CN117946954A - 一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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徐庆阳
马零
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Abstract

本发明提供了一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株是利用代谢工程改造方法在出发菌株C.glutamicum基础上进行进一步改造获得的亮氨酸辅因子平衡生产菌株，具体为：使用Ptuf启动子过表达leuA fbr 、ilvBN fbr、leuCD、lrp和brnFE基因，使用Ptuf启动子异源表达pntAB和bcd基因，将gapX基因自身PgapX启动子和ilvC基因自身PilvC启动子替换为Ptuf启动子，敲除brnQ、ldh、pqO、adhE、ackA、pta、ilvE基因；所述菌株能够以生产成本较低的葡萄糖作为碳源，具有生产成本低，稳定性高的特点，具有大规模生产亮氨酸的潜力。

Description

一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术与发酵工程技术领域，尤其是一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-亮氨酸（L-Leucine）的化学式为C6H13NO2，室温下为白色有光泽六面体结晶或白色结晶性粉末，在20℃下的溶解度为22.4 g/L，密度为1.293 g/cm-3。亮氨酸是组成蛋白质的天然氨基酸，与L-异亮氨酸和L-缬氨酸共称三大支链氨基酸，并且广泛存在于动物蛋白和乳制品中。
目前利用谷氨酸棒杆菌生产L-亮氨酸的菌株通常通过随机诱变获得，然而，诱变过程存在突变频率低，生长性状不稳定、营养缺陷等问题。随着合成生物学的兴起与定向改造基因技术的出现，在菌株构建的过程中可以定向的对代谢网络进行动态调节。因此构建出一株高产、高效、生长稳定且辅因子代谢平衡的亮氨酸生产菌株是十分必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种亮氨酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述亮氨酸生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述亮氨酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种亮氨酸生产菌株，为菌株LU9，是利用代谢工程改造方法在出发菌株C. glutamicum基础上进行进一步改造获得的亮氨酸辅因子平衡生产菌株，具体为：使用Ptuf启动子过表达leuA fbr 、ilvBN fbr、leuCD、lrp和brnFE基因，使用Ptuf启动子异源表达pntAB和bcd基因，将gapX基因自身PgapX启动子和ilvC基因自身PilvC启动子替换为Ptuf启动子，敲除brnQ、ldh、pqO、adhE、ackA、pta、ilvE基因。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，异丙基苹果酸合成酶基因leuA fbr 来源于谷氨酸棒杆菌，为解除亮氨酸反馈抑制的基因（ZL201910820591.X），乙酰羟酸合酶基因ilvBN fbr，来源于谷氨酸棒杆菌，为基因突变后的基因（CN201611248621.7）；吡啶核苷酸转氢酶pntAB基因来源于大肠杆菌，亮氨酸脱氢酶bcd基因来源于枯草芽孢杆菌。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，将PgapX启动子和PilvC启动子替换为Ptuf启动子，使用Ptuf启动子异源表达pntAB和bcd基因，敲除基因，使NADH与NADPH辅因子达到动态平衡状态，即gapX、ilvC、pntAB、bcd与ilvE基因的表达强度为1：1：1：1：0。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，敲除支链氨基酸内转运蛋白brnQ，过表达支链氨基酸外排蛋白brnFE和转录调控因子lrp，以增强亮氨酸的外排系统。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，敲除ldh、pqO、adhE、ackA、pta基因以富集亮氨酸的重要前体丙酮酸，并将其作为位点插入过表达的基因。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，所述出发菌株C. glutamicum（谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum）为C. glutamicum ATCC 13032。
优选的，上述亮氨酸生产菌株，Ptuf启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；leuA fbr 基因具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；ilvBN fbr基因具有序列表SEQ IDNO.3所示核苷酸序列；leuCD基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；PgapX启动子具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；PilvC启动子具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；pntAB基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；bcd基因具有序列表SEQ IDNO.8所示核苷酸序列；lrp基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；brnQ基因具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；brnFE基因具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；ldh基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列；pqO基因具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；adhE基因具有序列表SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；ackA基因具有序列表SEQID NO.15所示核苷酸序列；ilvE基因具有序列表SEQ ID NO.16所示核苷酸序列；pta基因具有序列表SEQ ID NO.17所示核苷酸序列。
上述亮氨酸生产菌株的构建方法，在出发菌株C. glutamicum基础上进行定向改造，具体步骤分为如下4个模块：
（1）增强亮氨酸代谢途径：使用Ptuf启动子过表达leuA fbr 、ilvBN fbr、leuCD基因，解除由leuA fbr 和ilvBN fbr基因编码酶的负反馈调节抑制作用，使其能够充分发挥作用，打通亮氨酸合成途径；
（2）NADH与NADPH辅因子动态平衡调节：将gapX基因的自身启动子PgapX替换为Ptuf启动子，将ilvC基因的自身启动子PilvC替换为Ptuf启动子，使用Ptuf启动子异源表达大肠杆菌来源的pntAB和枯草芽孢杆菌来源的bcd基因，敲除ilvE基因；gapX基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够利用两分子的NAD＋合成两分子的NADH，pntAB编码的吡啶核苷酸转氢酶能够利用一分子NADH形成一分子的NADPH，两个酶共形成一分子的NADH和一分子的NADPH；在亮氨酸合成途径中ilvC基因与ilvE基因编码的酶均需要NADPH辅因子催化，因此敲除ilvE基因并在其位置上整合来源枯草芽孢杆菌的bcd基因，此酶可以直接利用NADH辅因子，如此，一分子NADH和一分子的NADPH均被利用，并达到了动态平衡状态；
（3）亮氨酸转运蛋白优化：使用Ptuf启动子过表达转录调控因子 lrp 和brnFE基因，敲除brnQ基因，将胞内亮氨酸产物排到细胞外；
（4）富集丙酮酸：敲除ldh、pqO、adhE、ackA、pta基因，减少丙酮酸的消耗，使得更多的丙酮酸流向生产亮氨酸途径。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的构建方法，所述模块（2）中将gapX和ilvC基因自身启动子替换为Ptuf启动子，使用Ptuf启动子异源表达大肠杆菌来源的pntAB和枯草芽孢杆菌来源的bcd基因，即gapX、ilvC、pntAB、bcd使用相同的Ptuf启动子表达使其表达强度为1：1：1：1，敲除ilvE基因，使其不表达。
上述亮氨酸生产菌株在发酵生产亮氨酸方面的应用。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的应用，在适宜发酵条件下以所述工程菌在培养基中发酵得到亮氨酸。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的应用，培养基包括但不限于：碳源、氮源、无机盐、维生素等，发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。所述培养基均可通过常规方法获得并用于亮氨酸生产，发酵条件可以调整以期适应菌株生产特性。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的应用，具体步骤如下：
①斜面培养：取亮氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，32-34℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②发酵罐种子培养：取固体斜面菌种接种至发酵罐中进行发酵，培养温度32-34℃，培养时间10-15h，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2；
③发酵罐发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为20-50%，残糖控制为1.0%-2.0%，发酵时间≤55 h。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20-30 g/L，酵母2-3 g/L，蛋白胨1-2 g/L，玉米浆干粉10-15 g/L，豆浓10-15 ml/L ，(NH4)2SO41-2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 3-4 g/L，MgSO4·7H2O 1-3 g/L，柠檬酸1.5-2.5 g/L，VH0.2-0.5 mg/L，VB10.2-0.5 mg/L ，FeSO4·7H2O 10-30 mg/L，其余为水。
优选的，上述亮氨酸生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：葡萄糖25-35 g/L，酵母2-4 g/L，蛋白胨1-2 g/L，玉米浆干粉10-20 g/L，豆浓10-20 ml/L ，(NH4)2SO41-2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 3-4 g/L，MgSO4·7H2O 1-3 g/L，柠檬酸1.5-2.5 g/L，VH0.2-0.5 mg/L，VB10.2-0.5 mg/L，FeSO4·7H2O 10-30 mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述亮氨酸生产菌株，通过亮氨酸代谢合成途径采用从头合成的定向改造方法获得，此菌株增强了亮氨酸代谢途径，通过更改启动子和引入外源基因的手段达到了NADPH辅因子动态平衡，优化了亮氨酸外排系统，敲除了以丙酮酸前体生成副产物的基因，使得更多的丙酮酸流向生产亮氨酸的途径中，所述菌株能够以生产成本较低的葡萄糖作为碳源，具有生产成本低，稳定性高的特点，具有大规模生产亮氨酸的潜力。
