CN103667380A

CN103667380A - 合成d-氨基酸的一种新方法

Info

Publication number: CN103667380A
Application number: CN201210334554.6A
Authority: CN
Inventors: 朱敦明; 吴洽庆; 陈曦; 高秀珍; 刘卫东; 冯进辉
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明公开了一类新的来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-Diaminopimelate dehydrogenase(STDAPDH)应用于D-氨基酸合成的方法，即将获得的STDAPDH作为生物催化剂应用于合成D-氨基酸，尤其是D-丙氨酸的合成。该方法与现有的化学方法相比，具有操作简单、反应条件温和、对环境友好、高产率、高对映选择性等优点，本方法有可能应用于D-氨基酸尤其是D-丙氨酸的工业合成。

Description

合成D-氨基酸的一种新方法

技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种利用生物催化剂D-氨基酸脱氢酶以α-酮酸为底物合成D-氨基酸方法。

背景技术

氨基酸广泛存在于自然界中，除甘氨酸外，其他氨基酸有D-氨基酸和L-氨基酸两种异构体，它们在生物体内发挥着不同的生理作用。D-氨基酸约占自然界已发现的400多种氨基酸及其类似物的10％左右，(蒋耀忠，刘桂兰。D-苯丙氨酸的不对称合成[J].氨基酸杂志，1988，2：1-3)。随着科学研究的深入和各种新药的开发，人们对D-氨基酸的重要性也有了深入的认识，发现其在生命以及药物制备中具有L-氨基酸所不能替代的地位，其在医药、农药和食品等领域中的用途也正在被广泛、迅速的挖掘，D-氨基酸的开发利用已经成为氨基酸产业的一个新热点。

在各种D-氨基酸中，D-丙氨酸的应用更是广泛。在食品添加剂领域，D-丙氨酸与L-天冬氨酸合成天丙二肽(商品名为阿力甜，alitame)，其甜度是蔗糖的2000倍，对热、pH值稳定，可广泛用于食品工业、日用化学工业做甜味剂，具有极好的市场前景(Ellis，J.W.Journal of Chemical Education 1995,72(8)：671-675)。D-丙氨酸可作为杀菌剂精甲霜灵的合成原料之一(赵克健。中国化学药品大全[M]，第二版。北京：新时代出版社，1999)。丙氨酸在医药领域的应用也极为广泛。在新药开发中主要应用于以下一些方面：可应用于合成镇静药；孕妇药，用于预测早产、分娩的诊断剂和治疗剂；合成抗核苷药物，对艾滋病抑制剂有协助作用；合成抗癌药，用于临床治疗肿瘤和Alzheimer's疾病；合成艾滋病抑制剂，作为HIV抗体；合成DOTA，用于癌症的早期诊断；合成抗病毒抑制剂，用作HTLV和HIV病毒的抗体；合成抗真菌药，在牙膏中掺少许，可预防牙周炎等牙龈疾病；合成哌嗪衍生物，可促使血小板凝结；合成Tocainid及其衍生物，对心律失调有治疗作用；合成酶抑制剂，用于心血管疾病和心脏充血不足的治疗；合成四肽类药，可预防血吸虫病，将该药物添加在肥皂中预防效果十分明显(Meichsner C.，Riess G.，Kleim J.，et al，[P].EP657166，1995；Robl J.A.，Kronenthal D.R.，Goderey J.D.，Goderey J.D.，et al，[P].EP629627-A2，1994；Thompson R.J.，Bouwer H.G.，Portnoy D.A.，et al，[J].Infect Immun，1998，66(8)：3552-3561；Theodore L.J.，Reno J.M.，Gustavson L.M.，et al，[P].US2003099640-A1，2003；Carceller E.，Merlos M.，Giral M.，et al，[J].J.Med.Chem.，1993，36(20)：2984-2997；Franchini C.，Noja F.C.，Corbo F.，etal，[J].Chirality，1993，5(3)：135-142；Burnier J.P.，Gadek T.，Mcdowell R.et al，[P].W09217492-A1，1992；Dodge J.A.，Hauser K.L.，Heiman M.L.et al，[P].W09908699，1999.)。

