CN110283859A - 微生物酶法合成l-肌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物酶法合成L‑肌肽的方法，属于肌肽制备技术领域。其是向配有搅拌装置的反应容器中的并且加入有微生物酶的L‑肌肽反应体系中直接添加用于激活所述微生物酶活性的并且作为通透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置搅拌下进行反应，反应结束后离心分离，得到L‑肌肽。有助于激活生物酶、有利于降低细胞外膜的通透性屏障、有便于后续结晶分离而得以降低合成成本、有益于显著加快反应速度而得以提高产能。
Description
技术领域
本发明属于肌肽制备技术领域，具体涉及一种微生物酶法合成L-肌肽的方法。
背景技术
L-肌肽是由L-组氨酸和β-丙氨酸组成的一种天然β,α-二肽，具有很强的抗氧化能力。目前已报道的L-肌肽合成工艺主要分为两类：一类是化学法合成，另一类是生物催化法合成。由于化学合成法的反应条件比较剧烈，步骤繁琐，需对β-丙氨酸或其衍生物进行羧基活化，同时需对其他的一些敏感基团进行保护，合成反应完成后，又需要对保护基团进行去保护，得到目标产品，反应过程中副产物比较复杂，保护基团的脱除需使用一些有毒害的试剂，反应工艺不够绿色，因而并不受到人们的器重。
生物催化法合成L-肌肽报道比较多的是：采用在缓冲盐进行pH调节下，氨肽酶催化β-丙氨酸酯/β-丙氨酰胺与L-组氨酸进行缩合，合成L-肌肽。与化学法合成相比，反应条件比较温和，不需要复杂的底物保护/去保护步骤。但是同样需要采用化学法对β-丙氨酸进行活化，将其转化为β-丙氨酰胺或β-丙氨酸酯，并且报道中产物浓度不高，有三肽、四肽产生，存在明显副产物，收率较低，因此尚未得到产业化应用。
提高合成L-肌肽的反应体系的通透性可以相应提高L-肌肽的生产效率，目前提高通透性的方法主要有物理处理法和化学处理法。但是，不论是物理处理法还是化学处理法，均为通透性预处理，处理程序主要为通透性处理→离心→洗涤等操作，处理过程较为繁琐。另外，在进行通透性预处理时，经常会出现生物酶细胞膜的过分损伤和细胞的裂解等现象，导致离心操作时微生物胞内物质的丢失，降低了微生物细胞生物催化的效率。为此有必要加以改进，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。
发明内容
本发明的任务在于提供一种有助于激活生物酶、有利于降低细胞外膜的通透性屏障、有便于后续结晶分离而得以降低合成成本、有益于显著加快反应速度而得以提高产能的微生物酶法合成L-肌肽的方法。
本发明的任务是这样来完成的，一种微生物酶法合成L-肌肽的方法，其是向配有搅拌装置的反应容器中的并且加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加用于激活所述微生物酶活性的并且作为通透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置搅拌下进行反应，反应结束后离心分离，得到L-肌肽。
在本发明的一个具体的实施例中，所述的L-肌肽反应体系为L-肌肽基础反应液；所述有机溶剂在所述L-肌肽基础反应液中的体积百分浓度为0.1-2.5％；所述二价金属离子在所述L-肌肽基础反应液中的mol浓度为10-50mol/L；所述微生物酶在所述L-肌肽基础反应液中的加入量为0.45-0.55g湿菌体/L。
在本发明的另一个具体的实施例中，所述的L-肌肽基础反应液为L-组氨酸和β-丙氨酸的水溶液，其中，L-组氨酸和β-丙氨酸的摩尔浓度为1∶10-60。
在本发明的又一个具体的实施例中，所述的有机溶剂为甲苯、二甲苯、乙酸红酯或丁酸乙酯。
在本发明的再一个具体的实施例中，所述的二价金属离子为Fe、Cu、Mg或Mn。
在本发明的还有一个具体的实施例中，所述的微生物酶为微生物重组肌肽水解酶。
在本发明的更而一个具体的实施例中，所述的微生物重组肌肽水解酶为SmPepDM13。
在本发明的进而一个具体的实施例中，所述反应的温度为35-40℃；所述搅拌装置搅拌的速度为140-160rpm；所述反应的反应时间为450-520min。
本发明提供的技术方案的技术效果在于：由于向加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加作为通透剂的有机溶剂以及二价金属离子，因而有助于激活微生物酶，使作为L-肌肽基础反应液的L-组氨酸和β丙氨酸的水溶液无需保护而直接参与酶法反应；由于将作为通透剂的有机溶剂以及二价金属离子直接添加到L-肌肽反应体系中，因而无需象已有技术那样使用pH缓冲液进行调节，避免了通透剂对细胞膜的损伤或细胞的裂解，能防止离心时的细胞内的物质丢失，降低细胞外膜的通透性屏障，使L-肌肽的产量能达到15.1g/L以上；由于将有机溶剂及二价金属离子直接加入L-肌肽反应体系中使微生物酶激活，因而可使酶促反应效率相对于已有技术提高两个数量级，加快反应速度及提高反应转化率，并且全细胞可通过固定化或物理分离而循环使用，降低合成成本；由于水相反应体系，底物L-组氨酸和β-丙氨酸溶解度高，不需要加入缓冲盐进行pH调节，对细胞毒性小，酶反应速率快，摩尔转化率高，因而得以显著提高生产效率，降低生产成本，满足工业化放大生产要求。
具体实施方式
实施例1：
