAGACCCAGTTTGGTGTTA

11 TGCTTTCGGTGTTCTGGCTGACGTTGACACCGGTATGCCGACCCTGAT

12 CGCAGAGCGGTGGTCAGGGTCAGTTCAGAGATCAGGGTCGGCATACCG

13 TGACCACCGCTCTGCGTACCGCTGCTACCTCTGTTATGGCTGCTAAAC

14 TGGTACGAGAGTCTTTACGAGCCAGCAGTTTAGCAGCCATAACAGAGG

15 GCTCGTAAAGACTCTCGTACCATGGCTCTGATCGGTAACGGTGCTCAG

16 TGGTGGAAAGCCAGAGCCTGGAATTCAGACTGAGCACCGTTACCGATC

17 GGCTCTGGCTTTCCACCACCTGCTGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTTTA

18 GTCGGTAGCAGCCGGGTCAACGTCGTAAACACGAACTTCCTGGATACC

19 CCCGGCTGCTACCGACAAACTGGTTCGTAACCTGGCTGCTGCTGCTCC

20 CAACACCGGTAGAACGAACAACACGCAGTTCCGGAGCAGCAGCAGCCA

21 TGTTCGTTCTACCGGTGTTGCTCAGGCTGTTCGTGGTGCTGACATCGT

22 GCGTTAGCTTTGTCAGCGGTAACGGTGGTAACGATGTCAGCACCACGA

23 CGCTGACAAAGCTAACGCTGACATCCTGACCCCGGAAATGATCGAACC

24 CACCACCAACAGCGTTCAGGTGCATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGG

25 TGAACGCTGTTGGTGGTGACTGCCCGGGTAAAACCGAACTGGCTACCG

26 AACGAAAACAGAAGCGTTAGCAACAACTTCGGTAGCCAGTTCGGTTTT

27 GCTAACGCTTCTGTTTTCGTTGAATTCGAACCGCAGTCTCGTATCGAA

28 GAGTTAGCCGGCATCTGCTGAACTTCACCTTCGATACGAGACTGCGGT

29 GCAGATGCCGGCTAACTCTCCGGTTACCGAACTGTGGCGTGTTCTGAC

30 CGATGTTACGACGACCAGCAGCCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGTT

31 GCTGGTCGTCGTAACATCGCTGAAGTTACCCTGTTCGACTCTGTTGGT

32 CGCAGAGCAGAGTAGTCTTCCAGAGCGAAACCAACAGAGTCGAACAGG

33 GAAGACTACTCTGCTCTGCGTCTGGTTCGTGACTGCGCTAAAGAAATG

34 GATCAGAGAAGCTTCACGACCCAGACCCATTTCTTTAGCGCAGTCACG

35 GGTCGTGAAGCTTCTCTGATCCCGGCTCTGGCTGACCCGAAAAACCTG

36 GCCTGCGGAGCAGCAGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCAGCC

37 TGCTGCTCCGCAGGCTGCTCGTAAACAGGCTGCTTAATAATAACTCGA

38 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTATTAAGCAGCCTG

当引物如下时，所获得的DNA序列为SEQ ID NO.4，命名为NYPDb：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTATGACTCAACTGAC

2 CAATCTGAGTGAGGTCTTGAGTAGTCAGTTGAGTCATAGTCATATGTA

3 ACTCAAGACCTCACTCAGATTGTTGCTACCCATGGTCTCCCAACCCTG

4 CGCTTCGAGATAGTCAACCAGACGACCGAGCAGGGTTGGGAGACCATG

5 CTGGTTGACTATCTCGAAGCGGACTTCCGCCGTTGGGAAGACTTCGAC

6 GGAGAGTGAGCAGCAGAACGTGGGGACTTGTCGAAGTCTTCCCAACGG

7 GTTCTGCTGCTCACTCTCCAGGCGGTGTTATTGAACTCATGCCGGTTG

8 ATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCCGCAACCGGCATGAGTTCAATAA

9 GACACCAAAGAATACTCTTTCAAATACGTGAACGGTCACCCGGGCAAT

10 AACGCAACAACAGTAGAGAGACCGAGTTTGGTATTGCCCGGGTGACCG

11 TCTCTCTACTGTTGTTGCGTTCGGTGTTCTCGCGGATGTTGACACTGG

12 AGGGTCAGCTCAGAGATGAGAGTTGGCATACCAGTGTCAACATCCGCG

13 CTCATCTCTGAGCTGACCCTGACCACTGCGCTCCGTACCGCTGCGACT

14 TTACGCGCCAGCAGTTTCGCCGCCATAACAGAAGTCGCAGCGGTACGG

15 GAAACTGCTGGCGCGTAAAGACTCTCGTACCATGGCTCTGATCGGTAA

16 AGCGCTTGAAATTCGGACTGCGCACCATTACCGATCAGAGCCATGGTA

17 AGTCCGAATTTCAAGCGCTGGCTTTCCACCACCTGCTGGGTATCCAGG

18 CCGCTGGGTCCACGTCGTACACACGAACTTCCTGGATACCCAGCAGGT

19 GACGTGGACCCAGCGGCGACTGATAAACTGGTTCGTAACCTGGCGGCT

20 TAGAACGAACAACGCGCAGTTCTGGCGCAGCAGCCGCCAGGTTACGAA

21 CTGCGCGTTGTTCGTTCTACCGGTGTTGCTCAAGCGGTGCGTGGCGCT

22 TCGCCTTGTCCGCGGTAACGGTAGTAACGATATCAGCGCCACGCACCG

23 CCGCGGACAAGGCGAACGCTGACATCCTGACCCCGGAAATGATCGAAC

24 ACCACCAACCGCATTCAGGTGCATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGGT

25 CTGAATGCGGTTGGTGGTGATTGTCCGGGTAAAACTGAACTGGCGACC

26 CAAAAACAGACGCATTCGCAACCACTTCGGTCGCCAGTTCAGTTTTAC

27 TGCGAATGCGTCTGTTTTTGTGGAATTTGAACCGCAGTCTCGTATCGA

28 AGTTCGCCGGCATTTGCTGAACTTCACCTTCGATACGAGACTGCGGTT

29 GCAAATGCCGGCGAACTCCCCAGTTACCGAGCTGTGGCGTGTTCTGAC

30 GCGATGTTACGACGACCCGCAGCCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGC

31 GGGTCGTCGTAACATCGCGGAGGTTACCCTCTTTGATTCTGTTGGTTT

32 GCAGCGCGGAATAGTCCTCCAGAGCGAAACCAACAGAATCAAAGAGGG

33 GGACTATTCCGCGCTGCGTCTCGTTCGCGATTGCGCGAAAGAAATGGG

34 TGGAATGAGGGAAGCCTCACGGCCGAGACCCATTTCTTTCGCGCAATC

35 TGAGGCTTCCCTCATTCCAGCTCTGGCGGACCCGAAAAATCTGTTTGG

36 GCAGCTTGTGGAGCCGCAGCGAGTTCACCAAACAGATTTTTCGGGTCC

37 CGGCTCCACAAGCTGCTCGCAAACAGGCGGCGTAATAACTCGAGCACC

38 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTACGCC

当引物如下时，所获得的DNA序列为SEQ ID NO.5，命名为NYPDc：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGAC

2 GTCGCAACGATCTGGGTCAGATCCTGGGTGGTCAGCTGGGTCATGGTC

3 GACCCAGATCGTTGCGACCCACGGTCTGCCGACCCTGCTGGGCCGTCT

4 CAACGACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAGTCAACCAGACGGCCCAGCAGG

5 GCGGACTTCCGTCGTTGGGAAGATTTCGACAAATCTCCGCGTTCTGCG

6 TCAGTTCGATAACGCCACCCGGAGAGTGCGCCGCAGAACGCGGAGATT

7 GGTGGCGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCGGATACCAAAGAATACTCT

8 CCCGGGTGACCGTTAACATATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTATCCGCA

9 TGTTAACGGTCACCCGGGCAACACCAAACTGGGCCTGTCTACCGTTGT

10 GTGTCAACATCCGCCAGAACGCCGAACGCAACAACGGTAGACAGGCCC

11 TTCTGGCGGATGTTGACACCGGTATGCCGACCCTGATCTCTGAACTGA

12 GCCGCGGTACGCAGCGCGGTGGTCAGGGTCAGTTCAGAGATCAGGGTC

13 GCTGCGTACCGCGGCGACCTCTGTTATGGCGGCGAAACTGCTGGCGCG

14 TGCCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTACGCGCCAGCAGTTTCG

15 ATGGCGCTGATCGGCAACGGTGCGCAGTCTGAATTCCAGGCGCTGGCG

16 ACGAACTTCCTGGATACCCAGCAGGTGGTGGAACGCCAGCGCCTGGAA

17 TGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTTTATGACGTTGATCCGGCGGCGACCG

18 CGGCGCCGCCGCCGCCAGGTTACGAACCAGTTTATCGGTCGCCGCCGG

19 GCGGCGGCGCCGGAACTGCGTGTTGTTCGTTCTACCGGTGTTGCGCAG

20 CGGTGGTAACGATGTCCGCACCACGAACCGCCTGCGCAACACCGGTAG

21 CGGACATCGTTACCACCGTTACCGCGGACAAAGCGAACGCGGATATCC

22 CATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGGTCAGGATATCCGCGTTCGCTTT

23 GAAATGATCGAACCGGGTATGCACCTGAACGCGGTTGGTGGCGACTGT

24 ACAACTTCGGTCGCCAGTTCGGTTTTACCCGGACAGTCGCCACCAACC

25 ACTGGCGACCGAAGTTGTTGCGAACGCGTCTGTTTTCGTTGAATTCGA

26 CTTCGCCTTCGATACGAGACTGCGGTTCGAATTCAACGAAAACAGACG

27 GTCTCGTATCGAAGGCGAAGTTCAGCAGATGCCGGCGAACTCTCCGGT

28 CCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGTTCGGTAACCGGAGAGTTCGCCG

29 CGTGTTCTGACCATGCAGGCGGCGGGTCGTCGTAACATCGCGGAAGTT

30 GCGCGAAACCAACAGAATCGAACAGGGTAACTTCCGCGATGTTACGAC

31 GATTCTGTTGGTTTCGCGCTGGAAGACTATTCTGCGCTGCGTCTGGTT

32 CGACCCAGGCCCATTTCTTTCGCACAATCACGAACCAGACGCAGCGCA

33 GAAATGGGCCTGGGTCGTGAAGCGTCTCTGATCCCGGCGCTGGCGGAC

34 GCGCCGCCGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCCGCCAGCGCCG

35 CTGGCGGCGGCGCCGCAGGCGGCGCGTAAACAGGCGGCGTAATAACTC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTACGCCGCCTGT

当引物如下时，所获得的DNA序列为SEQ ID NO.6，命名为NYPDd：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGA

2 AGCAACGATCTGAGTCAGGTCCTGAGTAGTCAGCTGGGTCATGGTCAT

3 ACCTGACTCAGATCGTTGCTACCCACGGTCTGCCGACTCTGCTGGGCC

4 ACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAATCCACCAGACGGCCCAGCAGAGTCGG

5 TGGAAGCGGACTTCCGTCGCTGGGAAGACTTTGACAAATCCCCGCGCT

6 TCGATAACACCACCCGGAGAATGAGCCGCGGAGCGCGGGGATTTGTCA

7 TCCGGGTGGTGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCGGACACCAAAGAATA

8 CGGGTGACCGTTCACGTATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCCGCAAC

9 ACGTGAACGGTCACCCGGGCAACACTAAACTGGGTCTGTCCACCGTGG

10 GTATCCACATCAGCCAGAACGCCAAACGCAACCACGGTGGACAGACCC

11 GTTCTGGCTGATGTGGATACTGGTATGCCGACCCTGATCTCTGAACTG

12 CAGCGGTACGCAGAGCGGTGGTCAGAGTCAGTTCAGAGATCAGGGTCG

13 GCTCTGCGTACCGCTGCTACTTCTGTTATGGCGGCGAAACTGCTGGCT

14 CCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTGCGAGCCAGCAGTTTCGCC

15 CCATGGCGCTGATCGGCAACGGCGCTCAGTCTGAATTTCAGGCTCTGG

16 CCTGGATACCCAGCAGGTGATGAAAAGCCAGAGCCTGAAATTCAGACT

17 ACCTGCTGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTGTACGACGTTGACCCGGCTG

18 AGCCGCCAGGTTGCGAACCAGTTTGTCGGTCGCAGCCGGGTCAACGTC

19 CGCAACCTGGCGGCTGCTGCTCCGGAACTGCGTGTGGTTCGTTCTACC

20 TCCGCACCACGCACAGCCTGAGCCACACCGGTAGAACGAACCACACGC

21 TGTGCGTGGTGCGGATATTGTTACCACTGTTACCGCGGACAAAGCGAA

22 GTTCGATCATTTCCGGGGTCAGGATATCAGCGTTCGCTTTGTCCGCGG

23 ACCCCGGAAATGATCGAACCGGGCATGCACCTGAACGCGGTTGGTGGT

24 CAGTCGCCAGTTCGGTTTTACCCGGACAATCACCACCAACCGCGTTCA

25 AAACCGAACTGGCGACTGAAGTTGTTGCTAACGCGTCCGTGTTTGTTG

26 CACCTTCGATGCGGGACTGCGGTTCAAATTCAACAAACACGGACGCGT

27 GTCCCGCATCGAAGGTGAAGTTCAGCAGATGCCGGCGAACTCCCCGGT

28 GCCTGCATAGTCAGAACACGCCACAGTTCAGTAACCGGGGAGTTCGCC

29 CGTGTTCTGACTATGCAGGCGGCTGGCCGTCGTAACATCGCGGAAGTT

30 GAGCGAAGCCCACAGAATCGAACAGAGTAACTTCCGCGATGTTACGAC

31 GATTCTGTGGGCTTCGCTCTGGAAGATTATTCTGCGCTGCGCCTGGTG

32 CACGACCCAGGCCCATTTCTTTCGCACAGTCGCGCACCAGGCGCAGCG

33 AATGGGCCTGGGTCGTGAAGCGTCCCTGATTCCGGCGCTGGCGGACCC

34 CGGAGCCGCAGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCCGCCAGCGC

35 CTGGCTGCGGCTCCGCAGGCTGCGCGTAAACAGGCTGCTTAATAACTC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAGCAGCCTGTTTACG

当引物如下时，所获得的DNA序列为SEQ ID NO.7，命名为NYPDe：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTATGACCCAACTGACTAC

2 GCAACGATCTGAGTCAGGTCCTGAGTAGTCAGTTGGGTCATAGTCATAT

3 GACCTGACTCAGATCGTTGCGACCCACGGCCTGCCGACCCTGCTGGGCC

4 CGACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAGTCTACCAGACGGCCCAGCAGGGTCG

5 GGAAGCGGACTTCCGTCGTTGGGAAGACTTTGACAAATCTCCGCGTTCT

6 CGATAACGCCACCCGGGGAGTGCGCCGCAGAACGCGGAGATTTGTCAAA

7 CCGGGTGGCGTTATCGAACTGATGCCGGTAGCGGATACCAAGGAATACT

8 CCGGATGACCGTTAACATATTTGAAAGAGTATTCCTTGGTATCCGCTAC

9 AAATATGTTAACGGTCATCCGGGCAACACCAAACTGGGTCTGTCTACCG

10 AACGTCCGCCAGAACACCGAACGCTACTACGGTAGACAGACCCAGTTTG

11 GGTGTTCTGGCGGACGTTGACACTGGTATGCCGACTCTGATTAGCGAGC

12 CCGCGGTACGCAGCGCGGTGGTCAGGGTCAGCTCGCTAATCAGAGTCGG

13 CGCTGCGTACCGCGGCAACCTCTGTAATGGCGGCAAAACTGCTGGCGCG

14 TTGCCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTGCGCGCCAGCAGTTTTG

15 TGGCGCTGATCGGCAACGGTGCGCAATCTGAATTCCAAGCGCTGGCGTT

16 ACACGAACCTCCTGGATACCCAGCAGATGGTGGAACGCCAGCGCTTGGA

17 GGTATCCAGGAGGTTCGTGTTTATGACGTGGACCCGGCAGCGACCGATA

18 CCGGTGCAGCCGCAGCCAGATTACGAACCAGTTTATCGGTCGCTGCCGG

19 TGCGGCTGCACCGGAACTGCGCGTAGTTCGTTCTACTGGCGTGGCTCAG

20 CGGTGGTAACAATGTCCGCACCACGCACAGCCTGAGCCACGCCAGTAGA

21 GCGGACATTGTTACCACCGTTACCGCTGACAAAGCGAACGCAGATATCC

22 CATACCCGGCTCAATCATTTCCGGGGTCAGGATATCTGCGTTCGCTTTG

23 GAAATGATTGAGCCGGGTATGCATCTGAACGCTGTAGGTGGTGACTGCC

24 ACCACTTCAGTTGCCAGCTCGGTTTTACCCGGGCAGTCACCACCTACAG

25 GCTGGCAACTGAAGTGGTTGCTAATGCGTCTGTTTTCGTTGAATTCGAA

26 ACTTCGCCTTCGATACGAGACTGCGGTTCGAATTCAACGAAAACAGACG

27 TCTCGTATCGAAGGCGAAGTTCAGCAAATGCCGGCTAACTCTCCGGTTA

28 CCTGCATGGTCAGTACACGCCACAGCTCAGTAACCGGAGAGTTAGCCGG

29 CGTGTACTGACCATGCAGGCAGCTGGTCGCCGTAACATCGCGGAAGTTA

30 CAGTGCGAAACCTACGCTGTCAAACAGGGTAACTTCCGCGATGTTACGG

31 AGCGTAGGTTTCGCACTGGAAGATTATTCTGCACTGCGCCTGGTGCGCG

32 TGCCTCACGACCCAGGCCCATTTCTTTTGCACAGTCGCGCACCAGGCGC

33 CCTGGGTCGTGAGGCAAGCCTGATCCCGGCACTGGCTGATCCGAAAAAC

34 TGCGGAGCCGCTGCCAGTTCGCCGAACAGGTTTTTCGGATCAGCCAGTG

35 GCAGCGGCTCCGCAGGCTGCTCGCAAACAAGCGGCATAATAACTCGAGC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTATGCCGCT

同时，含有所述DNA分子的重组载体、大肠杆菌均属于本发明的保护范围。其中重组载体既可以是克隆载体，也可以是表达载体。

本发明中还要求保护含有所述DNA分子的大肠杆菌作为全细胞催化剂的用途。特别是作为L-赖氨酸盐酸盐生物转化制备L-2-哌啶甲酸这一反应的全细胞催化剂。采用含有所述DNA分子的大肠杆菌后，形成了一高效率的生物催化体系。可以提高底物L-赖氨酸盐酸盐投量，缩短反应时间，获得高ee值的目标产物。实验证明，通过这一生物催化体系，在48小时目标产物最高累计达到76.9g/L。

附图说明

图1为NYPDc的表达质粒图谱

图2为NYPDa，NYPDb，NYPDc，NYPDd，NYPDe的蛋白表达上清、包涵体SDS-PAGE图谱

图3为生物转化反应的TLC图谱

图4为L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图

图5为L-2-哌啶甲酸的MS谱图

具体实施方式

为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。

以下实施例中涉及到的TLC检测中：

展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。

硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。

显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。

以下实例中涉及到的LC-MS检测条件为：

Prevail C18色谱柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4L/min；进样体积：10μL。

实施例1

将Arenimonas donghaensis DSM 18148置于LB培养基中培养，180rpm培养3-5天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化Arenimonasdonghaensis DSM 18148DNA。

用Pfu高保真酶对Arenimonas donghaensis DSM 18148基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为

NYPD-F 5'ATGACCATGACCCAGCTCACCA 3'

NYPD-R 5'TCAGGCCGCCTGCTTGC 3'

由于Arenimonas donghaensis DSM 18148DNA片段GC含量接近70％，故在扩增时添加终浓度0.5M的甜菜碱。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海生工生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.1，相应的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

