CN114480466B - 一种生产4-羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产4‑羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用，属于基因工程领域。本发明构建了能够响应支链氨基酸的双向动态调控系统，促进了异亮氨酸向4‑羟基异亮氨酸的转化，同时利用衰减子PilvBNC负调控异亮氨酸合成途径中ilvA基因的表达，使底物异亮氨酸的含量达到动态平衡，促进4‑羟基异亮氨酸的合成，使4‑羟基异亮氨酸产量可达123.2mM。在此基础上，加入赖氨酸核糖体开关，显著减少副产物赖氨酸的合成，使得4‑羟基异亮氨酸的产量进一步得到提升，达到177.3mM。本发明所提供的动态调控系统及菌株适合应用于调控系统的宿主细胞在支链氨基酸的平衡和动态调控、以及制备与支链氨基酸相关的代谢产物及其衍生物。

Description

一种生产4-羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种生产4-羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
糖尿病是一种患病率很高的代谢紊乱疾病，目前世界上超过4亿人受到糖尿病的困扰，而这一人数还在持续增加。(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低胰岛素抵抗，调节血脂异常，改善肝功能等生理作用，在治疗糖尿病及其并发症方面有良好的应用前景。目前4-HIL的主要制备方法是从葫芦巴种子中提取，但是产量很低，难以满足市场需求。于是从2002年开始，人们不断寻找化学-酶法合成4-HIL的方法，但是由于步骤太长、得率较低、纯度较低而没有深入下去。α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶(IDO)能够催化L-异亮氨酸(Ile)的C4位发生羟基化反应，生成4-HIL。利用基因工程技术在微生物中过表达IDO编码基因，进而通过工程菌的发酵来合成4-HIL是到目前为止发现的最简单、有效和经济的4-HIL生产方法。
在利用基因工程通过微生物发酵法合成4-HIL的研究领域中，主要是将来源于芽孢杆菌的IDO编码基因ido导入到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌中使其高效表达，利用工程菌表达出的IDO将Ile转变成4-HIL，从而生产出4-HIL。但是在大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌工程菌发酵过程中需要加入大量比较昂贵的Ile作为底物去合成4-HIL，而在谷氨酸棒杆菌工程菌发酵过程中则是利用菌体自身合成的Ile作为底物去合成4-HIL，不需要另外加入Ile。因此采用谷氨酸棒杆菌工程菌生产4-HIL更为经济、有效。
谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01是一株Ile生产菌，在该菌株中克隆、表达ido基因后，可以将其自身积累的Ile转化成4-HIL，从而实现4-HIL的一步从头合成，无需添加Ile等前体物质，具有明显的技术优势(Shi F,Niu TF,Fang HM.4-Hydroxyisoleucineproduction of recombinant Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum underoptimal corn steep liquor limitation.Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(9):3851-3863)。然而，尽管L-异亮氨酸是4-HIL的直接底物，但在Ile积累过多、达到一定浓度后，反而会抑制IDO的活性，即产生底物抑制作用。因此，在工程菌合成4-HIL的过程中，一方面需要不断提供底物Ile，另一方面，当底物Ile过量积累时又会抑制IDO的活性，导致4-HIL合成受损，这使得4-HIL的产量无法预期，造成4-HIL生产的技术困难。此外，发酵产物中总是含有较多的L-赖氨酸(Lys)副产物，这限制了4-HIL的产量进一步提升，并会增加发酵产物分离纯化的成本。因此，如何平衡底物Ile的供应，并降低Lys含量，对于促进4-HIL高效生产、提高4-HIL产量仍然是一个重要的技术问题。
此外，在Ile和4-HIL的合成过程中，由于Ile合成途径的前几个酶同时参与Lys的合成，因此发酵产物总是含有较多的Lys副产物；而Lys合成途径中产生的二氨基庚二酸又为细胞生长所需，导致很难削弱Lys合成途径，这限制了4-HIL产量的提升。
发明内容
在微生物发酵合成4-HIL的研究中，直接前体Ile的平衡供应非常重要。前期为了动态调节Ile向4-HIL的转化和α-酮戊二酸、O2的供应，曾经开发了诱导性启动子PbrnFEN以及受三种支链氨基酸(Ile、L-缬氨酸、L-亮氨酸)或L-甲硫氨酸诱导的生物传感器Lrp-PbrnFEN(已公开于公开号为CN111440797A的专利中)。该传感器能够感应Ile，利用该传感器正调ido的表达，可以根据Ile浓度来上调Ile下游转化途径中Ile向4-HIL的转化速率。但是该传感器无法调节上游Ile供应途径中Ile的合成速率，而无法实现Ile的平衡供应。因此，如何平衡Ile供应仍然是一个重要的技术问题。
