KR20060024437A

KR20060024437A - 피드백 내성 아세토하이드록시산 합성효소 돌연변이체

Info

Publication number: KR20060024437A
Application number: KR1020057024680A
Authority: KR
Inventors: 미로슬라프 파텍; 베로니카 엘리사코바
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-08
Publication date: 2006-03-16
Also published as: ZA200510448B; DE602004024394D1; CN100523197C; CN1813065A; EP1636366B1; WO2005003357A1; US7585959B2; JP2007506407A; EP1636366A1; EP1491634A1; ATE450611T1; RU2325439C2; RU2006102024A; US20070292914A1; BRPI0411975A; US20100086966A1

Abstract

본 발명은 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxy acid synthetase(AHAS)) 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 돌연변이화된 효소 자체, 및 변형된 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS)를 코딩하는 유전자가 발현되는 특정 숙주에서 이들 효소를 이용하여 분지쇄 아미노산을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

아세토하이드록시산 합성효소, 돌연변이체, 아미노산, 발효

Description

피드백 내성 아세토하이드록시산 합성효소 돌연변이체{FEEDBACK RESISTANT ACETOHYDROXY ACID SYNTHETASE MUTANTS}

본 발명은 특정 핵산과 이들 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 및 그들의 적용에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 발효에 의한 분지쇄 아미노산의 생산을 향상시키는 작용을 한다.

특히, 본 발명은 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxy acid synthetase(AHAS)) 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 돌연변이화된 효소 자체, 및 변형된 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS)를 코딩하는 유전자가 발현되는 특정 숙주에서 이들 효소를 이용하여 분지쇄 아미노산을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

아미노산이 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의해 생산될 수 있다는 것이 알려져 있다. 그들의 큰 중요성으로 인해, 생산 방법을 개량하기 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 방법의 개량은 발효 기술에 관한 척도, 예를 들어 교반과 산소 공급이나, 예를 들어 발효 중 당 농도와 같은 영양 배지의 조성이나, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 산물의 후처리나, 미생물 자체의 내재적 행동 특성에 관한 것일 수 있다.

이들 미생물의 행동 특성은 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선별의 방법을 이용하여 개량된다. 이 방식으로, 예를 들어 이소류신 유사체인 이소류신 하이드록사메이트(Kisumi M, Komatsubara S, Sugiura, M, Chibata I(1972) Journal of Bacteriology 110: 761-763), 발린 유사체인 2-티아졸알라닌(Tsuchida T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H(1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319-1322) 또는 류신 유사체인 α-아미노부티레이트(Ambe-Ono Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nakamori S(1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60: 1386-1387)와 같은 항대사물에 대해 내성이거나, 또는 조절상 중요한 대사물에 대해 영양요구성이고, 예를 들어 분지쇄 아미노산을 생산하는(Tsuchida T, Yoshinaga F, Kubota K, Momose H, Okumura S(1975) Agricultural and Biological Chemistry; Nakayama K, Kitada S, Kinoshita S(1961) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 52-69; Nakayama K, Kitada S, Sato Z, Kinoshita(1961) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 41-51) 균주가 수득된다.

몇년 동안, 재조합 DNA 기술의 방법이 또한 분지쇄 아미노산에 대한 개개 생합성 유전자를 증폭하고 그들의 생산에 대한 영향을 조사함으로써 분지쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주의 균주 개량을 위해 사용되었다. 이 주제에 대한 고찰 논문은 특히 문헌 [Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142], [Hilliger, BioTec 2, 40-44(1991)], [Eggeling, Amino Acids 6: 261-272(1994)], [Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995)], [Sahm 등, Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)], 및 [Eggeling 등, Journal of Biotechnology 56: 168-180(1997)]에서 찾아볼 수 있다.

특히, 분지쇄 아미노산인 L-이소류신, L-발린 및 L-류신은 제약 산업, 인간 의약 및 동물 영양에서 사용된다. 박테리아에서 3가지 모든 아미노산 합성의 핵심적 효소 중 하나가 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS)이다. 이 효소는 3가지 아미노산의 전구체를 생성시키는 2가지 반응을 촉매한다.

발린과 류신 생합성 경로에서, AHAS에 대한 기질은 피루베이트이다. AHAS는 피루베이트의 탈카르복실화, 및 피루베이트의 제2 피루베이트 분자와의 축합을 촉매하며 아세토락테이트를 생산한다. 이소류신 경로에서, AHAS는 피루베이트와 2-케토부티레이트의 반응을 촉매하며 아세토하이드록시 부티레이트를 생산한다. 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주에는 AHAS 동위효소(isoenzyme)가 3가지나 존재한다. 동위효소의 활성은 아미노산의 조합에 의해 저해되며, 발린에 의한 저해가 가장 강력하다(De Felice, M., Levinthal, M., Iaccarino, M., Guardiola, J., 1979. Growth inhibition as a consequence of antagonism between related amino acids: effect of valine in Escherichia coli K12. Microbiol Rev 43, 4258). 유전자 ilvBN에 의해 코딩되는 AHAS Ⅰ은 발린과 이소류신에 의해 저해되고, ilvGM에 의해 코딩되는 AHAS Ⅱ는 발린 내성이며, ilvIH에 의해 코딩되는 AHAS Ⅲ는 발린과 이소류신에 의해 저해된다. 모든 경우에 효소는 2개의 서브유닛으로 구성된다. AHAS Ⅰ과 AHAS Ⅲ에서, 각각 유전자 ilvN과 ilvH에 의해 코딩되는 작은 조절성 서브유닛이 저해를 담당한다.