实施例2

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGACCA

2 GGGTAGCAACGATCTGGGTCAGGTCCTGGGTGGTCAGCTGGGTCATGG

3 ACCCAGATCGTTGCTACCCACGGTCTGCCGACCCTGCTGGGTCGTCTG

4 AACGACGGAAGTCAGCTTCCAGGTAGTCAACCAGACGACCCAGCAGGG

5 GAAGCTGACTTCCGTCGTTGGGAAGACTTCGACAAATCTCCGCGTTCT

6 TCGATAACACCACCCGGAGAGTGAGCAGCAGAACGCGGAGATTTGTCG

7 TCCGGGTGGTGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCTGACACCAAAGAATA

8 GGTGACCGTTAACGTATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCAGCAACCG

9 TTTCAAATACGTTAACGGTCACCCGGGTAACACCAAACTGGGTCTGTC

10 GCCAGAACACCGAAAGCAACAACGGTAGACAGACCCAGTTTGGTGTTA

11 TGCTTTCGGTGTTCTGGCTGACGTTGACACCGGTATGCCGACCCTGAT

12 CGCAGAGCGGTGGTCAGGGTCAGTTCAGAGATCAGGGTCGGCATACCG

13 TGACCACCGCTCTGCGTACCGCTGCTACCTCTGTTATGGCTGCTAAAC

14 TGGTACGAGAGTCTTTACGAGCCAGCAGTTTAGCAGCCATAACAGAGG

15 GCTCGTAAAGACTCTCGTACCATGGCTCTGATCGGTAACGGTGCTCAG

16 TGGTGGAAAGCCAGAGCCTGGAATTCAGACTGAGCACCGTTACCGATC

17 GGCTCTGGCTTTCCACCACCTGCTGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTTTA

18 GTCGGTAGCAGCCGGGTCAACGTCGTAAACACGAACTTCCTGGATACC

19 CCCGGCTGCTACCGACAAACTGGTTCGTAACCTGGCTGCTGCTGCTCC

20 CAACACCGGTAGAACGAACAACACGCAGTTCCGGAGCAGCAGCAGCCA

21 TGTTCGTTCTACCGGTGTTGCTCAGGCTGTTCGTGGTGCTGACATCGT

22 GCGTTAGCTTTGTCAGCGGTAACGGTGGTAACGATGTCAGCACCACGA

23 CGCTGACAAAGCTAACGCTGACATCCTGACCCCGGAAATGATCGAACC

24 CACCACCAACAGCGTTCAGGTGCATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGG

25 TGAACGCTGTTGGTGGTGACTGCCCGGGTAAAACCGAACTGGCTACCG

26 AACGAAAACAGAAGCGTTAGCAACAACTTCGGTAGCCAGTTCGGTTTT

27 GCTAACGCTTCTGTTTTCGTTGAATTCGAACCGCAGTCTCGTATCGAA

28 GAGTTAGCCGGCATCTGCTGAACTTCACCTTCGATACGAGACTGCGGT

29 GCAGATGCCGGCTAACTCTCCGGTTACCGAACTGTGGCGTGTTCTGAC

30 CGATGTTACGACGACCAGCAGCCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGTT

31 GCTGGTCGTCGTAACATCGCTGAAGTTACCCTGTTCGACTCTGTTGGT

32 CGCAGAGCAGAGTAGTCTTCCAGAGCGAAACCAACAGAGTCGAACAGG

33 GAAGACTACTCTGCTCTGCGTCTGGTTCGTGACTGCGCTAAAGAAATG

34 GATCAGAGAAGCTTCACGACCCAGACCCATTTCTTTAGCGCAGTCACG

35 GGTCGTGAAGCTTCTCTGATCCCGGCTCTGGCTGACCCGAAAAACCTG

36 GCCTGCGGAGCAGCAGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCAGCC

37 TGCTGCTCCGCAGGCTGCTCGTAAACAGGCTGCTTAATAATAACTCGA

38 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTATTAAGCAGCCTG

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.3，命名为NYPDa。

实施例3

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTATGACTCAACTGAC

2 CAATCTGAGTGAGGTCTTGAGTAGTCAGTTGAGTCATAGTCATATGTA

3 ACTCAAGACCTCACTCAGATTGTTGCTACCCATGGTCTCCCAACCCTG

4 CGCTTCGAGATAGTCAACCAGACGACCGAGCAGGGTTGGGAGACCATG

5 CTGGTTGACTATCTCGAAGCGGACTTCCGCCGTTGGGAAGACTTCGAC

6 GGAGAGTGAGCAGCAGAACGTGGGGACTTGTCGAAGTCTTCCCAACGG

7 GTTCTGCTGCTCACTCTCCAGGCGGTGTTATTGAACTCATGCCGGTTG

8 ATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCCGCAACCGGCATGAGTTCAATAA

9 GACACCAAAGAATACTCTTTCAAATACGTGAACGGTCACCCGGGCAAT

10 AACGCAACAACAGTAGAGAGACCGAGTTTGGTATTGCCCGGGTGACCG

11 TCTCTCTACTGTTGTTGCGTTCGGTGTTCTCGCGGATGTTGACACTGG

12 AGGGTCAGCTCAGAGATGAGAGTTGGCATACCAGTGTCAACATCCGCG

13 CTCATCTCTGAGCTGACCCTGACCACTGCGCTCCGTACCGCTGCGACT

14 TTACGCGCCAGCAGTTTCGCCGCCATAACAGAAGTCGCAGCGGTACGG

15 GAAACTGCTGGCGCGTAAAGACTCTCGTACCATGGCTCTGATCGGTAA

16 AGCGCTTGAAATTCGGACTGCGCACCATTACCGATCAGAGCCATGGTA

17 AGTCCGAATTTCAAGCGCTGGCTTTCCACCACCTGCTGGGTATCCAGG

18 CCGCTGGGTCCACGTCGTACACACGAACTTCCTGGATACCCAGCAGGT

19 GACGTGGACCCAGCGGCGACTGATAAACTGGTTCGTAACCTGGCGGCT

20 TAGAACGAACAACGCGCAGTTCTGGCGCAGCAGCCGCCAGGTTACGAA

21 CTGCGCGTTGTTCGTTCTACCGGTGTTGCTCAAGCGGTGCGTGGCGCT

22 TCGCCTTGTCCGCGGTAACGGTAGTAACGATATCAGCGCCACGCACCG

23 CCGCGGACAAGGCGAACGCTGACATCCTGACCCCGGAAATGATCGAAC

24 ACCACCAACCGCATTCAGGTGCATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGGT

25 CTGAATGCGGTTGGTGGTGATTGTCCGGGTAAAACTGAACTGGCGACC

26 CAAAAACAGACGCATTCGCAACCACTTCGGTCGCCAGTTCAGTTTTAC

27 TGCGAATGCGTCTGTTTTTGTGGAATTTGAACCGCAGTCTCGTATCGA

28 AGTTCGCCGGCATTTGCTGAACTTCACCTTCGATACGAGACTGCGGTT

29 GCAAATGCCGGCGAACTCCCCAGTTACCGAGCTGTGGCGTGTTCTGAC

30 GCGATGTTACGACGACCCGCAGCCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGC

31 GGGTCGTCGTAACATCGCGGAGGTTACCCTCTTTGATTCTGTTGGTTT

32 GCAGCGCGGAATAGTCCTCCAGAGCGAAACCAACAGAATCAAAGAGGG

33 GGACTATTCCGCGCTGCGTCTCGTTCGCGATTGCGCGAAAGAAATGGG

34 TGGAATGAGGGAAGCCTCACGGCCGAGACCCATTTCTTTCGCGCAATC

35 TGAGGCTTCCCTCATTCCAGCTCTGGCGGACCCGAAAAATCTGTTTGG

36 GCAGCTTGTGGAGCCGCAGCGAGTTCACCAAACAGATTTTTCGGGTCC

37 CGGCTCCACAAGCTGCTCGCAAACAGGCGGCGTAATAACTCGAGCACC

38 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTACGCC

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.4，命名为NYPDb。

实施例4

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGAC

2 GTCGCAACGATCTGGGTCAGATCCTGGGTGGTCAGCTGGGTCATGGTC

3 GACCCAGATCGTTGCGACCCACGGTCTGCCGACCCTGCTGGGCCGTCT

4 CAACGACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAGTCAACCAGACGGCCCAGCAGG

5 GCGGACTTCCGTCGTTGGGAAGATTTCGACAAATCTCCGCGTTCTGCG

6 TCAGTTCGATAACGCCACCCGGAGAGTGCGCCGCAGAACGCGGAGATT

7 GGTGGCGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCGGATACCAAAGAATACTCT

8 CCCGGGTGACCGTTAACATATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTATCCGCA

9 TGTTAACGGTCACCCGGGCAACACCAAACTGGGCCTGTCTACCGTTGT

10 GTGTCAACATCCGCCAGAACGCCGAACGCAACAACGGTAGACAGGCCC

11 TTCTGGCGGATGTTGACACCGGTATGCCGACCCTGATCTCTGAACTGA

12 GCCGCGGTACGCAGCGCGGTGGTCAGGGTCAGTTCAGAGATCAGGGTC

13 GCTGCGTACCGCGGCGACCTCTGTTATGGCGGCGAAACTGCTGGCGCG

14 TGCCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTACGCGCCAGCAGTTTCG

15 ATGGCGCTGATCGGCAACGGTGCGCAGTCTGAATTCCAGGCGCTGGCG

16 ACGAACTTCCTGGATACCCAGCAGGTGGTGGAACGCCAGCGCCTGGAA

17 TGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTTTATGACGTTGATCCGGCGGCGACCG

18 CGGCGCCGCCGCCGCCAGGTTACGAACCAGTTTATCGGTCGCCGCCGG

19 GCGGCGGCGCCGGAACTGCGTGTTGTTCGTTCTACCGGTGTTGCGCAG

20 CGGTGGTAACGATGTCCGCACCACGAACCGCCTGCGCAACACCGGTAG

21 CGGACATCGTTACCACCGTTACCGCGGACAAAGCGAACGCGGATATCC

22 CATACCCGGTTCGATCATTTCCGGGGTCAGGATATCCGCGTTCGCTTT

23 GAAATGATCGAACCGGGTATGCACCTGAACGCGGTTGGTGGCGACTGT

24 ACAACTTCGGTCGCCAGTTCGGTTTTACCCGGACAGTCGCCACCAACC

25 ACTGGCGACCGAAGTTGTTGCGAACGCGTCTGTTTTCGTTGAATTCGA

26 CTTCGCCTTCGATACGAGACTGCGGTTCGAATTCAACGAAAACAGACG

27 GTCTCGTATCGAAGGCGAAGTTCAGCAGATGCCGGCGAACTCTCCGGT

28 CCTGCATGGTCAGAACACGCCACAGTTCGGTAACCGGAGAGTTCGCCG

29 CGTGTTCTGACCATGCAGGCGGCGGGTCGTCGTAACATCGCGGAAGTT

30 GCGCGAAACCAACAGAATCGAACAGGGTAACTTCCGCGATGTTACGAC

31 GATTCTGTTGGTTTCGCGCTGGAAGACTATTCTGCGCTGCGTCTGGTT

32 CGACCCAGGCCCATTTCTTTCGCACAATCACGAACCAGACGCAGCGCA

33 GAAATGGGCCTGGGTCGTGAAGCGTCTCTGATCCCGGCGCTGGCGGAC

34 GCGCCGCCGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCCGCCAGCGCCG

35 CTGGCGGCGGCGCCGCAGGCGGCGCGTAAACAGGCGGCGTAATAACTC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTACGCCGCCTGT

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.5，命名为NYPDc。

实施例5

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGA

2 AGCAACGATCTGAGTCAGGTCCTGAGTAGTCAGCTGGGTCATGGTCAT

3 ACCTGACTCAGATCGTTGCTACCCACGGTCTGCCGACTCTGCTGGGCC

4 ACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAATCCACCAGACGGCCCAGCAGAGTCGG

5 TGGAAGCGGACTTCCGTCGCTGGGAAGACTTTGACAAATCCCCGCGCT

6 TCGATAACACCACCCGGAGAATGAGCCGCGGAGCGCGGGGATTTGTCA

7 TCCGGGTGGTGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCGGACACCAAAGAATA

8 CGGGTGACCGTTCACGTATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCCGCAAC

9 ACGTGAACGGTCACCCGGGCAACACTAAACTGGGTCTGTCCACCGTGG

10 GTATCCACATCAGCCAGAACGCCAAACGCAACCACGGTGGACAGACCC

11 GTTCTGGCTGATGTGGATACTGGTATGCCGACCCTGATCTCTGAACTG

12 CAGCGGTACGCAGAGCGGTGGTCAGAGTCAGTTCAGAGATCAGGGTCG

13 GCTCTGCGTACCGCTGCTACTTCTGTTATGGCGGCGAAACTGCTGGCT

14 CCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTGCGAGCCAGCAGTTTCGCC

15 CCATGGCGCTGATCGGCAACGGCGCTCAGTCTGAATTTCAGGCTCTGG

16 CCTGGATACCCAGCAGGTGATGAAAAGCCAGAGCCTGAAATTCAGACT

17 ACCTGCTGGGTATCCAGGAAGTTCGTGTGTACGACGTTGACCCGGCTG

18 AGCCGCCAGGTTGCGAACCAGTTTGTCGGTCGCAGCCGGGTCAACGTC

19 CGCAACCTGGCGGCTGCTGCTCCGGAACTGCGTGTGGTTCGTTCTACC

20 TCCGCACCACGCACAGCCTGAGCCACACCGGTAGAACGAACCACACGC

21 TGTGCGTGGTGCGGATATTGTTACCACTGTTACCGCGGACAAAGCGAA

22 GTTCGATCATTTCCGGGGTCAGGATATCAGCGTTCGCTTTGTCCGCGG