在Ile和4-HIL的合成过程中，由于Ile合成途径的前几个酶同时参与Lys的合成，因此发酵产物总是含有较多的Lys副产物；而Lys合成途径中产生的二氨基庚二酸又为细胞生长所需，导致很难削弱Lys合成途径，这限制了4-HIL产量的提升。因此，如何降低Lys含量、提高4-HIL产量也同样是一个重要的技术问题。
本发明为了实现Ile的平衡供应，在上述Lrp-PbrnFEN生物传感器正调ido表达的单动态调控系统的基础上，采用PilvBNC衰减子负调上游Ile合成途径中关键基因如ilvA的表达，使得只有当细胞内Ile浓度低时才表达ilvA，促进Ile合成；而当细胞内Ile浓度高时则下调ilvA的表达，停止或减缓Ile的合成，同时上调ido的表达，促进Ile向4-HIL转化。由此开发出一种受Ile(或其它支链氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸)浓度控制的双向动态调控系统，来平衡Ile的供应，解决Ile过量积累后抑制IDO活性的问题。更进一步地，本发明为了降低副产物Lys的含量，利用Lys-OFF开关根据细胞内Lys的浓度高低来动态下调Lys合成途径中关键基因如dapA的表达，使得只有当细胞内Lys浓度低时才表达dapA，维持Lys的合成和细胞生长；而当细胞内Lys浓度高时则下调dapA的表达，停止副产物Lys的合成。解决副产物Lys过多对4-HIL生产造成的资源浪费和分离纯化负担。
本发明所述的双向动态调控系统也可以受其它支链氨基酸即L-缬氨酸、L-亮氨酸的控制，因此也可以用来平衡这两种氨基酸的供应，并调节与其相关的代谢产物的合成。
本发明提供了一种双向动态调控系统，所述双向动态调控系统由正调控系统和负调控系统组成；所述正调控系统是由异亮氨酸调控元件Lrp-PbrnFEN正调控ido基因的生物传感系统；所述负调控系统是由PilvBNC衰减子负调控ilvA基因的表达系统。
在一种实施方式中，Lrp-PbrnFEN是受Ile正调控的转录调控元件，由Ile转录调控因子Lrp的编码基因lrp及其下游启动子PbrnFEN组成；PilvBNC是受Ile负调控的转录调控元件。
在一种实施方式中，所述ido基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lrp-PbrnFEN的序列为将SEQ ID NO.1所示序列的第504～526位替换为如(a)～(g)任一所示：
(a)ACCCGGCAATTGTGTGATGATTG；
(b)CAACAAAGGTAGGGTAGAGTGG；
(c)GTGTAAAATGTGTGTTATACTGG；
(d)ACCCGGCAATTGTGTGATGATTGTAGTGTGCAAAAAACGCAATGCGCAAACTGGCAACAAAACTGTGTAAAATGTGT GTTATACTGG；
(e)GACTATGGGGTATATTGG；
(f)CGTAAAGAGCTAGAGTTG；
(g)TAGGAGTAACTAGACTAG。
在一种实施方式中，所述PilvBNC衰减子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种三向动态调控系统，所述三向动态调控系统由所述双向动态调控系统、dapA基因及其表达调控元件组成。
在一种实施方式中，所述表达调控元件为Lys-OFF开关，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明提供了含有所述双向或三向动态调控系统的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括谷氨酸棒杆菌。
在一种实施方式中，将所述Lys-OFF开关整合至C.glutamicumssp.lactofermentum SN01菌株染色体上dapA基因前，弱化Lys的合成。
在一种实施方式中，所述C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01公开于文献4-Hydroxyisoleucine production of recombinant Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum under optimal corn steep liquor limitation中，公开于2015年。
本发明提供了所述双向动态调控系统、或含有所述双向动态调控系统的宿主细胞在支链氨基酸的平衡和动态调控中的应用。
本发明提供了所述双向动态调控系统、或含有所述双向动态调控系统的宿主细胞在制备与支链氨基酸相关的代谢产物及其衍生物中的应用。
在一种实施方式中，所述支链氨基酸包括L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸。
本发明提供了生产4-羟基异亮氨酸的方法，所述方法是利用所述动态调控系统或所述宿主细胞发酵生产4-羟基异亮氨酸。