附图说明
图1为亮氨酸生产菌株从头合成途径基因改造过程图。
图2为pXT01质粒图谱。
图3为pK18mobsacB质粒图谱。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
如图1所示，根据整个菌株改造过程的代谢路径示意图及前述技术方案对菌种进行改造，获得亮氨酸生产菌株LU9。
具体亮氨酸生产菌株构建步骤如下：步骤1：在乳酸脱氢酶ldh位点使用Ptuf启动子控制leuA fbr 基因过表达；步骤2：在丙酮酸脱氢酶pqO位点使用Ptuf启动子控制ilvBN fbr基因过表达；步骤3：在乙醇脱氢酶adhE位点使用Ptuf启动子控制leuCD基因过表达；步骤4：将甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapX基因的PgapX启动子替换为Ptuf启动子，步骤5：将羟酸还原异构酶ilvC基因的PilvC启动子替换为Ptuf启动子；步骤6：在乙酸激酶ackA位点使用Ptuf启动子控制吡啶核苷酸转氢酶pntAB基因异源表达；步骤7：在亮氨酸脱氢酶ilvE位点使用Ptuf启动子控制亮氨酸脱氢酶bcd基因异源表达；步骤8：在磷酸转乙酰酶pta位点使用Ptuf启动子控制转录调控因子 lrp 基因过表达；步骤9：在支链氨基酸内转运蛋白brnQ位点使用Ptuf启动子控制支链氨基酸外排蛋白brnFE基因过表达。
其中leuA fbr 基因突变已公开于中国专利：ZL201910820591.X，ilvBN fbr基因突变已公开于中国专利：CN201611248621.7，Ptuf启动子来源于pXT01质粒，pntAB基因来源于大肠杆菌，bcd来源于枯草芽孢杆菌，本发明中所涉及的基因无特别说明时均来源于谷氨酸棒杆菌。
本发明涉及的基因序列：Ptuf启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；leuA fbr 基因具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；ilvBN fbr基因具有序列表SEQ IDNO.3所示核苷酸序列；leuCD基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；PgapX基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；PilvC基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；pntAB基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；bcd基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列； lrp 基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；brnQ基因具有序列表SEQID NO.10所示核苷酸序列；brnFE基因具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；ldh基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列；pqO基因具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；adhE基因具有序列表SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；ackA基因具有序列表SEQ IDNO.15所示核苷酸序列；ilvE基因具有序列表SEQ ID NO.16所示核苷酸序列；pta基因具有序列表SEQ ID NO.17所示核苷酸序列。
实施例中所用的出发菌株为C. glutamicumATCC 13032（市售菌株）。
实施例中构建菌株所用引物序列见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
引物名称 序列号 引物序列（5’-3’）
ldh-U-S SEQ ID NO.18 ACATGATTACGAATTCATGAAAGAAACCGTCGGTAACA
ldh-U-A SEQ ID NO.19 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACCACCAGCTGGAGGCGGGTCTCGCCT
PtufleuAfbr-S SEQ ID NO.20 AGGCGAGACCCGCCTCCAGCTGGTGGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufleuAfbr-A SEQ ID NO.21 CGGAGATCAATGCATCGTTAGGAGACATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
leuAfbr-S SEQ ID NO.22 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGTCTCCTAACGATGCATTGATCTCCG
leuAfbr-A SEQ ID NO.23 CTTGGTTCTGCAGGATTGCGCGGGTGATTAGACGCCGCCAGCCAGGACTG
