CN113462623A - 微生物发酵法制备d-丙氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法制备D‑丙氨酸的方法。本发明首先构建一株生产D‑丙氨酸的基因工程菌，所述工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，通过敲除丙氨酸消旋酶基因alr和L‑丙氨酸转氨酶alaT；过表达meso‑二氨基庚二酸脱氢酶编码基因；敲除iolR阻遏蛋白基因同时基因组整合表达葡萄糖激酶基因glk1；整合来自大肠杆菌的edd和eda基因获得。该菌株以葡萄糖为底物直接发酵法生产D‑型氨基酸，成本低，技术简单，5L发酵罐中D‑丙氨酸产量能够达到50‑60g/L。另外，发酵法高效合成D‑型氨基酸属于开创性研究，借此方法，可以对发酵法进行无限扩展，低成本、高效率合成多种D‑型氨基酸。

Description

微生物发酵法制备D-丙氨酸的方法

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法制备D-丙氨酸及其他D-型氨基酸的方法。

背景技术：

天然蛋白质的基本手性单元均为L-型氨基酸，一般认为D-型氨基酸在自然界中极少存在，但是随着分析方法的发展，人们相继在多种生物体内发现了D-型氨基酸。以微生物为例，目前发现了20余种D-型氨基酸，它们存在于细胞壁的肽聚糖、多肽抗菌素和麦角碱等成分中。

由于D-型氨基酸在生化性质方面具有自身显著的特性，已被广泛应用于合成抗生素和生理活性肽，并在食品、农药、化妆品、尤其是医药方面发挥着越来越重要的作用。D-型氨基酸及其衍生物是合成抗菌、抗病毒药物、杀虫剂的重要中间体。D-型氨基酸为NRPS合成多肽类次级代谢物的重要原料，包括多种多肽类抗生素。D-型氨基酸还可以用于食品调味剂、营养添加剂、甜味剂、保鲜剂、防腐剂、食品发色剂、食品香料等产品。D-丙氨酸具有可预防肾结石、协助葡萄糖代谢，缓和低血糖等生理功能。用作营养增补剂，可有效调节营养平衡。D-丙氨酸是维生素B6的原料，也是合成二肽甜味剂L-天冬氨酸-D-丙氨酸的原料。L-天冬氨酸-D-丙氨酸的甜度是蔗糖的2000倍，阿斯巴甜的10倍。多种D-型氨基酸具有甜味，如D-缬氨酸、D-苯丙氨酸和D-色氨酸的甜度也远远超过蔗糖。作为一种重要的手性源，D-丙氨酸可用作手性药物、手性添加剂、手性助剂等，广泛应用于制药及食品行业。D-谷氨酸能够加速康复、延缓皱纹形成和皮肤衰老。由于脑组织中含有D-谷氨酸，其可能参与视觉、听觉和镇痛过程。聚谷氨酸能够以L-谷氨酸或D-谷氨酸作为合成单体。D-苯丙氨酸和D-对羟基苯甘氨酸是生产治疗缺铁性心脏病、心力衰竭和糖尿病药物的重要原料，如果作为β-内酰胺类抗生素的组成部分，则难以被细菌降解，不至于产生抗药性。D-脯氨酸是一种抗艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的原料之一。多种D-型氨基酸具有抑制细菌生物膜形成的作用，D-丝氨酸可作为神经递质，D-天冬氨酸可以增加胶原含量和提高皮肤细胞抗氧化作用。D-丝氨酸和D-天冬氨酸具有潜在的药用价值，D-型氨基酸可以用来开发新型人工半合成抗生素。

D-型氨基酸的制备方法有化学合成法、物理拆分法和生物合成法。化学合成法主要通过化学的方法直接合成D-型氨基酸，但是过程复杂、产物纯度低，不利于大规模生产。对映体拆分法主要通过色谱柱、离子交换树脂等方法对D，L-氨基酸进行拆分，但是成本高、产量低，不适合大规模生产。

目前D-型氨基酸常通过生物法来生产，主要为酶法。酶法合成D-型氨基酸的重要思路是酶法拆分两个对映体，可以概括为3大类酶。第一类为D-立体特异性氨基水解酶，它们可以拆分外消旋氨基酸酰胺生成相应的D-型氨基酸，包括N-酰基-D-氨基酸氨基水解酶、D-氨基酸酰胺酶、D-氨基肽酶、D-羧肽酶等。利用氨基酰化酶能够拆分制备的D-型氨基酸较为广泛，包括D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸和D-缬氨酸等。利用这类酶时，首先需要化学合成酰基化的D,L对映异构体。第二类酶为D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶组合，利用海因酶最成功的案例是D-苯丙氨酸和D-对羟基苯甘氨酸的生产，另外还包括D-色氨酸、D-酪氨酸、D-苯丙氨酸、D-缬氨酸、D-丙氨酸和D-甲硫氨酸等。第三类为L-型氨基酸代谢酶类，利用不对称降解原理分解L-型氨基酸，最终得到D-型氨基酸及其他产物。其中有代表性的为L-氨基酸氧化酶(L-AAO)，可以用来制备D-丙氨酸、D-谷氨酸、D-精氨酸和D-高丝氨酸等。利用L-AAO拆分D,L-异构体的理论转化率只有50％。另外，利用L-谷氨酸脱羧酶可以选择性降解L-谷氨酸为γ-氨基丁酸(GABA)，可以拆分得到D-谷氨酸和GABA。L-色氨酸酶可以选择性分解L-色氨酸为吲哚丙酮酸和氨。这类酶可以和消旋酶配合使用，首先以L-型氨基酸为底物制备内消旋D,L-型氨基酸，再合成相应的D-型氨基酸。

拆分法制备D-型氨基酸就方法而言是可行的，经过多年发展并沿用至今。其缺点是成本高(需要先合成D,L-氨基酸)、步骤长(通过需经D,L-氨基酸衍生化、拆分再还原等过程)、收率低(非目标对映体若不消旋后再拆分则其理论收率为50％)。如能像L-型氨基酸一样，建立从葡萄糖出发的直接发酵法合成D-型氨基酸具有重要的价值。

近来，也报道了一些D-立体选择性酶直接催化酮酸合成相应的D-型氨基酸，如D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸转氨酶(D-AAT)。D-氨基酸脱氢酶通常是膜结合蛋白，阻碍了其应用。后来发现赖氨酸合成途径中meso-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH)可以催化一系列酮酸合成D-型氨基酸，其以NADPH为辅酶。D-氨基酸转氨酶能够以D-谷氨酸为氨基供体，催化酮酸合成相应D-型氨基酸，同时生成α-酮戊二酸。引入谷氨酸脱氢酶和消旋酶，可以再生D-谷氨酸。

应用这两种D-立体选择酶的酶法合成D-型氨基酸时，底物酮酸的价格昂贵。而且meso-DAPDH需要辅酶NADPH，制约了其应用。目前发酵法制备D-型氨基酸少有报道，还有一个原因是对于多数微生物来说，D-型氨基酸抑制细胞生长，选择具有较好耐受性的出发菌株尤为关键。

本申请首次构建了以葡萄糖为碳源的D-型氨基酸直接发酵法生产工艺，利用meso-DAPDH实现了从丙酮酸到D-丙氨酸的高效合成。D-AAT能够以D-谷氨酸为氨基供体催化丙酮酸合成D-丙氨酸，尝试以D-丙氨酸为氨基供体，催化α-酮戊二酸合成D-谷氨酸；那么再利用meso-DAPDH催化丙酮酸再生D-丙氨酸。利用该技术路线还可以合成D-精氨酸、D-鸟氨酸和D-苯丙氨酸等。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从葡萄糖出发直接发酵法合成D-型氨基酸的工艺，尤其是利用meso-DAPDH高效合成了D-丙氨酸。通过该技术路线，理论上可以合成D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、D-精氨酸、D-鸟氨酸和D-苯丙氨酸等。

本发明提供的技术方案之一，是谷氨酸棒杆菌ATCC13032在发酵法生产D-丙氨酸中的应用，该菌株可耐受40g/L以上的D-丙氨酸；

本发明提供的技术方案之二，是一株生产D-丙氨酸的基因工程菌，所述工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，为了减少D-丙氨酸向L-丙氨酸的转化，以及减少L-丙氨酸的生成，敲除丙氨酸消旋酶基因alr和L-丙氨酸转氨酶基因alaT；过表达meso-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH)；敲除iolR阻遏蛋白基因同时基因组整合表达葡萄糖激酶基因glk1，激活IolT葡萄糖摄取通道，强化细胞对葡萄糖的吸收；整合来自大肠杆菌的edd和eda基因，在基因组水平引入异源ED途径强化前体物丙酮酸的供应。