在一种实施方式中，将OD562为1.8±0.2的菌液接种至发酵培养基中，在25～35℃、180～220r/min下发酵。
有益效果：本发明提供了一种能够响应Ile(以及L-缬氨酸、L-亮氨酸)的双向动态调控系统。利用Ile生物传感器Lrp-PbrnFEN正调控Ile下游转化基因idoU的表达，促进下游Ile向4-HIL的转化，同时采用Ile衰减子PilvBNC负调控Ile合成途径的ilvA基因的表达，防止Ile的过量积累，避免过量Ile抑制IDO的活性。这种双向动态调控菌能够很好的平衡底物Ile的供应，促进4-HIL的合成。使4-HIL的产量提高至123.2mM，最大提高幅度为2.98倍。在双向动态调控的基础上，本发明还采用赖氨酸核糖体开关(Lys-OFF开关)弱化副产物Lys的合成，构建了一种三动态调控系统用于生产4-HIL。这种三动态调控菌在摇瓶水平上使得4-HIL产量提高至177.3mM，与双动态菌相比最大提高幅度为1.50倍。并且赖氨酸的含量从16.1mM降至6.1mM，降幅达62％。
具体实施方式
谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01已公布于文献4-Hydroxyisoleucine production of recombinant Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum under optimal corn steep liquor limitation中，公开于2015年。
pJYW5表达载体的构建方法公开于胡瑾瑜硕士毕业论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除和表达系统的构建及其应用》，公开于2015年。
4-HIL与L-赖氨酸的检测方法：氨基酸产量用HPLC衍生化法测定：样品经过5％的三氯乙酸稀释50倍后放置沉淀4h，12000r/min离心20min，上清用滤膜过滤后用HPLC测样。测定流动相为：水相buffer A(1L)：醋酸钠3.01g，三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，用10％醋酸调pH至7.2；有机相buffer B(1L)：醋酸钠3.01g溶解后用10％醋酸调pH至7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇。梯度洗脱条件为：0min 8％buffer B，20min 60％buffer B，25min 100％buffer B，28.5min 8％buffer B，色谱柱温为40℃，流速为0.8mL/min。
LBB培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L；固体培养基添加1.5％-2％的琼脂，灭菌条件121℃，20min。
种子培养基：一水葡萄糖25g/L、硫酸铵0.5g/L、尿素1.25g/L、玉米浆40g/L、磷酸二氢钾1g/L，加超纯水定容到1L。用KOH调节pH至7.20，灭菌条件121℃，15min。
发酵培养基：一水葡萄糖140g/L、硫酸铵30g/L、玉米浆10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.75g/L、七水合硫酸亚铁1.5g/L，用KOH调节pH至7.20，灭菌条件115℃，15min。
摇瓶发酵生产4-HIL：将菌株在含有卡那霉素的LBB平板上进行活化，放置于30℃培养箱培养44h。然后将平板上的菌苔刮到40/500mL的种子培养基中，30℃、200r/min培养16h。最后测定种子液的OD562值，并以发酵的初始OD为1.8，将种子液加入30/500mL发酵培养基中，30℃、200r/min发酵144h。种子培养基和发酵培养基中均添加30μg/mL的卡那霉素。
表1实施例中所用引物
引物名称 序列
PilvBNC-F AGGAGACCAAGTAAGGATCCCCAAGATTAGCGCTGAAAAG
PilvBNC-R ACACGTATGTTTCACTCATGACTTTCTGGCTCCTTTAC
ilvA-F ATGAGTGAAACATACGTGTC
ilvA-R AATTCGTCGACGGATCCTTAGGTCAAGTATTCGTAC
Lys-OFF-F AGAAGGTAACCTTGAACTCTATGTACTACCTGCGCTAG
Lys-OFF-R CTCATCCTATAACTCCTTCTGTGTCAGGGGATCCATTTTC
dapA-U-F ATAGTCGACGTGGTGCCCACTCTCATC
dapA-U-R GGTAGTACATAGAGTTCAAGGTTACCTTCTT
dapA-D-F ACAGAAGGAGTTATAGGATGAGCACAGGTTTAAC
dapA-D-R ATAGTCGACTTAGTGGGTCATCGCCTG
实施例1：单向动态调控菌株的构建
Lrp-PbrnFEN(N为0，1，5，7，9，13或5D之一)的获得：从pIL-NI的质粒序列中扩增Lrp-PbrnFEN(其序列为公开号为CN111440797A的专利中SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.14)，所用引物为Lrp-F和PbrnFEN-R，得到7个Lrp-PbrnFEN片段。