ldh-D-S SEQ ID NO.24 CAGTCCTGGCTGGCGGCGTCTAATCACCCGCGCAATCCTGCAGAACCAAG
ldh-D-A SEQ ID NO.25 GCCTGCAGGTCGACTCTAGATTAGAAGAACTGCTTCTGA
pqO-U-S SEQ ID NO.26 TATGACATGATTACGAATTCATGGCACACAGCTACGCAGAACAATTAATTGA
pqO-U-A SEQ ID NO.27 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACTAGTGGAATTGGAATAAGTACCGTC
PtufilvBNfbr-S SEQ ID NO.28 GACGGTACTTATTCCAATTCCACTAGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufilvBNfbr-A SEQ ID NO.29 TGGGCTGTTGAGAAGCTGCCACATTCACTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
ilvBNfbr-S SEQ ID NO.30 CACCACGAAGTCCAGGAGGAGTGAATGTGGCAGCTTCTCAACAGCCCA
ilvBNfbr-A SEQ ID NO.31 AGAATAAGGGAAATCCGTACCCAATATTAGATCTTGGCCGGAGCCATGGT
pqO-D-S SEQ ID NO.32 ACCATGGCTCCGGCCAAGATCTAATATTGGGTACGGATTTCCCTTATTCT
pqO-D-A SEQ ID NO.33 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAACTTTGCGCACCAATCG
adhE-U-S SEQ ID NO.34 TATGACATGATTACGAATTCATGGTTTATGCCCTAGGCCT
adhE-U-A SEQ ID NO.35 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACTGCGTTGGGCTGCGGCGTGTGTCTG
PtufleuCD-S SEQ ID NO.36 CAGACACACGCCGCAGCCCAACGCAGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufleuCD-A SEQ ID NO.37 AGGTGCTGTTCTCCACGGGGCTGGTCATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
leuCD-S SEQ ID NO.38 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGACCAGCCCCGTGGAGAACAGCACCT
leuCD-A SEQ ID NO.39 CCAGCGGGATGCCGTGTCGTTCTGATGTTTTTAAGCGTTAGTGCGTGGCTTAAA
adhE-D-S SEQ ID NO.40 TTTAAGCCACGCACTAACGCTTAAAAACATCAGAACGACACGGCATCCCGCTGG
adhE-D-A SEQ ID NO.41 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGATCATGAGGGGCTCGCGCTC
PgapX-U-S SEQ ID NO.42 TATGACATGATTACGAATTCACCGCGAGATCTTGGACGCCGCCCCAGCACTT
PgapX-U-A SEQ ID NO.43 CCTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACTTAGCCCAAAGCGGAAGGTGTTA
PtufPgapX-S SEQ ID NO.44 TAACACCTTCCGCTTTGGGCTAAGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufPgapX-A SEQ ID NO.45 TCCAGTCCTTGTGGTTGTGCGTCATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
PgapX-D-S SEQ ID NO.46 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGACGCACAACCACAAGGACTGGA
PgapX-D-A SEQ ID NO.47 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGACGCGCAAAATATCCAAGGA
PilvC-U-S SEQ ID NO.48 TATGACATGATTACGAATTCGCGGACAGCACCAACCGTCCGCAGATCGTCGA
PilvC-U-A SEQ ID NO.49 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACTTAGATCTTGGCCGGAGCCATGGTC
PtufPilvC-S SEQ ID NO.50 GACCATGGCTCCGGCCAAGATCTAAGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufPilvC-A SEQ ID NO.51 TCATAAAGCAGTTCAATAGCCATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
PilvC-D-S SEQ ID NO.52 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGGCTATTGAACTGCTTTATGA
PilvC-D-A SEQ ID NO.53 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGACGTTGGTGAAGATTTCTGC
ackA-U-S SEQ ID NO.54 TATGACATGATTACGAATTCAAAACTCTGCCATCGACGAGCCATATGTTTCT
ackA-U-A SEQ ID NO.55 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACAATGAGATCGCGGATCATTTCCACG
PtufpntAB-S SEQ ID NO.56 CGTGGAAATGATCCGCGATCTCATTGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufpntAB-A SEQ ID NO.57 GTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
pntAB-S SEQ ID NO.58 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGCGAATTGGCATACCAAGAGAAC
pntAB-A SEQ ID NO.59 TTCGGGTACCCATGACAAGGCCCGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCAT
ackA-D-S SEQ ID NO.60 ATGCAATCCTGAAAGCTCTGTAACGGGCCTTGTCATGGGTACCCGAA
ackA-D-A SEQ ID NO.61 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAACAAACTGGGCATTTTCAC
ilvE-U-S SEQ ID NO.62 TATGACATGATTACGAATTCATTCTTGCCGCACCGAAGTTCGGTAAGTTCTT
ilvE-U-A SEQ ID NO.63 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACCATGAATGGGCGCAGGTAGAGGGAA
Ptufbcd-S SEQ ID NO.64 TTCCCTCTACCTGCGCCCATTCATGGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
Ptufbcd-A SEQ ID NO.65 CGTATTTCTCCATATATTTAAAAAGTTCCATTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
bcd-S SEQ ID NO.66 CACCACGAAGTCCAGGAGGAATGGAACTTTTTAAATATATGGAGAAATACG
bcd-A SEQ ID NO.67 CCCAAGGTTCATGCCACCCATTTCTTCGTTAACGTCTGCTTAATACACTGTGGCC
ilvE-D-S SEQ ID NO.68 GGCCACAGTGTATTAAGCAGACGTTAACGAAGAAATGGGTGGCATGAACCTTGGG
ilvE-D-A SEQ ID NO.69 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGGGGTGATAACAGCTGCAGTACC
pta-U-S SEQ ID NO.70 TATGACATGATTACGAATTCGGAAGAAGTAGCAGCAGACCTTGGAGTTCGGC
pta-U-A SEQ ID NO.71 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACAGCAACGTGCTTGCCTTGCTTGTCT
Ptuflrp-S SEQ ID NO.72 AGACAAGCAAGGCAAGCACGTTGCTGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
Ptuflrp-A SEQ ID NO.73 CAATGGAATCTAGCTTCATATATTGCACTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
lrp-S SEQ ID NO.74 CACCACGAAGTCCAGGAGGAGTGCAATATATGAAGCTAGATTCCATTG
lrp-A SEQ ID NO.75 AGCACAGTCGCCGAATGCCCACAGTCGCCTCACACCTGGGGGCGAGCTGGTTTCAC
pta-D-S SEQ ID NO.76 GGTGAAACCAGCTCGCCCCCAGGTGTGAGGCGACTGTGGGCATTCGGCGACTGTG
pta-D-A SEQ ID NO.77 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCACACCCGGGTCGACGGCGGCGT
brnQ-U-S SEQ ID NO.78 TATGACATGATTACGAATTCCTAGCAACGAGTGTTCTGCTCCCGGTGCTGGC
brnQ-U-A SEQ ID NO.79 CTTCGGATCTAAACGATCTGTTAACTCTGCAATGCCATTCGGATTCCACG
PtufbrnFE-S SEQ ID NO.80 CGTGGAATCCGAATGGCATTGCAGAGTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAG
PtufbrnFE-A SEQ ID NO.81 GTTCCAGGGCTGCCTTGGATGGCGACACTCCTCCTGGACTTCGTGGTG