进一步地，所述alr基因在NCBI数据库的Gene ID:58309490；

进一步地，所述alaT基因在NCBI数据库的Gene ID:58309132；

进一步地，所述iolR基因在NCBI数据库的Gene ID:58310871；

进一步地，所述glk1基因在NCBI数据库的Gene ID:58308863；

进一步地，所述edd基因在NCBI数据库的Gene ID:946362；

进一步地，所述eda基因在NCBI数据库的Gene ID:946367；

进一步地，所述meso-DAPDH编码基因如序列表SEQ ID NO.1、2、3或4所示；

优选地，所述meso-DAPDH编码基因如序列表SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述meso-DAPDH编码基因通过pXtuf质粒进行过表达，所述pXtuf质粒是通过将pXMJ19质粒自身Ptac启动子替换为Ptuf启动子(SEQ ID NO.5)所得。

更进一步地，所述edd和eda基因的整合位点为cg1895位点，更进一步地，采用Ptuf启动子进行表达。

本发明提供的技术方案之三，是上述基因工程菌发酵法生产D-丙氨酸的方法，具体如下：

将活化后的菌种接入装有种子培养基的发酵罐中，32℃培养至OD为20-30时，按照20％的接种量，接入发酵培养基，继续在pH 6.7-7.2、温度32-34℃、溶氧10-40％的条件下发酵培养30-48h，最终菌株在5L发酵罐中D-丙氨酸产量达到50-60g/L。

进一步地，种子培养基组成为：葡萄糖40-60g/L，KH₂PO₄ 2-3g/L，MgSO₄·7H₂O1.2-2g/L，MnSO₄·H₂O 10-20mg/L，FeSO₄ 10-20mg/L，V_B1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉5-7g/L，蛋氨酸0.3-0.5g/L，玉米浆20-30g/L，豆粕水解液20-30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

进一步地，发酵培养基组成为：葡萄糖60g-70g/L，KH₂PO₄ 2.5-3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.6-2g/L，MnSO₄·H₂O 10-20mg/L，FeSO₄ 10-20mg/L，V_B1 0.5mg/L，VH 0.05-0.1mg/L，谷氨酸2-4g/L，蛋氨酸0.3-0.5g/L，玉米浆20-30g/L，豆粕水解液20-30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

有益效果：

一般微生物细胞的生长受到D-型氨基酸的抑制作用，本发明发现谷氨酸棒杆菌ATCC 13032能够耐受高浓度的D-丙氨酸。通过代谢工程改造宿主细胞，且表达不同来源meso-DAPDH后直接发酵法高效率合成D-丙氨酸，以葡萄糖为底物直接发酵法生产D-型氨基酸，成本低，技术简单，5L发酵罐中D-丙氨酸产量能够达到50-60g/L。另外，发酵法高效合成D-型氨基酸属于开创性研究，借此方法，可以对发酵法进行无限扩展，低成本、高效率合成多种D-型氨基酸。

附图说明：

图1 D-丙氨酸耐受性的测试结果

其中，a-平板划线；b-摇管培养；

图2过表达meso-DAPDH的发酵结果；

图3强化丙酮酸积累的发酵结果；

图4菌株S-4/pXtuf-St*的5L发酵罐过程曲线。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。

实施例1 D-型氨基酸耐受菌株的筛选

从枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌这三种工业常用发酵菌株中选出四株菌，具体为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168、大肠杆菌(E.coli)BL21、大肠杆菌(E.coli)W3110、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032。

将四株菌分别接种在含有D-丙氨酸的梯度平板中，从低浓度向高浓度(0-50g/L)划线，24h后观察生长情况如图1(a)。之后，又对其最高耐受浓度进行调研，以CGXII基本培养基进行摇管培养，分别将D-丙氨酸浓度设定为1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、50g/L、100g/L，24h结果如图1(b)。

根据梯度平板显示，枯草芽孢杆菌对D-丙氨酸的耐受浓度约为8g/L，大肠杆菌的耐受浓度约为4-6g/L，而谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的耐受值超过40g/L；将ATCC 13032用CGXII培养基的摇管培养后，发现当D-丙氨酸的添加浓度在1-10g/L范围内，菌体生长正常；20g/L时，OD在0.8-1.2之间；50g/L时，OD在0.4-0.8之间；达到100g/L时，菌体几乎不生长，OD仅有0.1左右。

实施例2 D-丙氨酸生产菌株构建

以C.glutamicum ATCC 13032为出发菌，进行了rpsL^K43R点突变使得菌株具备链霉素抗性，采用自杀质粒pK18mobrpsL(构建方法见：An update of the suicide plasmid-mediated genome editing system in Corynebacterium glutamicum[J].MicrobialBiotechnology，2019，12(5)：907-919.)介导的谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统进行基因组编辑。