Lrp-F：ATTAGGTACCTCACACCTGGGGGCGAGCTGGTTTC，
PbrnFEN-R：GAGAAGCCGGACATCTTCATCCTATAACTCCTTCTCTC；
Lrp-PbrnFEN序列如SEQ ID NO.1所示，Lrp-PbrnFEN序列的第504～526位指Lrp-PbrnFEN传感器中的PbrnFE0的序列。该处可以分别替换为如下序列即得到7个Lrp-PbrnFEN片段。
PbrnFE0：ACCCGGCAATTGTGTGATGATTG，
PbrnFE1：CAACAAAGGTAGGGTAGAGTGG，
PbrnFE5：GTGTAAAATGTGTGTTATACTGG，
PbrnFED5(双启动子，单划线处对应PbrnFE0的序列，双划线处对应PbrnFE5的序列)：AC CCGGCAATTGTGTGATGATTGTAGTGTGCAAAAAACGCAATGCGC AAACTGGCAA CAAAACTGTGTAAAATGTGT GTTATACTGG，
PbrnFE7：GACTATGGGGTATATTGG，
PbrnFE9：CGTAAAGAGCTAGAGTTG，
PbrnFE13：TAGGAGTAACTAGACTAG；
共获得7种不同强度的Lrp-PbrnFEN的生物传感器。
2)表达基因idoU的获得：
密码子优化后的ido基因(简称idoU)的获得：采用化学全合成法合成idoU片段(序列如SEQ ID NO.2所示。
3)单向调控质粒的获得：以Lrp-PbrnFEN片段和idoU片段为模板，通过重叠PCR法合成出Lrp-PbrnFEN-idoU融合片段；然后将该片段插入pJYW5表达载体中，得到单向调控质粒pIL-NIU。
4)单向动态调控菌株的获得：
将单向动态调控系统表达质粒pIL-NIU转化到C.glutamicum ssp.LactofermentumSN01菌株中表达，获得7种不同调控强度的单向动态调控的工程菌株D-NIU。
将7株单向动态调控菌株D-NIU接种于发酵培养基中，在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，7株菌D-0IU、D-1IU、D-5IU、D-D5IU、D-7IU、D-9IU、D-13IU的4-HIL产量分别为106.3、111.1、92.0、97.5、84.2、79.7、38.7mM。
实施例2：双向动态调控菌株D-7IUPA的构建和应用
从C.glutamicum ssp.Lactofermentum SN01的基因组DNA中扩增PilvBNC(如SEQ IDNO.3所示)和ilvA片段(如SEQ ID NO.4所示)，所用引物为PilvBNC-F/PilvBNC-R和ilvA-F/ilvA-R。通过重叠PCR法合成出PilvBNC-ilvA融合片段。然后再以Lrp-PbrnFE7-idoU片段和PilvBNC-ilvA片段为模板，通过重叠PCR法合成出Lrp-PbrnFE7-idoU-PilvBNC-ilvA融合片段。最后将该片段插入pJYW5表达载体中，得到双向动态调控质粒pIL-7IUPA。将双向动态调控质粒pIL-7IUPA转化到C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01菌株中表达，得到双向动态调控的工程菌株D-7IUPA。
将单向动态调控的工程菌株D-7IU和双向动态调控的工程菌株D-7IUPA分别在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，双向动态调控菌株D-7IUPA的4-HIL产量为123.2mM，比单向动态调控菌株D-7IU(84.2mM)高出46.3％。
实施例3：双向动态调控菌株D-13IUPA的构建和应用
从C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01的基因组DNA中扩增PilvBNC和ilvA片段，所用引物为PilvBNC-F/PilvBNC-R和ilvA-F/ilvA-R。通过重叠PCR法合成出PilvBNC-ilvA融合片段。然后再以Lrp-PbrnFE13-idoU片段和PilvBNC-ilvA片段为模板，通过重叠PCR法合成出Lrp-PbrnFE13-idoU-PilvBNC-ilvA融合片段。最后将该片段插入pJYW5表达载体中，得到双向动态调控质粒pIL-13IUPA。将双向动态调控质粒pIL-13IUPA转化到C.glutamicumssp.lactofermentum SN01菌株中表达，得到双向动态调控的工程菌株D-13IUPA。
将D-13IU和D-13IUPA两个菌株分别在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，双向动态调控菌株D-13IUPA的4-HIL产量为115.3mM，比单向动态调控菌株D-13IU(38.7mM)高出197.9％。结果说明双向动态调控系统能够更好的平衡Ile的供应，更好的促进4-HIL的合成。