合成D-氨基酸有外消旋体拆分法、化学合成法及生物法。目前，工业生产用的最多的还是外消旋体拆分法，但是外消旋体拆分的最高的产率也仅为50％，而近年来生物法，尤其是酶法转化以其无污染、成本低、产物光学纯度高的特点已经显示出广阔的市场前景。能够合成D-氨基酸的酶有很多种，D-氨基酸脱氢酶(D-amino acid dehydrogenaseDAADH EC.1.4.99.1)就是其中一种。但是D-氨基酸脱氢酶在自然界中的存在并非像L-氨基酸脱氢酶一样广泛，且大多以膜蛋白的形式存在。在已知的D-氨基酸脱氢酶中，meso-Diaminopimelate dehydrogenase(meso-二氨基庚二酸脱氢酶，meso-DAPDH，EC1.4.1.16)是赖氨酸合成途径中的一个关键酶，该酶可逆催化天然产物meso-Diaminopimelate D-构型氨基的氧化脱氨。此外该酶在自然界中存在较为普遍。由于该反应是可逆反应，因此理论上来说以相应的酮酸为底物，可以高对映选择性的合成D-氨基酸。但是目前文献中报道的meso-DAPDH仅对其天然底物meso-DAP表现出较高的活性。2006年，Vedha-Peters等人通过对来源于谷氨酸棒杆菌的meso-DAPDH进行定向进化，将其对丙酮酸的活力提高了13倍，尽管如此，其比活仅为0.12U/mg，且ee值仅为77％.(Vedha-Peter,K.M.，et al，[J]J.Am.Chem.Soc.，2006，128(33)：10923-10929.)

因此发现并且利用新型的meso-DAPDH是合成D-氨基酸的一条绿色、高效的合成方法，该方法为将来的D-型氨基酸的合成提供了参考，并将有可能实现D-氨基酸的大规模生产。

发明内容

本发明提供了一种操作简单、反应条件温和、转化率高的来源于Symbiobacteriumthermophilum的meso-Diaminopimelate dehydrogenase(STDAPDH)生物催化剂催化D-氨基酸尤其是D-丙氨酸的方法。

一种生物催化剂以α-酮酸及其衍生物和氨基化合物为底物合成对应的D-氨基酸的方法。

酶蛋白的获取步骤如下：

1.将Genbank中ID为AP006840.1的基因通过化学合成的方法获得基因全长；

2.通过聚合酶链式反应(PCR)在基因3`端添加6*His编码基因，以在目的蛋白N端融合表达组氨酸标签；

3.PCR获取的目的基因构建到pET32a(+)载体上，以E.coli BL21为宿主菌构建基因工程菌；

4.用适宜的培养基对构建的工程菌进行诱导培养，目标蛋白以可溶性形式存在于胞内；

5.目的蛋白经Ni柱亲和层析纯化。

酶标仪检测获得的纯酶在还原胺化方向的活力，检测方法如下：

底物配制20mM酮+200mM氯化铵(底物)溶液(最终pH为9.0左右)，NADPH 10mM溶液，反应温度为30℃。通过检测NADPH在340nm处的下降来反应酶活大小。一个酶活单位定义为在上述的检测条件下每min消耗1μmol NADPH所需要的酶量。结果如下：

通过上述数据可以看出，STDAPDH在还原胺化方向表现出很高的反应活力，尤其是对丙酮酸的活力，是目前文献中野生酶报道最高的。

纯化后的酶蛋白进行D-氨基酸合成反应的方法为：

将底物α-酮酸及其衍生物和氨基化合物与溶剂构成反应体系，加入生物催化剂STDAPDH后在20℃～60℃条件下，pH在6-11之间，反应4小时～72小时，制得光学纯的D-氨基酸。

每升反应体系中生物催化剂的用量为0.1g～100g，溶剂为单一溶剂或多种溶剂。

本发明发现，a-酮酸及其衍生物和氨基化合物在溶剂存在下可以通过STDAPDH的还原胺化作用，生成D-氨基酸，特别是以高达99％的转化率和99％的对映选择性得到D-丙氨酸。

所述的溶剂为水或缓冲溶液，助溶剂为二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺，二氧六环，甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃，正己烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，吡啶，甲苯中的一种或多种。

本发明具有如下优点：

本发明方法采用在一种溶剂或者是多种溶剂的混合溶剂中，利用STDAPDH的高度底物专一性和选择性的特点合成D-氨基酸，尤其是D-丙氨酸。

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，但是这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例：1

固体酶粉作为生物催化剂实现D-丙氨酸的合成

在10mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入1mmol丙酮酸，160mg(3mmol)氯化铵，STDAPDH酶粉20mg，20mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，5mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖800mg(4mmol)，37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入1.2mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6NHCl调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HCl洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率68％，对映体过量(ee)为＞99％。反应的结果如说明书附图1为Fmoc-L-丙氨酸的液相谱图，附图2为Fmoc-D-丙氨酸的液相谱图，附图3为实施例1的液相谱图，附图4为实施例1产物与Fmoc-L-丙氨酸混合样品的液相谱图，附图5为实施例1的产物¹H NMR。