이. 콜라이(E. coli)와 반대로, ilvBN은 씨. 글루타미쿰에서 AHAS만을 코딩한다(Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1993. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603). 씨. 글루타미쿰 효소의 활성은 발린, 류신 및 이소류신에 의해 저해된다(Eggeling, I., Cordes, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1987, Regulation of acetohydroxy acid synthetase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of alfa-ketobutyrate to L-isoleucine. Appl Microbiol Biotechnol 25, 346-351). 유전자 클러스터 ilvBNC의 발현은 또한 전사 약화(transcriptional attenuation)를 통해 이들 3가지 아미노산에 의해 조절된다(Morbach, S., Junger, C., Sahm, H., Eggeling, L., 2000. Attenuation control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: evidence of leader peptide formation without the presence of a ribosome binding site. J Biosci Bioeng 90, 501-507).

지금까지 코리네박테리움 글루타미쿰에서 AHAS 활성의 조절을 해제하는 어떠한 돌연변이도 분자 수준에서 설명되지 않았다.

본 발명의 목적은 변형된 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS)를 제공하기 위한 것이었다. 특히, 본 발명의 AHAS는 바로 생산된 아미노산에 의한 저해를 받는 경향이 덜할 것이다.

이 목적은 청구의 범위에 따라 충족된다. 청구항 1은 파악된 특징을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 특정 핵산에 관한 것이다. 청구항 2는 폴리펩티드 자체를 포함한다. 청구항 3과 4는 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주, 또는 PCR을 통한 그들의 생산을 위한 특정 프라이머 또는 프로브를 개시한다. 더욱이, 청구항 5는 본 발명의 추가 개량된 폴리펩티드의 생산 방법을 구체화하고, 청구항 6은 이와 같이 생산된 각각의 폴리펩티드와 핵산을 보호한다. 청구항 7과 8은 특별한 용도에 관한 것이고, 청구항 9는 아미노산의 제조 방법을 포함한다. 유사하게, 청구항 10과 11은 특별한 벡터와 미생물을 제공한다.

a) 서열 1 또는 서열 3에 따른 핵산 서열;

b) 각각 Asp와 Phe을 코딩하는 염기 트리플렛(triplet)을 위치 21과 22에 포함하는 핵산 서열;

c) a) 또는 b)의 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 핵산 서열;

d) a) 또는 b)의 서열과 적어도 70％의 상동성을 갖는 핵산 서열;

e) a) 또는 b)에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 아미노산 수준에서 적어도 80％의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

f) ⅰ) a) 또는 b)의 핵산의 돌연변이유발,

ⅱ) ⅰ)로부터 수득가능한 핵산 서열의 적당한 벡터로의 라이게이션 후 적당한 발현 시스템으로의 형질전환, 및

ⅲ) 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 결정적 폴리펩티드의 발현 및 검출

에 의해 제조되는, a) 또는 b)에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 비해 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

g) a)-f)의 핵산 서열의 적어도 15개의 연속적 염기를 함유하는 핵산 서열

로 구성된 군으로부터 선택되는 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공함으로써, 상기 제시되고 선행기술로부터 알려져 있는 장애가 놀랍게도 우수한 방식으로 극복되었다. 본 발명의 핵산은 야생형 효소에 비해 아미노산 피드백 저해가 감소된 폴리펩티드를 코딩한다.

돌연변이유발 방법을 이용하여 본 발명에 따른 핵산 또는 그들에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 개량하는 과정은 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다. 적당한 돌연변이유발 방법은 이러한 목적을 위해 당업자가 이용할 수 있는 모든 방법이다. 특히, 이러한 방법으로는 포화 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 시험관내 재조합 방법 및 부위-지정 돌연변이유발(Eigen, M. and Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl . Chem . 1984, 56, 967-978; Chen, K. and Arnold, F., Enzyme engineering for non-aqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 1991, 9, 1073-1077; Horwitz, M. and Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405-7409; Dube, D. and L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703-5707; Stemmer, P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389-391; Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 1994, 10747-10751)이 있다.