实施例4：双向动态调控菌株D-NIUPA的构建和应用
具体实施方式参见实施例2和3，构建双向动态调控菌株D-0IUPA、D-1IUPA、D-5IUPA、D-D5IUPA、D-9IUPA，并将构建得到的菌株分别于30℃摇瓶发酵，4-HIL产量分别为73.6、109.7、118.0、118.2、58.4mM，D-5IUPA、D-D5IUPA分别比各自的单向调控菌株高出28.3％、21.2％。
实施例5：三向动态调控菌株D-RS-5IUPA的构建和应用
从大肠杆菌K-12亚种MG1655基因组DNA(GenBank:CP027060.1)中扩增Lys-OFF片段(如SEQ ID NO.5所示)，所用引物为Lys-OFF-F和Lys-OFF-R；以C.glutamicumssp.lactofermentum SN01基因组DNA为模板，用引物dapA-U-F、dapA-U-R扩增dapA上游同源臂；用引物dapA-D-F、dapA-D-R扩增dapA下游同源臂；通过重叠PCR将dapA-U、Lys-OFF和dapA-D连接起来，再将重叠后的dapA-U-Lys-OFF-dapA-D片段插入pK18mobsacB载体，构建整合质粒pK18mobsacB-PdapA-LysRS。将上述整合质粒pK18mobsacB-PdapA-LysRS电转入C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01中，电转后将电转液涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LBB平板(LBBK)上，30℃培养48h，进行第一轮同源重组。然后对平板上长出的菌落进行PCR验证，挑选出第一轮同源重组后正确的转化子，涂布于LBB平板上富集培养后再接种于LBB液体培养基中培养过夜，然后将菌液稀释104倍，涂布于含10％蔗糖的LBB平板(LBBS)，30℃培养48h，进行第二轮同源重组。对平板上长出的菌落进行PCR验证，挑选出正确的整合菌株。将PCR验证正确的菌株分别划线于LBBS和LBBK平板，挑选在LBBS平板上正常生长、而在LBBK平板上不生长的整合菌株进行测序验证，测序结果正确后就得到重组菌株SN01PdapA::PdapA-LysRS。经过这样两轮同源重组得到重组菌株SN01 PdapA::PdapA-LysRS(简称为D-RS)。将双向动态调控系统表达质粒pIL-5IUPA转化到上述D-RS菌株中表达，获得三动态调控的工程菌株D-RS-5IUPA。
将D-5IU、D-5IUPA和D-RS-5IUPA三个菌株在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量和Lys的含量。结果显示，三动态调控菌株D-RS-5IUPA的4-HIL产量为177.3mM，比双向动态调控菌株D-5IUPA(118.0mM)高出50％，比单向动态调控菌株D-5IU(92.0mM)高出92.7％。并且D-RS-5IUPA副产物L-赖氨酸的产量降至6.1mM，比D-5IUPA(16.1mM)低62％，比D-5IU(32.2mM)低81％。结果说明三动态调控菌株能够更好的弱化副产物Lys的含量，促进4-HIL的合成。
实施例6：三向动态调控菌株D-RS-D5IUPA的构建和应用
从大肠杆菌K-12亚种MG1655基因组DNA(GenBank:CP027060.1)中扩增Lys-OFF片段(如SEQ ID NO.5所示)，所用引物为Lys-OFF-F和Lys-OFF-R；以C.glutamicumssp.lactofermentum SN01基因组DNA为模板，用引物dapA-U-F、dapA-U-R扩增dapA上游同源臂；用引物dapA-D-F和dapA-D-R扩增dapA下游同源臂；通过重叠PCR将dapA-U、Lys-OFF和dapA-D连接起来，再将重叠后的dapA-U-Lys-OFF-dapA-D片段插入pK18mobsacB载体，构建整合质粒pK18mobsacB-PdapA-LysRS。将上述整合质粒pK18mobsacB-PdapA-LysRS电转入C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01中，经过两轮同源重组得到重组菌株SN01PdapA::PdapA-LysRS(简称为D-RS)。将双向动态调控系统表达质粒pIL-D5IUPA转化到上述D-RS菌株中表达，获得三动态调控的工程菌株D-RS-D5IUPA。
将D-D5IU、D-D5IUPA、D-RS-D5IUPA以上三个菌株在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量和Lys的含量。结果显示，三动态调控菌株D-RS-D5IUPA的4-HIL产量为109.1mM，与双向动态调控菌株D-D5IUPA(118.2mM)相似，比单向动态调控菌株D-D5IU(97.5mM)高出12％。并且D-RS-D5IUPA副产物L-赖氨酸的产量降至6.8mM，比D-D5IUPA(26.0mM)低74％，比D-D5IU(26.7mM)低75％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产4-羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用