brnFE-S SEQ ID NO.82 CACCACGAAGTCCAGGAGGAGTGTCGCCATCCAAGGCAGCCCTGGAAC
brnFE-A SEQ ID NO.83 AAGATAAACCAGCGCCAACAAAATTCCGTTAGAAAAGATTCACCAGTCCAACAAA
brnQ-D-S SEQ ID NO.84 TTTTGTTGGACTGGTGAATCTTTTCTAACGGAATTTTGTTGGCGCTGGTTTATCTT
brnQ-D-A SEQ ID NO.85 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGTGGCCCAGACGTGGTACTT
实施例中所述HS酶PCR体系见表2。
表2 HS酶PCR扩增体系
组分 体积（50 μL）
DNA模板 1 μL
上游引物（10 µmol/L） 1 μL
下游引物（10 µmol/L） 1 μL
dNTP mixture（10 mmol/L） 4 μL
5×Buffer 10 μL
HS酶（5 U/μL） 0.5 μL
ddH2O 32.5 μL
实施例中所述PCR反应程序见表3。
表3 PCR扩增程序
步骤 温度 时间
1 95℃ 5 min
2 98℃ 10 s
3 55℃ 30 s
4 72℃ 1 min/kb
5 从步骤2开始循环35次
6 72℃ 10 min
7 22℃ 结束
实施例中所述HS酶重叠PCR体系见表4。
表4 重叠PCR扩增体系
组分 体积（50 μL）
模板 2.0 μL
上游引物（10 µmol/L） 1.0 μL
下游引物（10 µmol/L） 1.0 μL
dNTP mixture（10 mmol/L） 4.0 μL
5×Buffer 10.0 μL
HS酶（5 U/μL） 0.5 μL
ddH2O 31.5 μL
实施例中菌株构建所涉及的质粒见表5。
表5菌株构建过程中所涉及的质粒
质粒名称 质粒特性
pK18mobsacB KmR
pXT01 CmR，携带Ptuf启动子片段
pK18mobsacB-Δldh::PtufleuA fbr KmR，携带重叠片段Δldh::PtufleuA fbr
pK18mobsacB-ΔpqO::PtufilvBN fbr KmR，携带重叠片段ΔpqO::PtufilvBN fbr
pK18mobsacB-ΔadhE::PtufleuCD KmR，携带重叠片段ΔadhE::PtufleuCD
pK18mobsacB-ΔPgapX::Ptuf KmR，携带重叠片段ΔPgapX::Ptuf
pK18mobsacB-ΔPilvC::Ptuf KmR，携带重叠片段ΔPilvC::Ptuf
pK18mobsacB-ΔackA::PtufpntAB KmR，携带重叠片段ΔackA::PtufpntAB
pK18mobsacB-ΔilvE::Ptufbcd KmR，携带重叠片段ΔilvE::Ptufbcd
pK18mobsacB-Δpta::Ptuf lrp KmR，携带重叠片段Δpta::Ptuf lrp
pK18mobsacB-ΔbrnQ::PtufbrnFE KmR，携带重叠片段ΔbrnQ::PtufbrnFE
亮氨酸基因工程菌命名为LU9的应用包括在适宜发酵条件下，在培养基中进行发酵培养生产亮氨酸。
实施例1
本实施例旨在说明菌株LU9的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
1、Δldh::PtufleuA fbr
①pK18mobsacB-Δldh::PtufleuA fbr 质粒载体构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，分别以ldh-U-S、ldh-U-A、ldh-D-S、ldh-D-A与leuA fbr -S、leuA fbr -A为引物，通过HS酶PCR扩增获得上游同源臂、下游同源臂和目的基因。以pXT01质粒（如图2所示）为模板，以PtufleuA fbr -S、PtufleuA fbr -A为引物，通过HS酶PCR扩增获得Ptuf启动子片段。以片段为模板，通过HS酶重叠PCR获得Δldh::PtufleuA fbr 重叠片段并回收，所述基因重叠片段由ldh上游同源臂、Ptuf启动子、leuA fbr 目的基因和ldh下游同源臂组成。
提取pK18mobsacB质粒（如图3所示），使用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒，形成线载并回收。
将得到的重叠片段与线载使用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶连接形成质粒，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，筛选获得阳性转化子并提取pK18mobsacB-Δldh::PtufleuA fbr 质粒。
②在谷氨酸棒杆菌上敲除ldh并整合PtufleuA fbr
将构建好的质粒电击转化到ATCC 13032感受态细胞中，涂布于0.01 mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32 ℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段，在卡那霉素抗性平板长出的菌落为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32 ℃培养。分别在2 h、4 h、6 h接50 μL发酵液涂布于含有20%蔗糖的BHI平板，32 ℃，培养24 h。将单菌落对点于含有20%蔗糖的BHI平板和0.01 mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在20%蔗糖的BHI平板生长且在0.01 mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段正确，即为发生双交换，整合成功的单菌落LU1。
2、ΔpqO::PtufilvBN fbr
