KR20010051533A - 코리네형 세균을 사용한 ｌ-라이신의 발효적 제조방법 - Google Patents

코리네형 세균을 사용한 ｌ-라이신의 발효적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) 적어도 csp1 유전자가 감쇠된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균을 발효시키는 단계;
b) 목적하는 L-아미노산을 배지 또는 세균 세포내에 축적시키는 단계; 및
c) L-아미노산을 분리시키는 단계를 수행하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 제조방법에 관한 것으로, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 또다른 유전자를 추가로 증폭시킨 세균을 임의로 사용하거나, 또는 목적하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로를 적어도 부분적으로 억제시킨 세균을 사용한다.

Description

코리네형 세균을 사용한 Ｌ-라이신의 발효적 제조방법{Process for the fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria}
본 발명은 cap1 유전자가 감쇠된 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 제조하는 방법을 제공한다.
L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물 사료, 인간 의학 및 약학 산업에서 사용되고 있다.
이러한 아미노산은 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생산된다. 이러한 아미노산의 중요성으로 인해, 제조 공정을 개선시키려는 끊임없는 노력이 있어왔다. 제조 공정을 개선시키는 것은, 발효 기술과 관련된 수단(예: 교반 및 산소 공급), 또는 영양분 배지의 조성(예: 발효 동안의 당 농도) 또는 수득한 생성물의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피) 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성과 관련될 수 있다.
이러한 미생물의 수행 특성은 돌연변이유발, 선별법 및 돌연변이체 선별법을 사용하여 개선시킨다. 상기한 방법으로, 항대사물(예: 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)시스테인)에 내성이 있거나, 조절에 중요한 대사물에 대해 영양요구성이고 L-아미노산을 생산하는 균주가 수득된다.
몇년 동안 재조합 DNA 기술법이, 개별적인 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산 생산에 대한 이의 효과를 조사함으로써, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키는데 또한 사용되어 왔다. 이러한 목적에 대한 논문은 특히 다음에서 찾아볼 수 있다[참조 문헌: Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger(BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling(Amino Acids 6:261-272(1994); Jetten and Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995) and Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)].
본 발명자들은 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 제조하는 개선된 방법을 위한 신규한 토대를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 플라스미드 pK18mobsacBㅿcsp1의 지도이다.
L-아미노산, 특히 라이신은 인간 의학 및 약학 산업, 식품 산업, 특히 동물 사료 산업에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신을 제조하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공하는 것에 일반적으로 관심이 있어왔다.
하기에서 L-라이신 또는 라이신은 이의 염기뿐만 아니라, 예를 들어 라이신 일염산염 또는 라이신 황산염과 같은 이의 염을 또한 의미한다.
본 발명은 적어도 Csp1 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(csp1 유전자)이 감쇠되어 특히 낮은 수준으로 발현되는 코리네형 세균을 사용하여, 목적하는 산물을 배지 또는 세포에 축적시키고 L-아미노산을 분리시키는, L-아미노산, 특히 L-라이신을 효소적으로 제조하는 방법을 제공한다.
csp1 유전자를 감쇠시키기 전에 이미 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산하는 균주를 사용하는 것이 바람직한다.
바람직한 양태는 특허청구범위에서 청구할 것이다.
이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 미생물에서 상응하는 DNA(본 발명의 경우 csp1 유전자)에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을, 예를 들어 약한 프로모터(promoter)를 사용하거나, 또는 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하거나 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성화시키는 유전자 또는 대립유전자를 사용하고 임의로 이들 두 방법을 사용함으로써 감소시키거나 억제시킴을 의미한다.
본 발명에서 제공되는 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 아미노산, 특히 라이신을 생산할 수 있다. 미생물에는 대표적으로 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속이 포함될 수 있다. 코리네박테리움 속중에서도, L-아미노산을 생산하는 능력이 탁월한 종으로 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종을 특별히 언급할 수 있다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종중에서 적합한 균주로는 다음의 공지된 야생형 균주:
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032;
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806;
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870;
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965;
코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539;
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067;
브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및 L-아미노산을 생산하는, 이로부터 제조된 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면 L-라이신 생산 균주로서:
코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709;
브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708;
브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712;
코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463;
코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및
코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5714이다.