向配有搅拌装置的反应容器如反应釜中的并且加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加用于激活微生物酶活性的并且作为透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置的搅拌速度为140rpm以及反应温度为40℃下反应480min，反应结束后，用高效液相色谐分析测定反应转化率，收集反应液，离心分离，离心获得的全细胞可继续催化实现循环利用，得到15.1g/L的L-肌肽。在本实施例中，所述的L-肌肽反应体系为的L-肌肽基础反应液，所述有机溶剂在所述的L-肌肽反应液中的体积百分浓度为0.1％(V/V)，所述二价金属离子在所述的L-肌肽基础反应液中的mol浓度(摩尔浓度)为50mol/L，所述微生物酶在所述的L-肌肽反应液中的加入量为0.5g湿菌体/L，前述的L-肌肽基础反应液为mol浓度为1∶35的L-组氨酸和β丙氨酸的水溶液，前述的有机溶剂为甲苯，前述的二价金属离子为Mn，本实施例所述的微生物酶为微生物重组肌肽水解酶，该微生物重组肌肽水解酶为微生物重组肌肽水解酶突变体SmPepD M13，该菌种已在中国发明专利申请公布号CN109468303A中公开，其中高活性肌肽水解酶、粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens ECU1010，目前已保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2004年9月14日，保藏号为CGMCC No.1219(见中国专利授权公告号CN100334198C)。本实施例的反应式如下：
实施例2：
向配有搅拌装置的反应容器如反应釜中的并且加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加用于激活微生物酶活性的并且作为透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置的搅拌速度为160rpm以及反应温度为35℃下反应520min，反应结束后，用高效液相色谐分析测定反应转化率，收集反应液，离心分离，离心获得的全细胞可继续催化实现循环利用，得到15.2g/L的L-肌肽。在本实施例中，所述的L-肌肽反应体系为的L-肌肽基础反应液，所述有机溶剂在所述的L-肌肽反应液中的体积百分浓度为1.3％(V/V)，所述二价金属离子在所述的L-肌肽基础反应液中的mol浓度(摩尔浓度)为10mol/L，所述微生物酶在所述的L-肌肽反应液中的加入量为0.45g湿菌体/L，前述的L-肌肽基础反应液为mol浓度为1∶60的L-组氨酸和β丙氨酸的水溶液，前述的有机溶剂为二甲苯，前述的二价金属离子为Mg，其余均同对实施例1的描述。
实施例3：
向配有搅拌装置的反应容器如反应釜中的并且加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加用于激活微生物酶活性的并且作为透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置的搅拌速度为150rpm以及反应温度为38℃下反应450min，反应结束后，用高效液相色谐分析测定反应转化率，收集反应液，离心分离，离心获得的全细胞可继续催化实现循环利用，得到15.15g/L的L-肌肽。在本实施例中，所述的L-肌肽反应体系为的L-肌肽基础反应液，所述有机溶剂在所述的L-肌肽反应液中的体积百分浓度为2.5％(V/V)，所述二价金属离子在所述的L-肌肽基础反应液中的mol浓度(摩尔浓度)为25mol/L，所述微生物酶在所述的L-肌肽反应液中的加入量为0.55g湿菌体/L，前述的L-肌肽基础反应液为mol浓度为1∶10的L-组氨酸和β丙氨酸的水溶液，前述的有机溶剂为乙酸乙酯，前述的二价金属离子为Cu，其余均同对实施例1的描述。
比较例1：
在L-肌肽反应体系中不加入用于激活微生物酶活性的通透剂以及二价金属离子，即不对重组肌肽水解酶突变体SmPepD M13作通透性处理，利用已有技术中的菌体酶法合成L-肌肽，最终L-肌肽产量为3.8g/L。
比较例2：
对重组肌肽水解酶突变体SmPepD M13采用不同浓度的有机溶剂如甲苯、二甲苯、乙酸乙酯或丁酸乙酯依次进行传统的预处理→离心→洗涤，利用其菌体酶法合成L-肌肽，最终L-肌肽的产量为4.7g/L。
综上所述，本发明提供的技术方案弥补了已有技术中的缺憾，顺利地完成了发明任务，如实地兑现了申请人在上面的技术效果栏中载述的技术效果。
Claims (8)
1.一种微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于其是向配有搅拌装置的反应容器中的并且加入有微生物酶的L-肌肽反应体系中直接添加用于激活所述微生物酶活性的并且作为通透剂的有机溶剂以及直接添加同样用于激活微生物酶活性的二价金属离子，在所述搅拌装置搅拌下进行反应，反应结束后离心分离，得到L-肌肽。
2.根据权利要求1所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的L-肌肽反应体系为L-肌肽基础反应液；所述有机溶剂在所述L-肌肽基础反应液中的体积百分浓度为0.1-2.5%；所述二价金属离子在所述L-肌肽基础反应液中的mol浓度为10-50mol/L；所述微生物酶在所述L-肌肽基础反应液中的加入量为0.45-0.55g湿菌体/L。
3.根据权利要求1或2所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的L-肌肽基础反应液为L-组氨酸和β-丙氨酸的水溶液，其中，L-组氨酸和β-丙氨酸的摩尔浓度为1∶10-60。
4.根据权利要求1或2所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的有机溶剂为甲苯、二甲苯、乙酸红酯或丁酸乙酯。
5.根据权利要求1或2所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的二价金属离子为Fe、Cu、Mg或Mn。
6.根据权利要求1或2所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的微生物酶为微生物重组肌肽水解酶。
7.根据权利要求6所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述的微生物重组肌肽水解酶为SmPepD M13。
8.根据权利要求1所述的微生物酶法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述反应的温度为35-40℃；所述搅拌装置搅拌的速度为140-160rpm；所述反应的反应时间为450-520min。
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