CN102399835A

CN102399835A - 一种微生物发酵生产l-苯丙氨酸的方法

Info

Publication number: CN102399835A
Application number: CN2011103114674A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 张传志; 堵国成; 康振; 周景文; 王天文
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2012-04-04

Abstract

一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸(Phe)的方法，属于代谢工程领域。本发明采用载体pXMJ19，将来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶DS的基因aroG在谷氨酸棒状杆菌模式菌株ATCC 13032中过量表达，获得了一株产L-Phe的谷氨酸棒状杆菌工程菌株C.glutamicum/aroG。过量表达aroG基因提高了L-Phe合成途径中的前提物质3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的积累，从而大幅度提高了L-Phe产量，最终通过诱导表达aroG基因，L-Phe提高到了0.61g/L，而出发菌株ATCC 13032作为对照菌株在整个发酵过程中检测不到L-Phe的积累。

Description

一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，特别是一种利用重组谷氨酸棒杆菌生产L-苯丙氨酸的方法。

背景技术

苯丙氨酸(Phenylalanine)，即D，L-α-氨基-β-苯基丙酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，其中具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)(图1-1)，比旋光度为-35.1°。L-Phe又名L-苯基-氨基丙酸，常温下为白色或无色结晶性粉末固体，水中溶解度为29.6g/L，难溶于甲醇、乙醇和乙醚。L-Phe在自然界中广泛存在于卵、乳和动物蛋白中，含量5％-6％；L-Phe也存在于植物性蛋白质中，含量约为1％。

表1-1L-Phe及其衍生物的主要用途

L-Phe是人和动物体内不能合成的8种必需氨基酸之一，也是高甜度低热量的新型甜味剂阿斯巴甜的重要组成部分。作为一种重要的生物化工产品，L-Phe在食品、饲料添加剂以及医药等领域具有广泛的应用，如表1-1所示。

20世纪80年代以来，随着氨基酸类抗癌药物和营养保健品的开发应用，尤其是阿斯巴甜的广泛生产与使用，国际市场对L-Phe的需求快速增长。据悉，2005年全球需求量为3万吨，实际年产量只有1.4万吨，而2006年L-Phe的需求量已达到10万吨左右，且有逐年上涨的趋势。随着市场需求的不断增长，L-Phe的生产受到越来越多的关注。L-Phe主要由化学合成法、酶法和微生物发酵法等3种方法来生产。化学合成法因其生产路线长、副产物多、且产物为消旋体不宜推广使用。酶法主要是由化学合成的类氨基酸前体经过微生物细胞内酶系高效专一地催化合成L-Phe。酶法生产工艺简单、产物浓度较高、纯化步骤简便且生产能力较强，是目前工业化生产L-Phe的主要方法之一。近年来，由于底物和酶等主要原料成本高、来源有限，反应过程中酶稳定性差等缺点，酶法生产L-Phe也受到了很大制约。发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-Phe的一种方法，具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高等优点。实际上，早在20世纪60年代，日本中山公司用糖质发酵制备L-Phe获得了成功，并由协和发酵公司实现了工业化生产。随着代谢工程、发酵工程等相关技术的不断发展，发酵法生产L-Phe受到国内外研究者的关注并得到了广泛深入的研究，成为目前国内外工业化生产L-Phe的主要方法。

L-Phe、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)属于芳香族氨基酸，只能由植物和微生物合成。可用于生产L-Phe的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸短杆菌(Brevibacterium glutamicum)和乳糖发酵短杆菌(Brebibacterium lactofermentum)等。其中E.coli和C.glutamicum是发酵法生产L-Phe的主要菌种。在C.glutamicum中，以葡萄糖为底物的L-Phe生物合成途径如图1-2所示。其中，由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases，DS)的催化下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。在C.glutamicum中DS酶仅由aroG编码，在Escherichia coli DS酶由三种基因aroF、aroG和aroH所编码，酶活组成比例为aroF∶aroG∶aroH＝80∶1∶20。第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase，CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenate dehydratase，PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因编码的双功能酶，受到产物L-Phe的反馈抑制。pheA基因的表达受到操纵子介导的阻遏和衰减调控。此外，L-Phe合成和转运有关的酶的表达还受到调控基因tyrR编码的阻遏蛋白TyrR的反馈阻遏。

有文献报道，Wu等人将来自E.coli的aroG、pheA和tyrB在Brevibacterium flavum中共表达，同时表达用于其前体物质合成的PEP合成酶(ppsA)和PEP羧化酶(pckA)，实现了5.39g/L的L-Phe产量。未见在谷氨酸棒状杆菌代谢改造发酵生产L-Phe相关专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸的方法，通过改造发酵菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)，以提高L-Phe合成途径中的前提物质3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的积累，进而有效发酵生产L-Phe。