본 발명에 이르러, csp1 유전자가 감쇠되면 코리네형 세균이 L-아미노산, 특히 L-라이신을 개선된 방식으로 생산한다는 것을 밝혀내었다.
csp1 유전자는, 아직까지 어떠한 효소 활성을 갖는지가 입증되지 않은 PS1 단백질을 암호화한다. csp1 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Joliff et al., Molecular Microbiology 1992 Aug; 6 (16): 2349-62]. 서열은 일반적으로 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information; NCBI, Bethesda, MD, USA)의 뉴클레오타이드 서열 데이타베이스로부터 g40486의 승인 번호로서 입수할 수 있다. 상기한 문헌에 기술되어 있는 csp1 유전자를 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성 또는 기능적으로 중성인 센스 돌연변이로부터 생성되는 csp1 유전자의 대립유전자를 또한 사용할 수 있다.
감쇠는 csp1 유전자의 발현 또는 유전자 산물의 촉매 특성을 감소시키거나 억제시킴으로써 수행할 수 있다. 임의로 두가지 수단을 합하여 사용한다.
유전자 발현용 시그날 구조의 유전자 변형(돌연변이) 또는 배양물의 적절한 조절에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 유전자 발현용 시그날 구조에는, 예를 들어 리프레서(repressor) 유전자, 액티베이터(activator) 유전자, 오퍼레이터(operator), 프로모터, 어태뉴에이터(attenuator), 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 터미네이터(terminator)가 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 이와 관련하여 하기 문헌[참조 문헌: 제WO 96/15246호; Boyd ＆ Murphy, Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988); Voskuil ＆ Chambliss, Nucleic Acids Research 26: 3548(1998); Jensen ＆ Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58: 191(1998); Patek et al., Microbiology 142: 1297(1996)]과 유전학 및 분자생물학의 공지된 문헌[참조 문헌: Knippers, "Molecular Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995; or Winnacker, "Gnen und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990]에서 정보를 입수할 수 있다.
효소 단백질의 촉매적 특성을 변화시키거나 감소시키는 돌연변이는 선행 기술에 공지되어 있으며, 언급할 수 있는 예로는 하기하는 논문이 있다[참조 문헌: Qiu and Goodman, Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Sugimoto et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997) and Mockel, "Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyme", Berichte des Forschungzentrums Julichs, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Germany, 1994 ]. 요약된 내용은 유전학 및 분자생물학의 공지된 문헌, 예를 들어 헤이즈만(Hagemann)의 문헌[참조 문헌: "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]에서 찾을 수 있다.
고려될 수 있는 돌연변이에는 전이, 역전, 삽입 및 결실이 있다. 효소 활성에 대한 아미노산 교환 효과에 따라, 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이로 공지되어 있다. 유전자내에서 하나 이서의 염기가 삽입 또는 치환되는 것은, 부정확한 아미노산이 삽입되거나 전사가 미성숙하게 종결된 결과로서 프레임 쉬프트 돌연변이를 발생시킨다. 2개 이상의 코돈 결실로 전형적으로 효소 활성이 완전하게 파괴된다. 이러한 돌연변이를 발생시키는 방법은 당해 선행 기술분야에 속하며, 공지된 유전자 및 분자생물학 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조 문헌: Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995; Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990; or Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986].
돌연변이된 csp1 유전자의 한가지 예는 플라스미드 pK18mobsacBㅿcsp1에 포함된 ㅿcsp1 대립유전자이다(도 1). ㅿcsp1 대립유전자는 csp1 유전자의 5' 및 3' 말단의 서열만을 포함하고 있고, 암호화 영역인 1690bp 길이의 구역은 존재하지 않는다(결실됨). 이러한 ㅿcsp1 대립유전자는 통합 돌연변이유발에 의해 코리네형 세균내로 혼입시킬 수 있다. 씨. 글루타미쿰내에서 복제될 수 없는, 상기한 플라스미드 pK18mobsacBㅿcsp1을 이러한 목적에 사용한다. 통합을 이행하는 제1 "교차(crossing over)" 및 csp1 유전자를 절제하는 제2 "교차"에 의해 형질전환 및 상동성 재조합이 이루어진 후, ㅿcsp1 결실이 통합되어 특정 균주에서 이의 기능이 완전하게 손실된다.
통합 돌연변이유발과 관련된 지시 및 설명은, 예를 들어 다음 문헌에서 찾을 수 있다[참조 문헌: Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); or Peters-Wendisch et al., Applied Microbiology 144, 915-927 (1998)].
감쇠된 csp1 유전자를 갖는 코리네형 세균의 아미노산 생산 균주의 한가지 예는 라이신 생산자 코리네박테리움 글루타미쿰 R167ㅿcsp1이다.
csp1 유전자를 감쇠시키는 것 외에, 특정 생합성 경로, 당분해, 보충 대사경로, 시트르산 사이클 또는 아미노산 방출 효소 하나 이상을 증폭시키는 것이 L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조하는데 또한 유리할 수 있다.