수득된 새로운 핵산 서열은 하기 인용되는 보편적 방법을 이용하여 숙주 유기체에서 클로닝되고, 이 방법으로 발현되는 폴리펩티드는 적당한 스크리닝 방법을 이용하여 검출된 후 단리된다. 검출 목적을 위해, 이 폴리펩티드로 형성된 분자에 대한 모든 가능한 검출 반응이 기본적으로 적당하다. 특히, 형성되거나(예를 들어, 아세토락테이트) 소모된 화합물을 통한 광측정 시험, HPLC 또는 GC 방법이 형성된 아미노산의 검출을 위해 본원에서 이용될 수 있다. 부가하여, 유전공학 기술에 의해 변형된 새로운 폴리펩티드를 검출하기 위하여, 젤 전기영동 검출 방법이나 항체를 이용한 검출 방법도 적당하다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일가닥 핵산 서열 또는 그에 상보적인 단일가닥 핵산 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다.

본원에서 표현 "엄격한 조건 하에서"는 문헌 [Sambrook,J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있는 것과 동일한 방식으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 엄격한 혼성화는 50 ℃, 바람직하게는 55 ℃, 보다 바람직하게는 62 ℃, 가장 바람직하게는 68 ℃에서 1 시간 동안 1× SSC(150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.0) 및 0.1％ SDS(도데실황산나트륨) 중에서 반응시킨 후에, 보다 바람직하게는 50 ℃, 바람직하게는 55 ℃, 보다 바람직하게는 62 ℃, 가장 바람직하게는 68 ℃에서 1 시간 동안 0.2× SSC 및 0.1％ SDS 중에서 반응시킨 후에 여전히 양성 혼성화 신호가 관찰될 때 존재한다.

본 발명의 제2 측면은

분지쇄 아미노산, 특히 발린, 류신 및 이소류신을 발효에 의해 생산함에 있어 생체-경로에서 변형된 AHAS-효소로서 작용할 수 있는,

a) 제1항에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;

b) 서열 2 또는 서열 4에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드;

c) 서열 2 또는 서열 4를 갖는 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성이 실질적으로 감소되지 않은, 서열 2 또는 서열 4를 갖는 폴리펩티드에 적어도 84％ 상동적인 폴리펩티드

로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다. 앞서 언급한 바와 같이, 이들 효소는 더 적은 피드백 저해를 갖고, 따라서 부정적인 저해 효과를 갖지 않으면서 발효 브로쓰(broth)에서 더 높은 농도의 아미노산을 생성하는 가능성에 이르게 한다.

제3 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 플라스미드, 벡터, 미생물에 관한 것이다. 적당한 플라스미드나 벡터에는 원칙적으로 이러한 목적을 위해 당업자가 이용할 수 있는 모든 구체예가 포함된다. 이러한 타입의 플라스미드와 벡터는, 예를 들어 문헌 [Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W., Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol . 1990, 185, 61-89]이나, 노바젠(Novagen), 프로메가(Promega), 뉴 잉글랜드 바이로랩스(New England Biolabs), 클론텍(Clontech) 또는 깁코 비알엘(Gibco BRL)에 의해 발행되는 회사 팜플렛에서 찾아볼 수 있다. 다른 바람직한 플라스미드와 벡터는 문헌 [Glover, D. M.(1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. Ⅰ-Ⅲ, IRL Press Ltd., Oxford]; [Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham]; [Goeddel, D. V., Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol . 1990, 185, 3-7]; [Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명에 따른 핵산을 함유하는 유전자 제작물이 숙주 유기체에서 매우 바람직한 방식으로 클로닝될 수 있게 하는 플라스미드는 도 1과 도 2의 플라스미드이다.

유사하게, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열 중 하나 이상을 함유하는 미생물을 제공한다.

본 발명에 따른 핵산 서열을 함유하는 플라스미드가 클로닝되는 미생물은 충분한 양의 재조합 효소를 증폭시켜 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위 해 이용되는 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다(Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 언급될 수 있는 미생물은 원칙적으로 이러한 목적을 위해 적당하다고 당업자에게 알려져 있는 모든 유기체이며, 그 예로는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 피치아 종(Pichia sp .), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵생물, 또는 포유류 세포, 곤충 세포와 같은 진핵생물이 있다. 이. 콜라이 균주가 이러한 목적을 위해 바람직하게 사용된다. 이. 콜라이 XL1 블루, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10^- 또는 HB101이 매우 특히 바람직하다. 숙주 유기체에서, 발명에 따른 핵산을 함유하는 유전자 제작물이 바람직하게 클로닝되게 하는 플라스미드는 상기 언급되어 있다.