<130> BAA220125A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcacacctgg gggcgagctg gtttcaccac tttcatagca aaacgtgatg agatctttgc 60
aattcctggc acggtttgaa tgtgactgga taaaaattgc tcatacgcct ccaaatcagc 120
aacgccgatg cgaacaaaat aatctggcga accaaaaagc ctgtgcaact ccagtacttc 180
atcatgctgc gcaacggagc tttcaaaatt gtctacagtg gagcggtcga agttgctgag 240
agtgacatcc acggtcacct caaatccacg attcatcacc gcagggtgaa tgtccgcgct 300
gtagcccaaa atgattcctt cggcttccaa acgctgcacc ctcctcaagc aaggtcccgg 360
agtgagatgc accttgtcag ccagtgcgag atttgagatg cgcgcattcg cgctaagctc 420
cgcaataatt gcgcaatcaa tggaatctag cttcatatat tgcacaatag cctagttgag 480
gtgcgcaaac tggcaacaaa actacccggc aattgtgtga tgattgtagt gtgcaaaaaa 540
cgcaagagat tcattcaagc ctggagagaa ggagttatag g 581
<210> 2
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaagatgt ccggcttctc catcgaggag aaggttcacg agttcgagtc caagggcttc 60
ctggagatct ccaacgagat cttcctgcaa gaggaggaga accaccgcct gctgacccag 120
gctcagctgg actactacaa cctggaggac gacgcttacg gcgagtgccg cgctcgctcc 180
tactcccgct acatcaagta cgttgactcc ccagactaca tcctggacaa ctccaacgac 240
tacttccagt ccaaggagta caactacgac gacggcggca aggttcgcca gttcaactcc 300
atcaacgact ccttcctgtg caacccactg atccagaaca tcgttcgctt cgacaccgag 360
ttcgctttca agaccaacat catcgacacc tccaaggacc tgatcatcgg cctgcaccag 420
gttcgctaca aggctaccaa ggagcgccca tccttctcct ccccaatctg gctgcacaag 480
gacgacgagc cagttgtttt cctgcacctg atgaacctgt ccaacaccgc tatcggcggc 540
gacaacctga tcgctaactc cccacgcgag atcaaccagt tcatctccct gaaggagcca 600
ctggagaccc tggtattcgg ccagaaggtc ttccacgcgg ttaccccact gggcaccgag 660
tgctcgactg aggcgttccg cgacatcctc ctggttacct tctcctacaa ggagaccaag 720
taa 723
<210> 3
<211> 434
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaagattag cgctgaaaag tagcgggagc ctgcctgaac tttgtgagaa tcctgattcc 60
ttaaccgaag tgggggagtt ttgggggtgg gaattttcgt gcgttgtgga attggaaact 120
cgatgtgtgt agcatgacac accatgacca ttattcgact tgtagtagta accgcgcggc 180
gcctgccgta acggccttcc aagtcgtctc gtcaagcgcc ctcgacaaca ctcaccacag 240
tgttggaacg agggctttct tgttggttat gacccaagta gccaactttg caacagacat 300
ctgtcgcact gcgtgcacac gcatccgcgt cggaacaatt ttaaatgagg gctttgtctt 360
taggctgagt tgaaatcggc ttggcttgga cgggtcctgt gaaaatcctt atttagtaaa 420