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用pqO-U-S、pqO-U-A、pqO-D-S、pqO-D-A、ilvBN fbr -S、ilvBN fbr -A与PtufilvBN fbr -S、PtufilvBN fbr -A引物来构建pK18mobsacB-ΔpqO::PtufilvBN fbr 质粒。所用的感受态为LU1，获得菌株LU2。
3、ΔadhE::PtufleuCD
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用adhE-U-S、adhE-U-A、adhE-D-S、adhE-D-A、leuCD-S、leuCD-A与PtufleuCD-S、PtufleuCD-A引物来构建pK18mobsacB-ΔadhE::PtufleuCD质粒。所用的感受态为LU2，获得菌株LU3。
4、ΔPgapX::Ptuf
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用的引物为PgapX-U-S、PgapX-U-A、PgapX-D-S、PgapX-D-A、与PtufPgapX-S、PtufPgapX-A，基因重叠片段由PgapX上游同源臂、Ptuf启动子和PgapX下游同源臂组成，构建的质粒为pK18mobsacB-ΔPgapX::Ptuf。所用的感受态为LU3，获得菌株LU4。
5、ΔPilvC::Ptuf
具有步骤1中相同操作方法，不同之处在于，使用的引物为PilvC-U-S、PilvC-U-A、PilvC-D-S、PilvC-D-A、与PtufPilvC-S、PtufPilvC-A，基因重叠片段由PilvC上游同源臂、Ptuf启动子和PilvC下游同源臂组成，构建的质粒为pK18mobsacB-ΔPilvC::Ptuf。所用的感受态为LU4，获得菌株LU5。
6、ΔackA::PtufpntAB
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用ackA-U-S、ackA-U-A、ackA-D-S、ackA-D-A、pntAB-S、pntAB-A与PtufpntAB-S、PtufpntAB-A引物来构建pK18mobsacB-ΔackA::PtufpntAB质粒。所用的感受态为LU5，获得菌株LU6。
7、ΔilvE::Ptufbcd
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用ilvE-U-S、ilvE-U-A、ilvE-D-S、ilvE-D-A、bcd-S、bcd-A与Ptufbcd-S、Ptufbcd-A引物来构建pK18mobsacB-ΔilvE::Ptufbcd质粒。所用的感受态为LU6，获得菌株LU7。
8、Δpta::Ptuf lrp
具有1中相同操作方法，不同之处在于，使用pta-U-S、pta-U-A、pta-D-S、pta-D-A、 lrp -S、 lrp -A与Ptuf lrp -S、Ptuf lrp -A引物来构建pK18mobsacB-Δpta::Ptuf lrp 质粒。所用的感受态为LU7，获得菌株LU8。
9、ΔbrnQ::PtufbrnFE
具有①中相同操作方法，不同之处在于，使用brnQ-U-S、brnQ-U-A、brnQ-D-S、brnQ-D-A、brnFE-S、brnFE-A与PtufbrnFE-S、PtufbrnFE-A引物来构建pK18mobsacB-ΔbrnQ::PtufbrnFE质粒。所用的感受态为LU8，获得菌株LU9。
实施例2
本实施例旨在说明工程菌LU9的发酵罐应用，具体步骤为：
①斜面培养：菌种接种在斜面培养基上，32-34℃培养15h，斜面培养基选用通用LB固体培养基。
②5 L发酵罐种子培养：取固体斜面菌种接种至5 L发酵罐中进行发酵。培养温度32-34℃，培养时间13h，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2。种子培养基为葡萄糖25 g/L，酵母2.5 g/L，蛋白胨1.5g/L，玉米浆干粉13 g/L，豆浓13 ml/L ，(NH4)2SO41.8 g/L，K2HPO4·3H2O 3.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸2 g/L，VH0.4 mg/L，VB10.4mg/L ，FeSO4·7H2O 20 mg/L。
③5 L发酵罐发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为20-50%，残糖控制为1.0%-2.0%，发酵时间≤55 h；采用的发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1.5 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓15 ml/L ，(NH4)2SO41.8 g/L，K2HPO4·3H2O 3.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸2 g/L，VH0.4 mg/L，VB10.4 mg/L ，FeSO4·7H2O20 mg/L。
实验以野生型谷氨酸棒杆菌为对照组，经过52 h发酵验证，野生型谷氨酸棒杆菌未能积累亮氨酸，工程菌LU9积累了51.8 g/L亮氨酸，转化率达到了29.5%，证明了菌株LU9从头构建的有效性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种亮氨酸生产菌株，其特征在于：为菌株LU9，是利用代谢工程改造方法在出发菌株C. glutamicum基础上进行进一步改造获得的亮氨酸辅因子平衡生产菌株，具体为：使用Ptuf启动子过表达leuA fbr 、ilvBN fbr、leuCD、lrp和brnFE基因，使用Ptuf启动子异源表达pntAB和bcd基因，将gapX基因自身PgapX启动子和ilvC基因自身PilvC启动子替换为Ptuf启动子，敲除brnQ、ldh、pqO、adhE、ackA、pta、ilvE基因。