所述重组谷氨酸棒杆菌过量表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸1-磷酸合成酶DS。

苯丙氨酸的测定：高效液相色谱(HPLC)。

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)；

色谱条件：

色谱柱：ZORBAXEclipse-AAA 4.6x150mm 3.5um PN963400-902

流动相：A：40mM Na₂HPO₄pH 7.8(5.5g Na₂HPO₄+1L水)，用NaOH溶液调pH至7.8。B：ACN∶MeOH∶水(45∶45∶10，v/v/v)

流速：2mL/min

柱温：40℃

进样量：5μL

紫外检测器波长：338nm

样品制备：5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测L-Phe用。测L-Phe时，取1mL上清液移入5mL容量瓶中，去5％三氯乙酸定容至刻度线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，葡萄糖5，斜面培养基添加琼脂20，pH 7.0；

发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖25，玉米浆35，硫酸铵5，尿素2，磷酸二氢钾1，七水合硫酸镁0.5，pH 7.0-7.2，装液量20mL/250mL。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖130，硫酸铵25，玉米浆8，磷酸二氢钾1，七水合硫酸镁0.5，碳酸钙20，pH 6.8-7.0，装液量20mL/250mL。

摇瓶培养条件为：

将30℃、200rpm下培养18h的发酵种子以8％的接种量转入发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养72h。

谷氨酸棒状杆菌电转化法：

10μL质粒加入80μL C.glutamicum感受态细胞，冰浴5-10min，转入预冷的1mm电转杯，转化条件：电压1.8kV，电击时间为5ms；电击完毕后，迅速加入1mL冰预冷的9.1％山梨醇BHI溶液将菌体混匀，转至1.5mL的EP管中，46℃热击6min，放于30℃100rpm培养1h，8000rpm离心2min，吸出800～900μL上清，将剩余约200μL菌体悬液涂布于筛选培养基。

本发明采用将来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶DS的基因aroG通过表达载体pXMJ19，过量表达于谷氨酸棒状杆菌模式菌株ATCC 13032中，获得了一株产L-Phe的容氨酸棒状杆菌重组菌C.glutamicum/aroG。过量表达aroG基因提高了L-Phe合成途径中的关键前提物质3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的积累，可有效促进L-Phe产量的提高。摇瓶发酵结果表明，通过诱导表达，重组菌C.glutamicum/aroG发酵液中L-Phe的检测浓度最高为0.61g/L，而出发菌株C.glutamicum ATCC 13032发酵液中整个发酵过程则检测不到L-Phe的产量，结果表明可以通过代谢工程的手段过量表达L-Phe合成代谢途径中的关键酶基因aroG的方法，提高L-Phe的发酵产量。

附图说明

图1：E.coli/aroG的转化子质粒提取、PCR验证以及双酶切验证。泳道1：1kb Ladder；泳道2：DL2000Makers；泳道3：pXMJ19-aroG；泳道4：aroG PCR验证；泳道5：pXMJ19-aroG双酶切验证。

图2：C.glutamicum/aroG的转化子质粒提取、PCR验证以及双酶切验证。泳道1：1kb Ladder；泳道2：DL2000Markers；泳道3：pXMJ19-aroG双酶切验证；泳道4：pXMJ19-aroG双酶切验证。

具体实施方式

实施例1重组菌的构建及鉴定

根据Genebank登陆序列号NC_003450.3，采用化学全合成或PCR扩增方法得到aroG基因，克隆到穿梭载体pXMJ19(Jakoby，M.，C.E.Ngouoto-Nkili，and A.Burkovski，Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnology Techniques，1999.13(6)： p.437-441.)，用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化宿主菌E.coli JM109，转化菌液涂布在LB(Cm^r)平板，37℃过夜培养，挑选阳性克隆子提取质粒(图1-泳道3)，用酶切(图1-泳道4)和PCR(图1-泳道5)方法验证，并送上海生工测序验证，最终获得含有aroG基因的穿梭表达质粒pXMJ19-aroG(图1-泳道3)。将重组质粒pXMJ19-aroG电转化C.glutamicum感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行双酶切验证(图2-泳道3，4)。

实施例2发酵生产L-Phe

重组菌C.glutamicum/aroG与出发菌进行发酵实验对比。重组菌C.glutamicum/aroG进行诱导摇瓶发酵72h L-Phe最高产量达到最大值0.61g/L，而出发菌株C.glutamicum ATCC13032发酵液发酵过程中则检测不到L-Phe产量。

Claims

1.一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于将重组谷氨酸棒杆菌活化后制备发酵种子，发酵种子以8％的接种量转入发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养72h。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组谷氨酸棒杆菌过量表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶DS。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于活化用培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，葡萄糖5，斜面培养基添加琼脂20，pH 7.0。

4.权利要求2或3所述的方法，其特征在于发酵种子用培养基组成为(g/L)：葡萄糖25，玉米浆35，硫酸铵5，尿素2，磷酸二氢钾1，七水合硫酸镁0.5，pH 7.0-72，装液量20mL/250mL。