(1)首先在基因组上敲除丙氨酸消旋酶基因alr，将敲除基因alr的上、下游同源臂与pK18mobrpsL的双酶切(XbaI和KpnI)载体进行同源重组，得到的pK18rpsL-Δalr质粒电转化到出发菌的感受态中，用引物alr-jd-1和alr-jd-2鉴定双交换，得到菌株S-1；

(2)继续在基因组上敲除丙氨酸转氨酶基因alaT，将敲除基因alaT的上、下游同源臂与pK18mobrpsL的双酶切(XbaI和KpnI)载体进行同源重组，得到的pK18rpsL-ΔalaT质粒电转化到S-1的感受态中，用引物alaT-jd-1和alaT-jd-2鉴定双交换，得到菌株S-2；

(3)随后在S-2基础上利用pXtuf质粒(所述pXtuf质粒是通过将pXMJ19质粒自身Ptac启动子替换为Ptuf启动子(SEQ ID NO.5)所得)过表达来源于Symbiobacteriumthermophilum、嗜热球形脲芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH)的突变体：Stmeso-DAPDH(SEQ ID NO.1)、Utmeso-DAPDH(SEQ ID NO.2)和Cgmeso-DAPDH(SEQ IDNO.3)，以及野生型Cgmeso-DAPDH(SEQ ID NO.4)，以装载pXtuf空质粒的S-2菌株作为对照，将五株菌进行摇瓶培养，pH 6.7-7.2，温度为32-34℃、转速220rpm，48h测定D-丙氨酸的产量，如图2。

根据摇瓶结果，过表达meso-DAPDH后，D-丙氨酸产量明显上升，其中来自Symbiobacterium thermophilum的突变基因效果最好，产量达到18.6g/L。

(4)在过表达了来自Symbiobacterium thermophilum的Stmeso-DAPDH编码基因，也即S-2/pXtuf-St*菌株的基础上继续改造。

为增强葡萄糖的摄取，在基因组上敲除iolR基因，并同时在该基因位点上整合葡萄糖激酶基因glk1，用强启动子Psod(SEQ ID NO.6)进行表达，用引物glk1-jd-1和glk1-jd-2鉴定双交换，得到菌株S-3/pXtuf-St*；

随后引入ED途径，缩短丙酮酸的合成路径，具体做法为在cg1895位点整合来自大肠杆菌的edd和eda基因，采用tuf基因(NCgl0480)的启动子Ptuf启动子进行表达(将eddeda基因插入pXtuf质粒的多克隆位点处，再用一对引物将Ptuf和eddeda同时从质粒上克隆下来，得到Ptuf-eddeda片段，再将该片段整合至整合位点)，用引物cg1895-jd-1和cg1895-jd-2鉴定，得到菌株S-4/pXtuf-St*。将上述三株菌进行摇瓶发酵，pH6.7-7.2，温度为32-34℃、转速220rpm，48h观察D-丙氨酸产量变化，如图3。

根据摇瓶发酵数据显示，菌株S-4/pXtuf-St*发酵生产D-丙氨酸的产量达到23g/L，将其进行5L发酵罐培养，将二代茄子瓶活化后的菌种接入装有种子培养基的发酵罐中，32℃培养至OD为20左右时，留下600mL种子液，按20％接种量加入发酵培养基，继续在pH6.7-7.2、温度32-34℃、溶氧10-40％的条件下发酵培养48h，测定D-丙氨酸的生成情况，如图4，发酵48h时，产量达到60g/L。

其中，D-丙氨酸上罐培养基配方如下：

种子培养基(1L)：葡萄糖40g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1.2g，MnSO₄·H₂O 10mg，FeSO₄ 10mg，VB1 0.5mg，VH 0.1mg，酵母粉5g，蛋氨酸0.3g，玉米浆30g(121℃，20min单独灭菌)，豆粕水解液20mL，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2，115℃灭菌15min。

发酵培养基(1L)：葡萄糖60g，KH₂PO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 1.6g，MnSO₄·H₂O 10mg，FeSO₄ 10mg，VB1 0.5mg，VH 0.05mg，谷氨酸2g，蛋氨酸0.4g，玉米浆30g(121℃，20min单独灭菌)，豆粕水解液30mL，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2，115℃灭菌15min。