따라서, 예를 들어 L-라이신을 생산하기 위해, 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(EP-B 제0 197 335호)를 동시에 과발현시킬 수 있고/있거나, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]를 동시에 과발현시킬 수 있거나, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]를 동시에 과발현시킬 수 있거나, 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조 문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)]를 동시에 과발현시킬 수 있거나, 또는 라이신 방출자를 암호화하는 lysE 유전자[참조 문헌: DE-A 제195 48 222호]를 동시에 과발현시킬 수 있다.
csp1 유전자와는 별도로, 포스포에놀피루베이트 카복실카이나제를 암호화하는 pck 유전자[참조 문헌: DE 제199 50 409.1호, DSM 13407] 및/또는 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참조 문헌: US 제09/396,478호, DSM 12969)를 동시에 감쇠시키는 것이 아미노산, 특히 L-라이신 생산에 또한 유리할 수 있다.
최종적으로, csp1 유전자를 감쇠시키는 것외에, 원치않는 2차 반응을 억제시키는 것이 아미노산 생산에 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].
사용되는 배양 배지는 특정 균주의 요건을 적절하게 충족시켜야만 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지는 일반적인 세균학 방법 매뉴얼("Manual of Methods for General Bacteriology", the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981))에 기술되어 있다. 사용할 수 있는 탄소 공급원에는 당 및 탄수화물(예: 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전문 및 셀룰로스), 오일 및 지방(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세룰 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)이 있다. 이러한 물질들은 개별적으로 사용하거나 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 질소 공급원에는 질소 함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 있다. 질소 공급원은 개별적으로 사용하거나 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 인 공급원에는 인산, 이수소인산칼륨 또는 수소인산이칼륨, 또는 나트륨을 함유하는 상응하는 염이 있다. 배양 배지는 추가로 금속의 염, 예를 들어 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철을 추가로 포함한다. 최종적으로, 상기한 물질 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 촉진 물질을 또한 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 추가로 배양 배지에 가할 수 있다. 상기한 공급 물질을 단일 배치로서 배양물에 가하거나 배양되는 동안에 적절하게 공급할 수 있다.
염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 배양물의 pH를 적절하게 조절한다. 소포제(예: 지방산 폴리글리콜 에스테르)를 사용하여 거품을 적절하게 조절할 수 있다. 플라스미드 안정성은 선택적으로 작용하는 적합한 물질(예: 항생제)을 배지에 가하여 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물(예: 공기)를 도입한다. 배양물의 온도는 일반적으로는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 목적하는 생성물의 최대량이 형성될 때까지 배양을 유지시킨다. 이러한 목적은 10 내지 160시간내에 일반적으로 성취된다.
L-아미노산을 측정하는 방법은 선행 기술분야에 공지되어 있다. 분석은 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 후의 연속적인 닌하이드린 유도체화로 진행시키거나[참조 문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190], 다른 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 역상 HPLC에 의해 진행시킬 수 있다[참조 문헌: Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174].
하기의 미생물은 부다페스트 조약에 따라 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen; DSMZ, Braunschweig, Germany)에 DSM 13048로서 기탁되었다:
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 S17-1/pK18mobsacBㅿcsp1 .
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명될 것이다.
실시예 1
csp1 유전자의 결실 돌연변이유발용 결실 벡터의 제조
에이크만스(Eikmanns) 등[참조 문헌: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법을 사용하여 균주 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 분리시킨다. 씨. 글루타미쿰에 대한 csp1 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 뉴클레오타이드 서열 데이타베이스로부터 g40486의 승인 번호로 입수할 수 있다. 공지된 서열을 기본으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응용으로 하기 올리고뉴클레오타이드를 선택한다:
csp1-10: 5' GAT CTA G(GA TC)C CGA TGA GCG CGT CCA TGT GT 3'
csp1-11: 5' GAT CTA G(GA TC)C TCG ACC TTG CGG TGC TGC TT 3'
csp1-del: 5' GGA ATA CGT AGC CAC CTT CGG TCC CGA AAG TTC CCC GCT T 3'
상기한 프라이머를 MWG 바이오텍(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)사에서 합성하고, PCR 반응은 베링거(Boehringer)의 Pwo 폴리머라제를 사용하여 카레만의 표준 PCR 방법(Karreman, BioTechniques 24: 736-742, 1998)에 따라 수행한다. 프라이머 csp1-10 및 csp1-11은 각각 제한효소 BamHI에 대한 삽입된 제한 부위(이 부위는 상기에서 괄호안에 나타내었다)를 포함한다. csp1 유전자의 1690bp가 결실된, 크기가 약 0.9kb인 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 분리시킨다.