본 발명에 의해 제공되는 바람직한 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 만노스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤과 에탄올로부터 분지쇄 아미노산을 생산할 수 있다. 미생물은 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아의 대표적인 미생물들을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 내에서, 에난티오머적으로 풍부화된 아미노산, 바람직하게는 L-아미노산을 생산하는 그의 능력에 대해 전문가 서클에 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미쿰이 특히 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주는

특히 공지의 야생형 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디배리카텀(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020; 및

예를 들어, 이소류신 생산 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14309

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14310

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14311

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC15168

코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871,

예를 들어, 류신 생산 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21885

브레비박테리움 플라붐 ATCC21889, 또는

예를 들어, 발린 생산 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12455

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 9325

브레비박테리움 락토퍼멘텀 FERM-P 9324

브레비박테리움 락토퍼멘텀 FERM-BP 1763

과 같이 각 미생물로부터 생산되는 분지쇄 아미노산을 생산하는 돌연변이체나 균주이다.

본 발명의 핵산 서열은 적당한 숙주에서 과잉발현될 수 있다. 과잉발현은 상응하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 구조 유전자 상류에 위치하는 프로모터와 조절 영역이나 리보솜-결합 부위를 돌연변이화시킴으로써 달성될 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입되는 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 또한, 유도성 프로모터에 의해 분지쇄 아미노산의 발효적 생산 동안 발현을 증가시키는 것도 가능하다. 발현은 또한 mRNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해서 향상된다. 효소 활성은 더욱이 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증폭된다. 유전자 또는 유전자 제작물은 가변적인 카피 수로 플라스미드에 존재하거나 염색체에 도입되고 증폭될 수 있다. 대안으로, 관심있는 유전자의 과잉발현은 또한 영양 배지의 조성과 배양 조건을 변형함으로써 달성될 수 있다. 이 경우 추가 지침을 위해 US09/471803 또는 그의 대응출원 DE19951708을 참조할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열을 PCR에 의해 제조하기 위한 프라이머, 또는 본 발명의 핵산 서열을 검출하기 위한 혼성화 프로브는 본 발명의 다음 주제이다. 본 발명에 따른 핵산 서열은, AHAS 단백질을 코딩하는 전장 cDNA를 단리하고 본 발명의 서열과 높은 정도의 서열 유사성을 나타내는 그러한 cDNA 또는 유전자를 단리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA에 대한 혼성화 프로브로서 적당하다.

본 발명에 따른 핵산 서열은 더욱이 프라이머로서 적당하며, 그의 도움으로 모든 타입의 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 AHAS 단백질을 코딩하는 유전자 의 DNA가 생성될 수 있다. 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 상보적 DNA 서열이 포함된다. 적당한 프라이머는 원칙적으로 당업자에게 알려져 있는 방법에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에 따라 프라이머를 설계하는 것은 공지의 DNA 서열과 비교하거나, 또는 눈으로 검출되는 아미노산 서열을 고려 중인 유기체의 선호되는 코돈으로 번역함으로써 수행된다(예를 들어, 스트렙토마이세스에 대해 문헌 [Wright F. and Bibb M. J.(1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55-65] 참조). 소위 거대족(superfamily)으로부터의 단백질의 아미노산 서열이 지닌 공통적 특징이 또한 이 측면에서 유용하다(Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J.(1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779-783). 이 주제에 대한 추가 정보는 문헌 [Gait, M. J.(1984), Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press Ltd., Oxford]; [Innis, M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J. and White, T. J.(1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego]에서 찾아볼 수 있다. 아래 프라이머가 극히 선호된다.

프로브나 프라이머로 작용하는 그러한 핵산 서열은 발명의 것들과 공통적인 적어도 30, 바람직하게는 적어도 20, 매우 특히 바람직하게는 적어도 15개의 연속적 핵산을 갖는다. 적어도 40 또는 50 염기쌍 길이를 갖는 핵산 서열이 또한 적당하다.

본 발명의 추가 실시양태는

a) 핵산 서열을 돌연변이유발시키고,

b) a)로부터 수득가능한 핵산 서열을 적당한 벡터에 클로닝하여, 이들을 적당한 발현 시스템으로 옮기고,

c) 이로써 형성된, 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 폴리펩티드를 검출 및 단리하는 것

을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 핵산 서열로부터 출발하는 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS) 활성을 갖는 개량된 rec-폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 앞서 기재된 것과 유사한 방법에 의해 수득가능한 rec-폴리펩티드 또는 이들을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 개량된 rec-폴리펩티드를 생산하는데 요구되는 핵산 서열의 제조와 숙주에서 그들의 발현은 상기 기재되어 있고 그와 같이 여기에 적용된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드와 개량된 rec-폴리펩티드는 바람직하게는 에난티오머-풍부화된 분지쇄 아미노산, 보다 바람직하게는 발린, 류신 및 이소류신을 제조하는데 사용된다. 부가하여, 핵산 서열 및 개량된 핵산 서열은 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 제조하는데 우선적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다음 전개는 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는 분지쇄 아미노산을 제조하는 방법을 반영한다.