使用高效液相色谱法测定样品中D-丙氨酸的含量，检测条件为：色谱柱

3126(D)-penicillamine(250×4.6mm)，流动相为2mM CuSO4和异丙醇以95:5的比例混合，柱温30℃；检测波长254nm；流速1.0mL/min。

标准曲线的制作：称取5g D-丙氨酸溶解到去离子水中定容至1000mL，即得到5g/L的L-丙氨酸标品。将5g/L的标品稀释一定的倍数，得到0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、1g/L和2g/L的样品，用上述方法测定样品中的D-丙氨酸，得到不同浓度D-丙氨酸对应的峰面积，以

D-丙氨酸浓度作为横坐标，以峰面积作为纵坐标，做出标准曲线。

实施例3 5L罐发酵法制备D-丙氨酸

以实施例2制备的S-4/pXtuf-St*为生产菌株发酵生产D-丙氨酸：

将二代茄子瓶活化后的菌种接入装有种子培养基的发酵罐中，32℃培养至OD为30左右时，留下600mL种子液，按20％接种量加入发酵培养基，继续在pH6.7-7.2、温度32-34℃、溶氧10-40％的条件下发酵培养，发酵36h时，产量达到50g/L。

其中，D-丙氨酸上罐培养基配方如下：

种子培养基组成为：葡萄糖60g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O20mg/L，FeSO₄ 20mg/L，V_B1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉7g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆30g/L，豆粕水解液20-30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵培养基组成为：葡萄糖70g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O20mg/L，FeSO₄ 20mg/L，V_B1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，谷氨酸4g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆30g/L，豆粕水解液30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

所用引物列表

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 微生物发酵法制备D-丙氨酸的方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgcaaggcg ctctgctgtg cgtcccaacc cgctccgtcc cagagtacgc agaggctatg 240

ctccgccgtg gcatccacac cgtggattcc tacgacatcc acggtgatct ggctgatctc 300

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gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660

gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720

ggcatgccaa acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840

ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900

gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 4

<211> 963

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 4

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120

gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180

gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240

cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300

gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360

ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420

cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480

ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540

cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600

gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660

gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720

ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840

ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900

gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 5

<211> 368

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 5

gttaacagat cgtttagatc cgaaggaaaa cgtcgaaaag caatttgctt ttcgacgccc 60

caccccgcgc gttttagcgt gtcagtaggc gcgtagggta agtggggtag cggcttgtta 120

gatatcttga aatcggcttt caacagcatt gatttcgatg tatttagctg gccgttaccc 180

tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca 240

gtaactggca cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag gctgcttatc 300

acagtgaaag caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag 360

gaaagctt 368

<210> 6

<211> 246

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 6

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttaccc 246

Claims (7)

1.一株生产D-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，通过敲除丙氨酸消旋酶基因alr和L-丙氨酸转氨酶alaT；过表达meso-二氨基庚二酸脱氢酶编码基因；敲除iolR阻遏蛋白基因同时基因组整合表达葡萄糖激酶基因glk1；整合来自大肠杆菌的edd和eda基因获得。

2.如权利要求1所述的一株生产D-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述meso-DAPDH编码基因如序列表SEQ ID NO.1、2、3或4所示。

3.如权利要求1所述的一株生产D-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述glk1基因Gene ID为58308863；所述edd基因的Gene ID为946362；所述eda基因的Gene ID为946367。

4.如权利要求1所述的一株生产D-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，meso-二氨基庚二酸脱氢酶编码基因通过pXtuf质粒进行过表达。

5.权利要求1所述基因工程菌发酵法生产D-丙氨酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵方法如下：将活化后的菌种接入种子培养基中，32℃培养至OD为20-30时，按照20％的接种量，接入发酵培养基，在pH 6.7-7.2、温度32-34℃、溶氧10-40％的条件下发酵培养30-48h。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，种子培养基组成为：葡萄糖40-60g/L，KH₂PO₄2-3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2-2g/L，MnSO₄·H₂O 10-20mg/L，FeSO₄ 10-20mg/L，V_B10.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉5-7g/L，蛋氨酸0.3-0.5g/L，玉米浆20-30g/L，豆粕水解液20-30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基组成为：葡萄糖60g-70g/L，KH₂PO₄ 2.5-3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.6-2g/L，MnSO₄·H₂O 10-20mg/L，FeSO₄ 10-20mg/L，V_B1 0.5mg/L，VH 0.05-0.1mg/L，谷氨酸2-4g/L，蛋氨酸0.3-0.5g/L，玉米浆20-30g/L，豆粕水解液20-30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH7.0-7.2。

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