ggagccagaa agtc 434
<210> 4
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcactcagg agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
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gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
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aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctggttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 5
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtactacc tgcgctagcg caggccagaa gaggcgcgtt gcccaagtaa cggtgttgga 60
ggagccagtc ctgtgataac acctgagggg gtgcatcgcc gaggtgattg aacggctggc 120
cacgttcatc atcggctaca ggggctgaat cccctgggtt gtcaccagaa gcgttcgcag 180
tcgggcgttt cgcaagtggt ggagcacttc tgggtgaaaa tagtagcgaa gtatcgctct 240
gcgcccaccc gtcttccgct cttcccttgt gccaaggctg aaaatggatc ccctgacac 299

Claims (5)

1.一种双向动态调控系统，其特征在于，由正调控和负调控系统组成；所述正调控系统是由异亮氨酸调控元件Lrp-PbrnFEN正调控ido基因的生物传感系统；所述负调控系统是由PilvBNC衰减子负调节ilvA基因的表达系统；所述ido基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PilvBNC衰减子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ilvA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述Lrp-PbrnFEN的序列为将SEQ ID NO.1所示序列的第504~526位替换为如（a）~（g）任一所示：
（a）ACCCGGCAATTGTGTGATGATTG；
（b）CAACAAAGGTAGGGTAGAGTGG；
（c）GTGTAAAATGTGTGTTATACTGG；
（d）ACCCGGCAATTGTGTGATGATTGTAGTGTGCAAAAAACGCAATGCGCAAACTGGCAACAAAACTGTGTAAAATGTGTGTTATACTGG；
（e）GACTATGGGGTATATTGG；
（f）CGTAAAGAGCTAGAGTTG；
（g）TAGGAGTAACTAGACTAG。
2.一种三向动态调控系统，其特征在于，由权利要求1所述双向动态调控系统、dapA基因及其表达调控元件组成；所述表达调控元件为Lys-OFF开关，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述dapA基因是以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种（C. glutamicum ssp.lactofermentum） SN01基因组DNA为模板，采用引物dapA-U-F、dapA-U-R扩增dapA上游同源臂；引物dapA-D-F、dapA-D-R扩增dapA下游同源臂；通过重叠PCR将dapA-U、Lys-OFF和dapA-D连接起来，其中dapA-U-F序列为ATAGTCGACGTGGTGCCCACTCTCATC；dapA-U-R序列为GGTAGTACATAGAGTTCAAGGTTACCTTCTT；dapA-D-F序列为ACAGAAGGAGTTATAGGATGAGCACAGGTTTAAC；dapA-D-R序列为ATAGTCGACTTAGTGGGTCATCGCCTG。
3.含有权利要求1或2所述动态调控系统的谷氨酸棒杆菌。
4.生产4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述动态调控系统或权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌发酵生产4-羟基异亮氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD562为1.8±0.2的菌液接种至发酵培养基中，在25~35℃、180~220r/min下发酵。
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