23 ACCCCGGAAATGATCGAACCGGGCATGCACCTGAACGCGGTTGGTGGT

24 CAGTCGCCAGTTCGGTTTTACCCGGACAATCACCACCAACCGCGTTCA

25 AAACCGAACTGGCGACTGAAGTTGTTGCTAACGCGTCCGTGTTTGTTG

26 CACCTTCGATGCGGGACTGCGGTTCAAATTCAACAAACACGGACGCGT

27 GTCCCGCATCGAAGGTGAAGTTCAGCAGATGCCGGCGAACTCCCCGGT

28 GCCTGCATAGTCAGAACACGCCACAGTTCAGTAACCGGGGAGTTCGCC

29 CGTGTTCTGACTATGCAGGCGGCTGGCCGTCGTAACATCGCGGAAGTT

30 GAGCGAAGCCCACAGAATCGAACAGAGTAACTTCCGCGATGTTACGAC

31 GATTCTGTGGGCTTCGCTCTGGAAGATTATTCTGCGCTGCGCCTGGTG

32 CACGACCCAGGCCCATTTCTTTCGCACAGTCGCGCACCAGGCGCAGCG

33 AATGGGCCTGGGTCGTGAAGCGTCCCTGATTCCGGCGCTGGCGGACCC

34 CGGAGCCGCAGCCAGTTCACCGAACAGGTTTTTCGGGTCCGCCAGCGC

35 CTGGCTGCGGCTCCGCAGGCTGCGCGTAAACAGGCTGCTTAATAACTC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAGCAGCCTGTTTACG

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.6，命名为NYPDd。

实施例6

1 TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTATGACCCAACTGACTAC

2 GCAACGATCTGAGTCAGGTCCTGAGTAGTCAGTTGGGTCATAGTCATAT

3 GACCTGACTCAGATCGTTGCGACCCACGGCCTGCCGACCCTGCTGGGCC

4 CGACGGAAGTCCGCTTCCAGGTAGTCTACCAGACGGCCCAGCAGGGTCG

5 GGAAGCGGACTTCCGTCGTTGGGAAGACTTTGACAAATCTCCGCGTTCT

6 CGATAACGCCACCCGGGGAGTGCGCCGCAGAACGCGGAGATTTGTCAAA

7 CCGGGTGGCGTTATCGAACTGATGCCGGTAGCGGATACCAAGGAATACT

8 CCGGATGACCGTTAACATATTTGAAAGAGTATTCCTTGGTATCCGCTAC

9 AAATATGTTAACGGTCATCCGGGCAACACCAAACTGGGTCTGTCTACCG

10 AACGTCCGCCAGAACACCGAACGCTACTACGGTAGACAGACCCAGTTTG

11 GGTGTTCTGGCGGACGTTGACACTGGTATGCCGACTCTGATTAGCGAGC

12 CCGCGGTACGCAGCGCGGTGGTCAGGGTCAGCTCGCTAATCAGAGTCGG

13 CGCTGCGTACCGCGGCAACCTCTGTAATGGCGGCAAAACTGCTGGCGCG

14 TTGCCGATCAGCGCCATGGTACGAGAGTCTTTGCGCGCCAGCAGTTTTG

15 TGGCGCTGATCGGCAACGGTGCGCAATCTGAATTCCAAGCGCTGGCGTT

16 ACACGAACCTCCTGGATACCCAGCAGATGGTGGAACGCCAGCGCTTGGA

17 GGTATCCAGGAGGTTCGTGTTTATGACGTGGACCCGGCAGCGACCGATA

18 CCGGTGCAGCCGCAGCCAGATTACGAACCAGTTTATCGGTCGCTGCCGG

19 TGCGGCTGCACCGGAACTGCGCGTAGTTCGTTCTACTGGCGTGGCTCAG

20 CGGTGGTAACAATGTCCGCACCACGCACAGCCTGAGCCACGCCAGTAGA

21 GCGGACATTGTTACCACCGTTACCGCTGACAAAGCGAACGCAGATATCC

22 CATACCCGGCTCAATCATTTCCGGGGTCAGGATATCTGCGTTCGCTTTG

23 GAAATGATTGAGCCGGGTATGCATCTGAACGCTGTAGGTGGTGACTGCC

24 ACCACTTCAGTTGCCAGCTCGGTTTTACCCGGGCAGTCACCACCTACAG

25 GCTGGCAACTGAAGTGGTTGCTAATGCGTCTGTTTTCGTTGAATTCGAA

26 ACTTCGCCTTCGATACGAGACTGCGGTTCGAATTCAACGAAAACAGACG

27 TCTCGTATCGAAGGCGAAGTTCAGCAAATGCCGGCTAACTCTCCGGTTA

28 CCTGCATGGTCAGTACACGCCACAGCTCAGTAACCGGAGAGTTAGCCGG

29 CGTGTACTGACCATGCAGGCAGCTGGTCGCCGTAACATCGCGGAAGTTA

30 CAGTGCGAAACCTACGCTGTCAAACAGGGTAACTTCCGCGATGTTACGG

31 AGCGTAGGTTTCGCACTGGAAGATTATTCTGCACTGCGCCTGGTGCGCG

32 TGCCTCACGACCCAGGCCCATTTCTTTTGCACAGTCGCGCACCAGGCGC

33 CCTGGGTCGTGAGGCAAGCCTGATCCCGGCACTGGCTGATCCGAAAAAC

34 TGCGGAGCCGCTGCCAGTTCGCCGAACAGGTTTTTCGGATCAGCCAGTG

35 GCAGCGGCTCCGCAGGCTGCTCGCAAACAAGCGGCATAATAACTCGAGC

36 TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTATGCCGCT

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增： 98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQID NO.7，命名为NYPDe。

实施例7

挑取含有NYPDa表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

按照上述方法，分别制备NYPDb，NYPDc，NYPDd，NYPDe的菌体并进行SDS-PAGE蛋白胶检测，结果见图2。SDS-PAGE蛋白胶显示，其中NYPDc的表达量最高，故做为优选序列进行后续实验。

实施例8

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，150g/L NYPDc菌体，25g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图3，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图4，图5所示。

实施例9

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，74g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应48小时时，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到37g/L。。

实施例10

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，100g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应 48小时时，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到66.7g/L。。

实施例11

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，150g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应48小时时，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到76.9g/L。

当我们在体系中加入L-赖氨酸的时候，其快速转变为L-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京诺云生物科技有限公司