증폭된 DNA 단편은 제한효소 BamHI으로 절단하고 아가로스 겔(0.8%)상에서 정제한다. 플라스미드 pK18mobsacB[참조 문헌: Jager et al., Journal of Bacteriology, 1: 784-791 (1992)]도 또한 제한효소 BamHI으로 절단한다. 플라스미드 pK18mobsacB 및 PCR 단편을 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 S17-1[참조 문헌: Simon et al., 1993, Bio/Technology 1: 784-791]은 연결 배치를 사용하여 전기영동시킨다[참조 문헌: Hanahan, in DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]. 플라스미드를 포함한 세포는 25㎎/ℓ의 카나마이신이 보충된 LB 한천상에 형질전환 배치를 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y., 1989]. 플라스미드 DNA는 퀴아진(Giagen)의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 형질전환체로부터 분리시키고 제한효소 BamHI을 사용하여 제한 부위를 확인한 다음, 아가로스 겔(0.8%)상에서 전기영동시킨다. 플라스미드는 pK18mobsacBㅿcsp1이라 명명한다. 균주는 이. 콜라이 S17-1/pK18mobsacBㅿcsp1으로 지정하고 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌(DSMZ, Braunschweig, Germany)에 DSM 13048로서 기탁한다.
실시예 2
씨. 글루타미쿰 야생형 R167내로 csp1 유전자의 결실 돌연변이유발
실시예 2에서 pK18mobsacBㅿcsp1로 명명된 벡터는 타우치 등(Tauch et al.)의 전기천공법[참조 문헌: FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)]을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 R167내에 전기천공시켜 도입한다[참조 문헌: Liebl et al. (1989) FEMS Microbiological Letters 65: 299-304]. 균주 R167은 제한 부위가 결핍된 씨. 글루타미쿰 야생형 균주이다. 벡터 pK18mobsacBㅿcsp1는 씨. 글루타미쿰내에서 독립적으로 복제될 수 없으므로 염색체내에 통합되는 경우에만 유지될 수 있다. pK18mobsacBㅿcsp1가 염색체내에 통합된 클론은 15㎎/ℓ의 LB 배지상에 전기천공 배치를 플레이팅시켜 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 성장한 클론은 25㎎/ℓ의 카나마이신이 보충된 LB 한천상에 플레이팅하고 33℃에서 16시간 동안 배양한다. csp1 유전자의 완전한 염색체성 복제물을 갖는 플라스미드를 절제하기 위해, 클론을 10% 슈크로스가 있는 LB 한천상에서 배양한다. 플라스미드 pK18mobsacB는 슈크로스를, 씨. 글루타미쿰에 대해 독성을 갖는 레반슈크라제로 전환시키는 sacB 유전자 복제물을 포함한다. 따라서, 슈크로스가 있는 LB 배지상에서 성장하는 클론만이, 통합된 pK18mobsacBㅿcsp1이 절제된 클론이다. 플라스미드 절제는 csp1 유전자의 완전한 염색체성 복제물 절제 또는 내부 결실을 갖는 불완전한 복제물의 절제에 의해 수행할 수 있다. csp1의 불완전한 복제물이 염색체내에서 유지된다는 것을 입증하기 위해, 플라스미스 pK18mobsacBㅿcsp1 단편은 "필터 하이드리드화용 딕 시스템 사용자 지침서(DIG System Users Guide for Filter Hybridization)"에 따른 방법(베링거 만하임 게엠베하; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993)을 사용하여 딕 하이드리드화 키트(Dig hybridization kit; Boehringer)로 표지시킨다. 잠재적인 결실 돌연변이체의 염색체 DNA는 에이크만스 등의 방법[참조 문헌: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 따라 분리시키고, 각 경우에 제한효소 EcoRI으로 절단한다. 생성된 단편은 아가로스 겔 전기영동으로 분리시키고, 딕 하이브리드화 키트(Boehringer)를 사용하여 68℃에서 하이브리드화시킨다. 대조 균주로부터는 대략 6500bp 및 대략 4000bp의 2개의 하이브리드화 단편이 수득되지만, 돌연변이체로부터는 대략 6500bp 및 대략 3200bp의 2개의 하이브리드화 단편이 수득된다. 균주 R167은 csp1 유전자의 완전한 복제물이 손실되어 있고 그 대신에 대략 1690bp가 결실된 불완전한 복제물만을 갖는다. 이 균주는 씨. 글루타미쿰 R167ㅿcsp1로 지정한다.