더욱이, 벡터 pECKA(도 1) 또는 pECKA/ilvBNC(도 2)가 본 발명에 포함된다. 더욱이 DSM15652, DSM15651 또는 DSM15650과 같은 변형된 미생물이 본 발명에 포함된다. 그들은 2003년 6월 4일 부다페스트 조약에 따라, 기탁기관인 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig」에 기탁되었다.

ilvN 유전자에 돌연변이를 함유하는 ilvBNC 오페론의 클로닝을 위해, 셔틀 벡터 에스케리치아 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰이 제작되었다. 제한 효소 BglⅡ에 대한 제1 인식 부위가 벡터 pK19로부터 제거되었다. 그런 다음, 브레비박테리움 락토퍼멘텀으로부터의 플라스미드 pBL1의 HindⅢ/HindⅡ 단편(2.7 kb)이 pK19의 NheⅠ 부위로 클로닝되었다. 생성된 플라스미드 벡터 pECKA(5.4 kb)는 에스케리치아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되고, 7개의 독특한 클로닝 부위, 카나마이신 내성 마커, 및 이. 콜라이에서의 클로닝을 위해 β-갈락토시다제의 α-상보성을 제공한다. ilvBNC 오페론을 운반하는 염색체 단편 SspⅠ/EcoRⅠ(5.7 kb)(SspⅠ+BamHⅠ 말단을 갖는)이 HindⅡ+BamHⅠ-분해된 벡터 pECKA에 클로닝되어 pECKAilvBNC(11.1 kb)를 생성하였다.

ilvBNC 오페론의 자연적인 ScaⅠ/BglⅡ 단편(770 bp)이 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제작된 3 내지 5개의 염기 변화를 함유하는 동일한 단편으로 교환되었다. 부위-지정 돌연변이유발의 표적은 N 말단 근처의 ilvN에 의해 코딩되는 조절 서브유닛의 보존된 도메인이었다. 돌연변이는 에스케리치아 콜라이와 스트렙토마 이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) AHAS 돌연변이체의 서열에 따라 PCR에 의해 설계되었다. 돌연변이는 서열분석에 의해 검출되었다.

플라스미드 DNA가 에스케리치아 콜라이로부터 단리되었고, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032ΔilvN이 플라스미드 pECKAilvBNC(WT), pECKAilvBNC(M8) 및 pECKAilvBNC(M13)로 형질전환되었다. 분지쇄 아미노산에 의한 AHAS의 저해 감소가 입증되었다.

"단리된"은 그의 자연 환경으로부터 분리된 것을 의미한다.

본 발명의 문맥에서 광학적으로 풍부화된(에난티오머적으로 풍부화된, 에난티오머 풍부화된) 화합물은 다른 대장체(antipode)와 혼합된 50몰％ 초과의 한 광학 대장체의 존재를 의미하는 것으로 이해된다.

표현 "핵산 서열"은 모든 타입의 단일가닥 또는 이중가닥 DNA와 또한 RNA나 상기한 것들의 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다.

활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성의 향상은, 본 발명에 따라 폴리펩티드가 사용되는 반응 조건 하에서 더 활성적이고(거나) 더 선택적이고(거나) 더 안정한 것을 의미한다. 산업적 적용을 위한 효소의 활성과 안정성은 당연히 가능한 한 높아야 하는 반면, 선택성에 관한 향상은 기질 선택성이 감소하거나 효소의 에난티오머 선택성이 증가할 때로 언급된다. 이와 관련하여 사용되는 표현 "실질적으로 감소되지 않는"에 대해, 동일한 정의가 필요한 변경을 가하여 적용된다.

청구된 단백질 서열과 핵산 서열은 또한, 본 발명에 따라 이들 서열 중 하나에 91％ 초과, 바람직하게는 92％, 93％ 또는 94％ 초과, 보다 바람직하게는 95％ 또는 96％ 초과, 특히 바람직하게는 97％, 98％ 또는 99％ 초과의 상동성(자연적 다의성(degeneration) 제외)을 갖되, 단 그러한 서열의 작용 양식이나 목적이 유지되는 그들 서열을 포함한다. 본원에 사용된 표현 "상동성"(또는 동일성)은 등식 H(％) = [1 - V/X]×100(여기에서, H는 상동성을 의미하고, X는 비교 서열에 있는 뉴클레오염기/아미노산의 총 수이며, V는 비교 서열에 관하여 고려되는 서열에 있는 상이한 뉴클레오염기/아미노산의 수임)에 의해 결정될 수 있다. 각 경우에 표현 "폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 유전자 코드의 다의성에 따라 가능한 것으로 보이는 모든 서열을 포함한다.

본 문서에 언급된 참조 문헌은 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 간주된다.