<120> 人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白编码基因及其应用

<130> 2016

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Arenimonas donghaensis

<400> 1

atgaccatga cccagctcac cacccaggac ctgacccaga tcgtcgcgac ccacggcctg 60

ccgaccctgc tcggccgcct ggtggactac ctggaggccg acttccggcg ctgggaggac 120

ttcgacaaga gcccgcgttc ggcggcccac tccccgggcg gcgtgatcga actgatgccg 180

gtcgccgata ccaaggaata cagcttcaag tacgtcaacg gccacccggg caacaccaag 240

ctgggcctgt ccaccgtggt ggccttcggc gtgctcgccg acgtcgatac cggcatgccg 300

accctgatca gcgaactgac cctgaccacc gcgctgcgca ccgccgccac ctcggtgatg 360

gcggccaagc tgctggcgcg caaggattcc aggaccatgg cgctgatcgg caacggcgcc 420

cagagcgagt tccaggcgct ggccttccac cacctgctgg gcatccagga agtgcgtgtg 480

tacgacgtcg acccggccgc caccgacaag ctggtgcgca acctggccgc ggccgcgccg 540

gaactgcgcg tggtgcgcag caccggcgtc gcccaggccg tgcgcggcgc cgacatcgtc 600

accaccgtca ccgcggacaa ggccaatgcc gacatcctga cgccggaaat gatcgagccg 660

ggcatgcacc tcaacgccgt cggcggcgac tgcccgggca agaccgaact ggccacggag 720

gtggtcgcca acgcctcggt gttcgtcgag ttcgagccgc agtcgcgcat cgaaggcgag 780

gtgcagcaga tgcccgccaa ctccccggtc accgaactgt ggcgcgtgct gaccatgcag 840

gccgccggcc gccgcaacat cgccgaggtc accctgttcg actcggtcgg tttcgcgctg 900

gaggattatt cggcgctgcg cctggtgcgc gattgcgcca aggaaatggg cctgggccgc 960

gaagccagcc tcatccccgc cctggccgac ccgaagaacc tgttcggcga gctggccgcg 1020

gcaccccagg ccgcgcgcaa gcaggcggcc tga 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> Arenimonas donghaensis

<400> 2

Met Thr Met Thr Gln Leu Thr Thr Gln Asp Leu Thr Gln Ile Val Ala

1 5 10 15

Thr His Gly Leu Pro Thr Leu Leu Gly Arg Leu Val Asp Tyr Leu Glu

20 25 30

Ala Asp Phe Arg Arg Trp Glu Asp Phe Asp Lys Ser Pro Arg Ser Ala

35 40 45

Ala His Ser Pro Gly Gly Val Ile Glu Leu Met Pro Val Ala Asp Thr

50 55 60

Lys Glu Tyr Ser Phe Lys Tyr Val Asn Gly His Pro Gly Asn Thr Lys

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ser Thr Val Val Ala Phe Gly Val Leu Ala Asp Val Asp

85 90 95

Thr Gly Met Pro Thr Leu Ile Ser Glu Leu Thr Leu Thr Thr Ala Leu

100 105 110

Arg Thr Ala Ala Thr Ser Val Met Ala Ala Lys Leu Leu Ala Arg Lys

115 120 125

Asp Ser Arg Thr Met Ala Leu Ile Gly Asn Gly Ala Gln Ser Glu Phe

130 135 140

Gln Ala Leu Ala Phe His His Leu Leu Gly Ile Gln Glu Val Arg Val

145 150 155 160

Tyr Asp Val Asp Pro Ala Ala Thr Asp Lys Leu Val Arg Asn Leu Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Pro Glu Leu Arg Val Val Arg Ser Thr Gly Val Ala Gln

180 185 190

Ala Val Arg Gly Ala Asp Ile Val Thr Thr Val Thr Ala Asp Lys Ala

195 200 205

Asn Ala Asp Ile Leu Thr Pro Glu Met Ile Glu Pro Gly Met His Leu

210 215 220

Asn Ala Val Gly Gly Asp Cys Pro Gly Lys Thr Glu Leu Ala Thr Glu

225 230 235 240

Val Val Ala Asn Ala Ser Val Phe Val Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg

245 250 255

Ile Glu Gly Glu Val Gln Gln Met Pro Ala Asn Ser Pro Val Thr Glu

260 265 270

Leu Trp Arg Val Leu Thr Met Gln Ala Ala Gly Arg Arg Asn Ile Ala

275 280 285

Glu Val Thr Leu Phe Asp Ser Val Gly Phe Ala Leu Glu Asp Tyr Ser

290 295 300

Ala Leu Arg Leu Val Arg Asp Cys Ala Lys Glu Met Gly Leu Gly Arg

305 310 315 320

Glu Ala Ser Leu Ile Pro Ala Leu Ala Asp Pro Lys Asn Leu Phe Gly

325 330 335

Glu Leu Ala Ala Ala Pro Gln Ala Ala Arg Lys Gln Ala Ala

340 345 350

<210> 3

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccatga cccagctgac cacccaggac ctgacccaga tcgttgctac ccacggtctg 60

ccgaccctgc tgggtcgtct ggttgactac ctggaagctg acttccgtcg ttgggaagac 120

ttcgacaaat ctccgcgttc tgctgctcac tctccgggtg gtgttatcga actgatgccg 180

gttgctgaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgttaacg gtcacccggg taacaccaaa 240

ctgggtctgt ctaccgttgt tgctttcggt gttctggctg acgttgacac cggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac cctgaccacc gctctgcgta ccgctgctac ctctgttatg 360

gctgctaaac tgctggctcg taaagactct cgtaccatgg ctctgatcgg taacggtgct 420

cagtctgaat tccaggctct ggctttccac cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtt 480

tacgacgttg acccggctgc taccgacaaa ctggttcgta acctggctgc tgctgctccg 540

gaactgcgtg ttgttcgttc taccggtgtt gctcaggctg ttcgtggtgc tgacatcgtt 600

accaccgtta ccgctgacaa agctaacgct gacatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggtatgcacc tgaacgctgt tggtggtgac tgcccgggta aaaccgaact ggctaccgaa 720

gttgttgcta acgcttctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggtgaa 780

gttcagcaga tgccggctaa ctctccggtt accgaactgt ggcgtgttct gaccatgcag 840

gctgctggtc gtcgtaacat cgctgaagtt accctgttcg actctgttgg tttcgctctg 900

gaagactact ctgctctgcg tctggttcgt gactgcgcta aagaaatggg tctgggtcgt 960

gaagcttctc tgatcccggc tctggctgac ccgaaaaacc tgttcggtga actggctgct 1020

gctccgcagg ctgctcgtaa acaggctgct taa 1053

<210> 4

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgactatga ctcaactgac tactcaagac ctcactcaga ttgttgctac ccatggtctc 60

ccaaccctgc tcggtcgtct ggttgactat ctcgaagcgg acttccgccg ttgggaagac 120

ttcgacaagt ccccacgttc tgctgctcac tctccaggcg gtgttattga actcatgccg 180

gttgcggaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgtgaacg gtcacccggg caataccaaa 240

ctcggtctct ctactgttgt tgcgttcggt gttctcgcgg atgttgacac tggtatgcca 300

actctcatct ctgagctgac cctgaccact gcgctccgta ccgctgcgac ttctgttatg 360

gcggcgaaac tgctggcgcg taaagactct cgtaccatgg ctctgatcgg taatggtgcg 420

cagtccgaat ttcaagcgct ggctttccac cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtg 480