실시예 3
라이신 생산
실시예 2에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM167ㅿcsp1를 라이신 생산용으로 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양물 상층액의 라이신 함량을 측정한다.
이를 위해, 균주는 한천 플레이트상에서 33℃에서 33시간 동안 먼저 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양으로부터 개시하여, 예비배양물을 접종한다(100㎖들이 에를렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크중 배지 10㎖). 상기 예비배양용 배지로서 완전 배지 CgIII를 사용한다. 예비배양물은 240rpm의 진탕기상에서 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 주 배양물은 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1 OD가 되도록 상기 예비배양물로부터 접종시킨다. 주 배양물용 배지로는 배지 MM을 사용한다.
배지 MM
CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ
MOPS 20g/ℓ
글루코스(개별적으로 오토클레이브함) 50g/ℓ
염:
(NH4)2SO425g/ℓ
KH2PO40.1g/ℓ
MgSO4*7H20 1.0g/ℓ
CaCl2*2H2O 10㎎/ℓ
FeSO4*7H2O 10㎎/ℓ
MnSO4*H2O 5.0㎎/ℓ
바이오틴(멸균-여과시킴) 0.3㎎/ℓ
티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2㎎/ℓ
CaCO325g/ℓ
CSL, MOPS 및 염수는 암모니아수를 사용하여 pH를 7로 조절하고 오토클레이브시킨다. 이어서 무수-오토클레이브시킨 CaCO3와 함께 멸균 기질 및 비타민 용액을 가한다.
유동 스포일러를 갖는 100㎖들이 에를렌메이어 플라스크중 10㎖ 용적으로 배양을 실시한다. 배양은 33℃ 및 80%의 대기 습도하에 수행한다.
48시간 후, 바이오멕(Biomek) 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660nm의 측정 파장에서 OD를 측정한다. 형성된 라이신의 양은 이온 교환 크로마토그래피와 닌하이드린 검출법을 사용하는 칼럼후 유도체화에 의해, 에펜도르프-바이오트로닉(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)의 아미노산 분석기를 사용하여 측정한다.
시험 결과는 표 1에 나타내었다.
균주 OD(660) 라이신 HCl(g/ℓ)
R167 13.8 0.00
R167ㅿcsp1 12.6 0.99
도면 및 명세서에서의 약어 및 명칭은 다음과 같이 정의된다. 상기한 길이는 대략적인 것으로 간주되어야 한다.
sacB: sacB 유전자
oriV: 복제 오리진 V
KmR: 카나마이신 내성
BamHI: 제한효소 BamHI의 제한 부위
csp1': 내부적으로 1690bp가 결실된 csp1 유전자의 불완전한 단편
본 발명의 csp1 유전자가 감쇠된 코리네형 세균을 사용하면 발효에 의해 L-라이신을 보다 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (9)

  1. a) 적어도 csp1 유전자가 감쇠된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균을 발효시키는 단계;
    b) 목적하는 L-아미노산을 배지 또는 세균 세포내에 축적시키는 단계; 및
    c) L-아미노산을 분리시키는 단계를 수행함을 특징으로하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로에 있는 다른 유전자를 추가로 증폭시킨 세균이 사용되는 방법.
  3. 제1항에 있어서 목적하는 L-아미노산 형성을 감소시키는 대사 경로를 적어도 부분적으로 억제시킨 세균이 사용되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, csp1 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현이 감소되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 csp1이 암호화하는 폴리펩타이드(효소 단백질)의 촉매적 특성이 감소되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 감쇠를 실시하기 위하여 이. 콜라이 중에 DSM 13048로 기탁된, 도 1에 나타낸 벡터 pK18mobsacBㅿcsp1를 이용한 통합 돌연변이유발 공정이 사용되는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    7.1 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자;
    7.2 S-(2-아미노에틸)시스테인 내성을 부여하는 DNA 단편;
    7.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자;
    7.4 테트라디하이드로피콜리네이트 석시닐라제를 암호화하는 dapD 유전자;
    7.5 석시닐디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자;
    7.6 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자;
    7.7 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자; 및
    7.8 라이신 방출자를 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 동시에 과발현시키거나 증폭시킨 세균을 발효시킴으로써 L-라이신을 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    8.1 포스포에놀피루베이트 카복시카이나제를 암호화하는 pck 유전자 및
    8.2 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 동시에 감쇠시킨 세균을 발효시킴으로써 L-라이신을 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 속의 미생물이 사용되는 방법.
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