1. 플라스미드 벡터 pECKA의 제작

ilvN 유전자에 돌연변이를 함유하는 씨. 글루타미쿰 ilvBNC 오페론의 클로닝과 그의 과잉발현을 위해, 에스케리치아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되는 셔틀 벡터를 제작하였다. 먼저, 제한효소 BglⅡ에 대한 인식 부위를 벡터 pK19(Pridmore, R. D., 1987. New and versatile cloning vectors with kanamycin-resistance marker. Gene 56, 309-312)로부터 제거하였다. 플라스미드 pK19를 BglⅡ로 분해하고, 클레나우(Klenow) 효소에 의해 평활-말단화하고 다시 라이게이션하였다. 라이게이션 후, 이. 콜라이 DH5α 세포를 라이게이션 혼합물로 형질전환하고, 생성된 플라스미드 pK19B를 함유하는 형질전환체를 카나마이신(20 ㎎/ℓ)을 함유하는 아가 플레이트 상에서 선별하였다. pK19B에서 BglⅡ 부위의 제 거를, 단리된 플라스미드 분자를 BglⅡ로 처리하여 확인하였다(이 제거는 새로이 제작된 벡터 pECKA로의 ilvN 유전자를 운반하는 단편의 추후 서브클로닝을 허용하였다). 그런 다음, 클레나우 효소에 의해 평활-말단화된 브레비박테리움 락토퍼멘텀으로부터의 플라스미드 pBL1의 HindⅢ/HindⅡ 단편(2.7 kb)을 pK19B의 평활-말단화된 NheⅠ 부위로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 벡터 pECKA(5.4 kb)는 에스케리치아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되고, 7개의 독특한 클로닝 부위(HindⅡ, SalⅠ, BamHⅠ, SmaⅠ, AvaⅠ, KpnⅠ, SacⅠ), 카나마이신 내성 마커 및 이. 콜라이에서의 클로닝을 위해 β-갈락토시다제의 α-상보성을 제공한다. 그의 제한 지도 및 유전자 지도는 도 1에 나타내어져 있다.

2. 벡터 pECKA로의 ilvBNC 오페론의 클로닝

ilvBNC 오페론을 운반하는 씨. 글루타미쿰 염색체의 5.7-kb 단편을 플라스미드 pKK5(Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1993. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis ofthe ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603)를 제한효소 SspⅠ 및 BamHⅠ으로 분해하여 수득하였다. 단편을 HindⅡ+BamHⅠ-분해된 벡터 pECKA로 라이게이션하고, 라이게이션 혼합물을 이. 콜라이 DH5α의 형질전환에 사용하였다. 형질전환체를 카나마이신(30 ㎎/ℓ)을 함유하는 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 생성된 플라스미드 pECKAilvBNC(11.1 kb)의 구조를 제한 분석에 의해 확인하였다. 플라스미드 pECKAilvBNC의 제한 지도 및 유전자 지도는 도 2에 나타내어져 있다.

3. ilvN 유전자의 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 설계

씨. 글루타미쿰 ilvN 유전자(진뱅크(GenBank) 등록번호 L09232)에 의해 코딩되는 AHAS의 조절 서브유닛의 공지의 아미노산 서열을 스트렙토마이세스 신나모넨시스(진뱅크 등록번호 AF175526) 및 에스케리치아 콜라이(진뱅크 등록번호 AE016769, 완전한 게놈의 섹션 15)의 조절 서브유닛의 공지의 아미노산 서열과 정렬하였다. 발린에 대한 내성을 부여하는 에스케리치아 콜라이와 스트렙토마이세스 신나모넨시스의 몇몇 돌연변이가 기재되어 있다(Vyazmensky, M., Sella, C., Barak, Z., Chipman, D. M., 1996. Isolation and characterization of subunits of acetohydroxy acid synthase isozyme Ⅲ and reconstitution of the holoenzyme. Biochemistry 35, 10339-10346; Kopecky, J., Janata, J., Pospisil, S., Felsberg, J., Spizek, J., 1999. Mutations in two distinct regions of acetolactate synthase regulatory subunit from Streptomyces cinnamonensis result in the lack of sensitivity to end-product inhibition. Biochem Biophys Res Commun 266, 162-166). 이 표현형을 나타내는 일부 균주에서, 위치 20(이. 콜라이 서열 번호매김에서)에서 글리신을 아스파테이트로 변화시키는 돌연변이가 단백질의 N-말단 근처의 부분적으로 보존된 도메인에서 이. 콜라이와 에스. 신나모넨시스 둘 다에서 발견되었다.

본 발명자들은 씨. 글루타미쿰의 ilvN 유전자의 부위-지정 돌연변이유발을 위한 다의성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ILVNM1(서열 7)을 설계하였다. 이 프라이머는 씨. 글루타미쿰 AHAS 조절 서브유닛의 위치 20 내지 22에 있는 아미노산인 글리신, 이소류신 및 이소류신에 해당하는 뉴클레오티드 트리플렛의 위치에서 ilvN 유전자로 돌연변이를 도입할 수 있다.

