CN111763699A

CN111763699A - 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用

Info

Publication number: CN111763699A
Application number: CN201910260899.3A
Authority: CN
Inventors: 雷云凤; 周豪宏; 陈玲; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN111763699B

Abstract

本发明提供用于发酵生产1,5‑戊二胺的重组DNA、菌株及其应用。本发明通过增加L‑赖氨酸转运蛋白LysP的含量，加速L‑赖氨酸向细胞内的运输过程，改善菌株对高浓度L‑赖氨酸的耐受能力，同时促进L‑赖氨酸的生产，进而提高代谢产物1,5‑戊二胺的产量。

Description

用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其应用。

背景技术

通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。赖氨酸脱羧酶可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。例如，在大肠杆菌(E.coli)中，尸胺是通过两种赖氨酸脱羧酶多肽CadA和LdcC直接从L-赖氨酸生物合成的。

目前，1,5-戊二胺的生物合成主要利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。在L-赖氨酸的发酵生产路径中，将赖氨酸脱羧酶(通常为CadA或LdcC)，添加至产赖氨酸的微生物(例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌)中，以便将赖氨酸生物合成途径延长至1,5-戊二胺生物合成途径。或者，对于体外酶催化，可以将细菌工程化或诱导以产生赖氨酸脱羧酶(通常为CadA或LdcC)，然后其可用于通过脱羧作用将赖氨酸转化为1,5-戊二胺。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以与二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。

但是，目前L-赖氨酸延长发酵生产1,5-戊二胺的路径中，1,5-戊二胺产量有限且收率较低。因此，亟需开发一种具有较高收率的生产尸胺的方法。

发明内容

本发明的目的是提供L-赖氨酸透性酶基因在微生物发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

本发明的另一目的是提供用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其应用。

本发明构思如下：在大肠杆菌中，L-赖氨酸透性酶LysP和膜上整合的pH感应器CadC，共同诱导L-赖氨酸依赖的菌株在酸性压力条件下的适应性。由lysP基因编码的L-赖氨酸透性酶(L-lysine permease，LysP)是将细胞外L-赖氨酸转运至细胞内的专一的通透酶。本发明通过增加L-赖氨酸转运蛋白LysP的含量，加速L-赖氨酸向细胞内的运输过程，改善菌株对高浓度L-赖氨酸的耐受能力，促进L-赖氨酸的生产，进而提高代谢产物1,5-戊二胺的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供L-赖氨酸透性酶基因在微生物发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

本发明中，所述L-赖氨酸透性酶基因，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

本发明所述L-赖氨酸透性酶(L-赖氨酸转运蛋白)来自于微生物；优选来自大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、绿脓假单胞菌(Pesudomonaspyocyaneum)、乳球菌属(Lactococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

不同微生物来源的L-赖氨酸透性酶的氨基酸序列相似性比对结果见图1。

第二方面，本发明提供用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA，所述重组DNA至少包括L-赖氨酸透性酶基因，以及1,5-戊二胺生物合成途径的相关基因和/或反馈抑制脱敏的相关基因。所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使用两种或两种以上质粒时，优选使用具有稳定的分配系统的质粒，该系统使得这些质粒能在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。

优选地，所述重组DNA至少包括L-赖氨酸透性酶基因和L-赖氨酸脱羧酶基因。

更优选地，所述L-赖氨酸透性酶基因是来自大肠杆菌的lysP基因(SEQ ID NO:1)或lysP基因的片段，所述L-赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌的cadA基因或ldcC基因。所述L-赖氨酸透性酶还可以是上述来源的L-赖氨酸透性酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。大肠杆菌L-赖氨酸透性酶LysP的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。

第三方面，本发明提供含有所述重组DNA的生物材料，所述生物材料包括但不限于表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供一种表达载体，包含L-赖氨酸透性酶基因和L-赖氨酸脱羧酶基因，以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒。

优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌的细胞。

优选地，所述骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101以及它们的衍生质粒。

优选地，所述表达载体含有启动子、cadA、lysP的DNA序列或含有启动子、ldcC、lysP的DNA序列。

更优选地，所述表达质粒载体包含启动子-cadA-启动子-lysP、启动子-ldcC-启动子-lysP、启动子-lysP-启动子-cadA或启动子-lysP-启动子-ldcC的DNA序列。