tacgacgtgg acccagcggc gactgataaa ctggttcgta acctggcggc tgctgcgcca 540

gaactgcgcg ttgttcgttc taccggtgtt gctcaagcgg tgcgtggcgc tgatatcgtt 600

actaccgtta ccgcggacaa ggcgaacgct gacatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggtatgcacc tgaatgcggt tggtggtgat tgtccgggta aaactgaact ggcgaccgaa 720

gtggttgcga atgcgtctgt ttttgtggaa tttgaaccgc agtctcgtat cgaaggtgaa 780

gttcagcaaa tgccggcgaa ctccccagtt accgagctgt ggcgtgttct gaccatgcag 840

gctgcgggtc gtcgtaacat cgcggaggtt accctctttg attctgttgg tttcgctctg 900

gaggactatt ccgcgctgcg tctcgttcgc gattgcgcga aagaaatggg tctcggccgt 960

gaggcttccc tcattccagc tctggcggac ccgaaaaatc tgtttggtga actcgctgcg 1020

gctccacaag ctgctcgcaa acaggcggcg taa 1053

<210> 5

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaccatga cccagctgac cacccaggat ctgacccaga tcgttgcgac ccacggtctg 60

ccgaccctgc tgggccgtct ggttgactac ctggaagcgg acttccgtcg ttgggaagat 120

ttcgacaaat ctccgcgttc tgcggcgcac tctccgggtg gcgttatcga actgatgccg 180

gttgcggata ccaaagaata ctctttcaaa tatgttaacg gtcacccggg caacaccaaa 240

ctgggcctgt ctaccgttgt tgcgttcggc gttctggcgg atgttgacac cggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac cctgaccacc gcgctgcgta ccgcggcgac ctctgttatg 360

gcggcgaaac tgctggcgcg taaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggtgcg 420

cagtctgaat tccaggcgct ggcgttccac cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtt 480

tatgacgttg atccggcggc gaccgataaa ctggttcgta acctggcggc ggcggcgccg 540

gaactgcgtg ttgttcgttc taccggtgtt gcgcaggcgg ttcgtggtgc ggacatcgtt 600

accaccgtta ccgcggacaa agcgaacgcg gatatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggtatgcacc tgaacgcggt tggtggcgac tgtccgggta aaaccgaact ggcgaccgaa 720

gttgttgcga acgcgtctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggcgaa 780

gttcagcaga tgccggcgaa ctctccggtt accgaactgt ggcgtgttct gaccatgcag 840

gcggcgggtc gtcgtaacat cgcggaagtt accctgttcg attctgttgg tttcgcgctg 900

gaagactatt ctgcgctgcg tctggttcgt gattgtgcga aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaagcgtctc tgatcccggc gctggcggac ccgaaaaacc tgttcggtga actggcggcg 1020

gcgccgcagg cggcgcgtaa acaggcggcg taa 1053

<210> 6

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaccatga cccagctgac tactcaggac ctgactcaga tcgttgctac ccacggtctg 60

ccgactctgc tgggccgtct ggtggattac ctggaagcgg acttccgtcg ctgggaagac 120

tttgacaaat ccccgcgctc cgcggctcat tctccgggtg gtgttatcga actgatgccg 180

gttgcggaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgtgaacg gtcacccggg caacactaaa 240

ctgggtctgt ccaccgtggt tgcgtttggc gttctggctg atgtggatac tggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac tctgaccacc gctctgcgta ccgctgctac ttctgttatg 360

gcggcgaaac tgctggctcg caaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggcgct 420

cagtctgaat ttcaggctct ggcttttcat cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtg 480

tacgacgttg acccggctgc gaccgacaaa ctggttcgca acctggcggc tgctgctccg 540

gaactgcgtg tggttcgttc taccggtgtg gctcaggctg tgcgtggtgc ggatattgtt 600

accactgtta ccgcggacaa agcgaacgct gatatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggcatgcacc tgaacgcggt tggtggtgat tgtccgggta aaaccgaact ggcgactgaa 720

gttgttgcta acgcgtccgt gtttgttgaa tttgaaccgc agtcccgcat cgaaggtgaa 780

gttcagcaga tgccggcgaa ctccccggtt actgaactgt ggcgtgttct gactatgcag 840

gcggctggcc gtcgtaacat cgcggaagtt actctgttcg attctgtggg cttcgctctg 900

gaagattatt ctgcgctgcg cctggtgcgc gactgtgcga aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaagcgtccc tgattccggc gctggcggac ccgaaaaacc tgttcggtga actggctgcg 1020

gctccgcagg ctgcgcgtaa acaggctgct taa 1053

<210> 7

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgactatga cccaactgac tactcaggac ctgactcaga tcgttgcgac ccacggcctg 60

ccgaccctgc tgggccgtct ggtagactac ctggaagcgg acttccgtcg ttgggaagac 120

tttgacaaat ctccgcgttc tgcggcgcac tccccgggtg gcgttatcga actgatgccg 180

gtagcggata ccaaggaata ctctttcaaa tatgttaacg gtcatccggg caacaccaaa 240

ctgggtctgt ctaccgtagt agcgttcggt gttctggcgg acgttgacac tggtatgccg 300

actctgatta gcgagctgac cctgaccacc gcgctgcgta ccgcggcaac ctctgtaatg 360

gcggcaaaac tgctggcgcg caaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggtgcg 420

caatctgaat tccaagcgct ggcgttccac catctgctgg gtatccagga ggttcgtgtt 480

tatgacgtgg acccggcagc gaccgataaa ctggttcgta atctggctgc ggctgcaccg 540

gaactgcgcg tagttcgttc tactggcgtg gctcaggctg tgcgtggtgc ggacattgtt 600

accaccgtta ccgctgacaa agcgaacgca gatatcctga ccccggaaat gattgagccg 660

ggtatgcatc tgaacgctgt aggtggtgac tgcccgggta aaaccgagct ggcaactgaa 720

gtggttgcta atgcgtctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggcgaa 780

gttcagcaaa tgccggctaa ctctccggtt actgagctgt ggcgtgtact gaccatgcag 840

gcagctggtc gccgtaacat cgcggaagtt accctgtttg acagcgtagg tttcgcactg 900

gaagattatt ctgcactgcg cctggtgcgc gactgtgcaa aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaggcaagcc tgatcccggc actggctgat ccgaaaaacc tgttcggcga actggcagcg 1020

gctccgcagg ctgctcgcaa acaagcggca taa 1053

Claims

1.DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列3所示的DNA分子。

2. DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列4所示的DNA分子。

3. DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列5所示的DNA分子。

4. DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列6所示的DNA分子。

5. DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列7所示的DNA分子。

6.含有权利要求1至5中任意一项所述DNA分子的重组载体。

7.含有权利要求1至5中任意一项所述DNA分子的大肠杆菌。

8.权利要求7所述的大肠杆菌作为制备L-2-哌啶甲酸全细胞催化剂的应用。