야생형의 서열과 비교하여, 변형된 뉴클레오티드가 굵은 글씨로 나타내어져 있다. 트리플렛 20과 22 내에 2개의 다의성 위치(각각 G 또는 A 및 A 또는 T)가 있다.

4. ilvN 유전자의 부위-지정 돌연변이유발

씨. 글루타미쿰 ilvBNC 오페론의 자연적 ScaⅠ/BglⅡ 단편의 부위-지정 돌연변이유발을 PCR 반응과 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(Ito, W., Ishiguro, H., Kurosawa, Y., 1991. A general method for introducing a series of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction. Gene 102, 67-70)를 이용하여 수행하였다.

사용된 프라이머:

제1 PCR: 프라이머 MILVNH와 MISBGL을 이용하여 변형된 천연 BglⅡ 부위를 갖는 단편 A(786 bp)를 증폭하였다. 프라이머 ILVM1과 MILVND를 이용하여 ilvN 유전자 내에 돌연변이를 갖는 단편 B(491 bp)를 증폭하였다. 주형으로서 플라스미드 pECKAilvBNC를 사용하였다. 생성된 DNA 단편을 아가로스 젤에서 분리하고, 단리하고 침전에 의해 정제하였다.

제2 PCR: 프라이머 MILVNH-MILVND와 주형인 단편 A + B(몰 비 1:1로 혼합된)를 이용하여, BglⅡ 부위에 돌연변이를 갖는 단편 C(803 bp)와 ilvN 유전자에 돌연변이를 갖는 단편 D(803 bp)를 증폭하였다. 이 혼합물을 ScaⅠ과 BglⅡ에 의해 분해하고, 생성된 단편을 아가로스 젤로부터 단리하였다. 플라스미드 pECKAilvBNC를 동일한 효소로 분해하여 766 bp와 10334 bp의 단편을 제공하고, 더 큰 단편을 또한 젤로부터 단리하였다. 단리된 단편을 혼합하여 라이게이션하였다. 이. 콜라이 DH5α의 세포를 라이게이션 혼합물에 의해 형질전환하고, 형질전환체를 카나마이신(30 ㎎/ℓ)을 갖는 플레이트 상에서 선별하였다. 이 방식으로, 플라스미드 pECKAilvBNC의 천연 ScaⅠ/BglⅡ 염색체 단편(766 bp)을 ilvN이 3 내지 5개의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 동일한 단편으로 교환하였다.

5. ilvN의 돌연변이체의 서열분석

수득된 이. 콜라이 DH5α 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 단리하고 프라이머 SILVNH와 자동 서열분석기 Vistra(Amersham)를 이용하여 서열분석하였다.

트리플렛 20 내지 22 내에 2개의 상이한 서열을 갖는 클론을 단리하였다.

수득된 ilvN 유전자에서 돌연변이화된 클론:

돌연변이체 M8과 M13의 완전한 ilvN 서열은 각각 서열 3과 1에 나타내어져 있다.

6. 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환

플라스미드 DNA를 에스케리치아 콜라이로부터 단리하고 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN을 전기천공법(Liebl, W., Bayerl, A., Schein, B., Stillner, U., Schleifer, K. H., 1989. High efficiency electroporation of intact Corynebacterium glutamicum cells. FEMS Microbiol. Lett. 53, 299-303)을 이용하여 플라스미드 pECKAilvBNC(WT), pECKAilvBNC(M8) 및 pECKAilvBNC(M13)로 형질전환하였다. 형질전환체를 카나마이신(30 ㎎/ℓ)을 갖는 플레이트 상에서 선별하였다.

7. AHAS 활성 및 발린, 류신 및 이소류신에 의한 그의 저해의 측정

플라스미드 pECKAilvBNC(WT), pECKAilvBNC(M8) 및 pECKAilvBNC(M13)를 운반하는 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN을 AHAS의 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 세포를 최소 배지 CGXⅡ에서 밤새 배양하고, 원심분리에 의해 수획하고 초음파 처리에 의해 파쇄하였다. 원심분리(16000×g, 30 분) 후, AHAS 활성을 무-세포 추출물에서 측정하였다. 분광광도측정 효소 분석법은 반응 산물인 아세토락테이트를 간접적으로 검출한다(Singh, B. K., Stidham, M. A., Shaner, D. L., 1988. Assay of acetohydroxy acid synthase. Anal Biochem 171, 173-179). 이 분석법은 최종 산물인 아세토락테이트의 아세토인으로의 전환과 크레아틴과 나프톨 복합체의 형성을 통한 아세토인의 검출을 포함한다.

효소 활성 측정의 결과는 표 1에 나타내어져 있다. 발린, 류신 및 이소류신에 의한 효소의 저해를 시험하기 위하여, 3가지 아미노산(10 mM)을 반응 혼합물에 별도로 가하였다. 결과는 각각 표 2와 표 3에 나타내어져 있다.