2.根据权利要求1所述的亮氨酸生产菌株，其特征在于：所述出发菌株C. glutamicum为C. glutamicum ATCC 13032。
3.根据权利要求1所述的亮氨酸生产菌株，其特征在于：所述Ptuf启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；leuA fbr 基因具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；ilvBN fbr基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；leuCD基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；PgapX启动子具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；PilvC启动子具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；pntAB基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；bcd基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；lrp基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；brnQ基因具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；brnFE基因具有序列表SEQID NO.11所示核苷酸序列；ldh基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列；pqO基因具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；adhE基因具有序列表SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；ackA基因具有序列表SEQ ID NO.15所示核苷酸序列；ilvE基因具有序列表SEQ IDNO.16所示核苷酸序列；pta基因具有序列表SEQ ID NO.17所示核苷酸序列。
4.权利要求1-3之一所述亮氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株C. glutamicum基础上进行定向改造，具体步骤分为如下4个模块：
（1）增强亮氨酸代谢途径：使用Ptuf启动子过表达leuA fbr 、ilvBN fbr、leuCD基因；
（2）NADH与NADPH辅因子动态平衡调节：将gapX基因的自身启动子PgapX替换为Ptuf启动子，将ilvC基因的自身启动子PilvC替换为Ptuf启动子，使用Ptuf启动子异源表达大肠杆菌来源的pntAB和枯草芽孢杆菌来源的bcd基因，敲除ilvE基因；
（3）亮氨酸转运蛋白优化：使用Ptuf启动子过表达lrp和brnFE基因，敲除brnQ基因；
（4）富集丙酮酸：敲除ldh、pqO、adhE、ackA、pta基因。
5.权利要求1-3之一所述亮氨酸生产菌株在发酵生产亮氨酸方面的应用。
6.根据权利要求5所述的亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①斜面培养：取亮氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，32-34℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②发酵罐种子培养：取固体斜面菌种接种至发酵罐中进行发酵，培养温度32-34℃，培养时间10-15h，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2；
③发酵罐发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加20-25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为20-50%，残糖控制为1.0%-2.0%，发酵时间≤55 h。
7.根据权利要求6所述的亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20-30 g/L，酵母2-3 g/L，蛋白胨1-2 g/L，玉米浆干粉10-15 g/L，豆浓10-15 ml/L ，(NH4)2SO4 1-2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 3-4 g/L，MgSO4·7H2O 1-3 g/L，柠檬酸1.5-2.5 g/L，VH0.2-0.5 mg/L，VB1 0.2-0.5 mg/L ，FeSO4·7H2O 10-30 mg/L，其余为水。
8.根据权利要求6所述的亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤③采用的发酵培养基为：葡萄糖25-35 g/L，酵母2-4 g/L，蛋白胨1-2 g/L，玉米浆干粉10-20 g/L，豆浓10-20 ml/L ，(NH4)2SO4 1-2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 3-4 g/L，MgSO4·7H2O 1-3 g/L，柠檬酸1.5-2.5 g/L，VH 0.2-0.5 mg/L，VB1 0.2-0.5 mg/L，FeSO4·7H2O 10-30 mg/L，其余为水。
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