实施例：2

固体酶粉作为生物催化剂实现D-缬氨酸的合成

在10mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入1 mmol 3-甲基2-羰基丁酸或者是钠盐，160mg(3mmol)氯化铵，STDAPDH酶粉20mg，20mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，5mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖800mg(4mmol)37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入1.2mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6 N HCl调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HCl洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率60％，ee值为73％。反应的结果如说明书附图6为Fmoc-L-缬氨酸的液相谱图，附图7为Fmoc-D-缬氨酸的液相谱图，附图8为实施例2的液相谱图，附图9为实施例2产物与Fmoc-L-缬氨酸混合样品的液相谱图，附图10为实施例2的产物¹H NMR。

实施例：3

固体酶粉作为生物催化剂实现D-亮氨酸的合成

在10mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入1 mmol 4-甲基2-羰基戊酸或者是钠盐，160mg(3mmol)氯化铵，STDAPDH酶粉20mg，20mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，5mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖800mg(4mmol)37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入1.2mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6 N HCl调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HC1洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率32％，ee值为81％。反应的结果如说明书附图11为Fmoc-L-亮氨酸的液相谱图，附图12为Fmoc-D-亮氨酸的液相谱图，附图13为实施例3的液相谱图，附图14为实施例3产物与Fmoc-L-丙氨酸混合样品的液相谱图，附图15为实施例3未Fmoc保护的产物¹H NMR。

实施例：4

固体酶粉作为生物催化剂实现D-丙氨酸的合成

在10mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入1mmol丙酮酸乙酯，160mg(3mmol)氯化铵，20mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，STDAPDH酶粉20mg，5mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖800mg(4mmol)37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入1.2mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6N HCl调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HC1洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率36％，ee值为＞99％。反应的结果如说明书附图16为实施例4的液相谱图。

实施例：5

酶液作为生物催化剂实现D-丙氨酸的合成

在10mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入1mmol丙酮酸，160mg(3mmol)氯化铵，20mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，STDAPDH酶液2mL(11.07mg/mL)，5mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖800mg(4mmol)37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入1.2mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6N HCl调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HC1洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率65％，ee值为＞99％。

实施例：6

放大反应体系，酶液作为生物催化剂实现D-丙氨酸的合成

在250mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(200mM，pH10.0)中，加入10mmol丙酮酸，1.6 g(30mmol)氯化铵，200mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，STDAPDH酶液20mL(11.07mg/mL)，40mg NADP(NADP⁺)，葡萄糖8.0g(40mmol)37℃反应24小时，为测定产物产率及ee值，加入高氯酸调节pH值沉淀蛋白，离心取上层清液，加入Na₂CO₃调节pH值至9.0，加入12mmol的Fmoc-OSu后，控制pH值在8-9之间，室温过夜。离心弃去固体，甲基叔丁基醚萃取三次，弃去有机相，6 N HC1调节pH值在2-3之间，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，1 N HC1洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。称量得到的固体，产率62％。

Claims

1.一种用生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，包括：α-酮酸或其衍生物与氨基化合物作为底物与溶剂、助溶剂构成的反应体系；加入生物催化剂和辅酶循环体系进行催化还原胺化反应，反应温度20～60℃，反应pH值为6～11，反应时间4～72小时，制得光学纯度＞98％D-氨基酸。

2.如权利要求1所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D氨基酸的方法，其特征在于，所述的D-氨基酸是：D-丙氨酸或其他D-氨基酸。

3.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，生物催化剂为来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-二氨基庚二酸脱氢酶或者是与其氨基酸序列相似度不低于80％酶。

4.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的底物为α-酮酸或其衍生物α-酮酸酯等，特别是α-丙酮酸或其衍生物α-丙酮酸酯等。

5.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法其特征在于，每升反应体系底物的用量为3g～900g。

6.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的溶剂为水或各种缓冲溶液，如：磷酸盐缓冲体系、碳酸盐/碳酸氢盐缓冲体系、Tri-HCl缓冲体系、硼酸盐缓冲体系、柠檬酸盐缓冲体系；根据底物不同，助溶剂为二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺，二氧六环，甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃，正己烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，吡啶，甲苯中的一种或多种。

7.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的生物催化剂包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH或NADP⁺)，来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-Diaminopimelate dehydrogenase(STDAPDH)，葡萄糖脱氢酶(GDH)，或者是两种酶各自或者共同表达的基因工程菌。

8.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，每升反应体系中生物催化剂的用量为0.1g～100g。

9.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应温度为20℃～60℃，最适反应温度为37℃。

10.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应pH值为6～11，起始最适pH值为9.0。

11.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应不仅适用于除了丙酮酸及其衍生物外，也适用于其他种类的a-酮酸或其衍生物，合成其他种类的氨基酸。

12.如权利要求1和2所述生物催化剂合成光学纯度＞98％D-氨基酸的方法，所述的反应中的氨基底物可以是铵盐也可以是氨水。

13.本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。