AHAS 활성

균주/플라스미드	비(比) AHAS 활성 (nmol 아세토인 분^-1 단백질의 ㎎^-1)
씨. 글루타미쿰 ATCC13032	33.7±10
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN	0.43
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(WT)	110±40
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M8)	31.1±0.9
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M13)	40.9±13

AHAS 활성의 저해

균주/플라스미드	10 mM 아미노산을 사용한 비 AHAS 활성 (nmol 아세토인 분^-1 단백질의 ㎎^-1)
균주/플라스미드	-	Val	Leu	Ile
씨. 글루타미쿰 ATCC13032	33.7	16.9	20.9	21.2
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC WT	110	61.6	71.5	68.2
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M8)	31.1	35.1	34.8	32.7
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M13)	40.9	40.7	44.2	40.0

백분율로 나타낸 AHAS 활성의 저해

균주/플라스미드	저해(10 mM 아미노산)
균주/플라스미드	Val	Leu	Ile
씨. 글루타미쿰 ATCC13032	50％	38％	37％
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC WT	44％	35％	38％
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M8)	0％	0％	0％
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 ΔilvN /pECKAilvBNC(M13)	0％	0％	2.5％

SEQUENCE LISTING <110> Degussa AG <120> Feedback Resistant Mutants <130> 020191 AM <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified AHAS <220> <221> CDS <222> (1)..(519) <400> 1 atg gct aat tct gac gtc acc cgc cac atc ctg tcc gta ctc gtt cag 48 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 gac gta gac gat gac ttt tcc cgc gta tca ggt atg ttc acc cga cgc 96 Asp Val Asp Asp Asp Phe Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 gca ttc aac ctc gtg tcc ctc gtg tct gca aag acc gaa aca cac ggc 144 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly 35 40 45 atc aac cgc atc acg gtt gtt gtc gac gcc gac gag ctc aac att gag 192 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 cag atc acc aag cag ctc aac aag ctg atc ccc gtg ctc aaa gtc gtg 240 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 cga ctt 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Ser His Ile Trp Leu Leu Val Asn 50 55

Claims

a) 서열 1 또는 서열 3에 따른 핵산 서열;

b) 각각 Asp와 Phe을 코딩하는 염기 트리플렛(triplet)을 위치 21과 22에 포함하는 핵산 서열;

c) a) 또는 b)의 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 핵산 서열;

d) a) 또는 b)의 서열과 적어도 70％의 상동성을 갖는 핵산 서열;

e) a) 또는 b)에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 아미노산 수준에서 적어도 80％의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

f) ⅰ) a) 또는 b)의 핵산의 돌연변이유발,

ⅱ) ⅰ)로부터 수득가능한 핵산 서열의 적당한 벡터로의 라이게이션 후 적당한 발현 시스템으로의 형질전환, 및

ⅲ) 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 결정적 폴리펩티드의 발현 및 검출

에 의해 제조되는, a) 또는 b)에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 비해 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

g) a)-f)의 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속적 염기를 함유하는 폴리뉴클레오티드

로 구성된 군으로부터 선택되는 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxy acid synthetase(AHAS)) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열.
a) 제1항에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;

b) 서열 2 또는 서열 4에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드;

c) 서열 2 또는 서열 4를 갖는 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성이 실질적으로 감소되지 않은, 서열 2 또는 서열 4를 갖는 폴리펩티드에 적어도 84％ 상동적인 폴리펩티드

로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
제1항에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 플라스미드, 벡터, 미생물.
제1항에 따른 핵산 서열을 PCR에 의해 제조하기 위한 프라이머, 또는 제1항에 따른 핵산 서열을 검출하기 위한 혼성화 프로브.
a) 핵산 서열을 돌연변이유발시키고,

b) a)로부터 수득가능한 핵산 서열을 적당한 벡터에 클로닝하여, 이들을 적당한 발현 시스템으로 옮기고,

c) 이로써 형성된, 향상된 활성 및(또는) 선택성 및(또는) 안정성을 갖는 폴리펩티드를 검출 및 단리하는 것

을 특징으로 하는, 제1항에 따른 핵산 서열로부터 출발하는 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS) 활성을 갖는 개량된 rec-폴리펩티드의 제조 방법.
제5항에 따라 수득가능한 rec-폴리펩티드 또는 이들을 코딩하는 핵산 서열.
에난티오머-풍부화된 분지쇄 아미노산을 제조함에 있어서의 제2항 또는 제6항에 따른 폴리펩티드의 용도.
아미노산 생산 미생물을 제조함에 있어서의 제1항 또는 제6항에 따른 핵산 서열의 용도.
제2항의 폴리펩티드를 이용하여 분지쇄 아미노산을 제조하는 방법.
벡터 pECKA 또는 pECKA/ilvBNC.
미생물 DSM15652, DSM15651, DSM15650.