第五方面，本发明提供高产1,5-戊二胺的工程菌，其包含所述重组DNA，且所述工程菌的出发菌株为具有生产L-赖氨酸能力的菌株。

优选地，所述出发菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种。

更优选地，所述出发菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3，保藏编号为CCTCC NO:M 2018456。其是以大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12)为出发菌株，通过ARTP物理诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株M11-A3。根据布达佩斯条约，大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 2018456，保藏日期2018年7月6日。

所述工程菌中包含：启动子-cadA-启动子-lysP的DNA序列或启动子-ldcC-启动子-lysP的DNA序列。

其中，所述启动子选自plac、trp、tac、trc或PL等。

优选地，所述工程菌中包含：plac-cadA-plac-lysP的DNA序列plac-ldcC-plac-lysP的DNA序列。

第六方面，本发明提供所述工程菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

第七方面，本发明提供1,5-戊二胺的生产方法，包括在发酵培养基中对高产1,5-戊二胺的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供了一种高效生产1,5-戊二胺的方法，通过增加L-赖氨酸转运蛋白LysP的含量，加速L-赖氨酸向细胞内的运输过程，改善菌株对高浓度L-赖氨酸的耐受能力，同时促进L-赖氨酸的生产，进而提高代谢产物1,5-戊二胺的产量。

附图说明

图1为本发明几种微生物来源的L-赖氨酸透性酶的氨基酸序列相似性比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株

从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655 K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过ARTP物理诱变的方法，以及L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。

接种MG1655菌株至50mL的LB培养基，待菌体浓度到OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至ARTP仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释10²和10³倍后，全部涂板M9培养基(其中培养基中添加4mg/L的L-赖氨酸类似物AEC)。在未添加AEC(5-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)的平板上分别涂布未诱变菌(稀释10⁵倍的菌液)，以及诱变处理后的菌体(稀释10³倍的菌液)。37℃培养两天后，共获得L-赖氨酸类似物耐受能力提高的菌株36株。挑取单菌落至30μL无菌生理盐水中，从筛选平板上蘸取菌体获得浑浊的菌液。取3μL划线至不同浓度的AEC平板进行复筛。通过使用不断增加浓度的L-赖氨酸类似物的添加平板继续重复筛选。最后确认M11菌株耐受能力最强。

从新突变株M11出发，通过ARTP物理诱变和高浓度L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株M11，分别接种于不含抗生素的5ml种子培养基[(含有4％葡萄糖,0.1％ KH₂PO₄,0.1％ MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％ FeSO₄,0.001％ MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.)，0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)]进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72h，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表1)。

表1核磁检测24株新突变株与出发菌株M11相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

注：d25表示发酵液稀释25倍之后的测定结果。

如表1所示，发酵72h后，突变株M11-A3的赖氨酸的产量为3.57g/kg，相比于出发株M11的L-赖氨酸产量提升26％，且突变株与对照相比生长无显著差异。为提高筛选条件，将发酵时间缩短为48h。三次重复发酵出发株和该突变株，确认突变株M11-A3的产量为3.00g/kg，相对L-赖氨酸产量提升维持在24～26％。M11-A3菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018456。

实施例2构建表达载体pUC18-plac-cadA、pUC18-plac-ldcC、pUC18-plac-cadA-plac-lysP和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP

首先，构建重组表达质粒pUC18-plac-cadA和pUC18-plac-ldcC。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入与pUC18载体HindIII单酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO：3)获得引物plac-F(SEQ ID NO：4)。在cadA基因序列的两端引入与plac序列及载体HindIII单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO：6)和(SEQ ID NO：7)获得引物对cadA-F/R(SEQID NO：8和9)。在ldcC基因序列的两端引入与plac序列及载体HindIII单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO：10)和(SEQ ID NO：11)获得引物对ldcC-F/R(SEQ ID NO：12和13)。以pUC18质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F/R SEQ ID NO：4)和(SEQ ID NO：5)，通过PCR扩增获得plac片段(SEQ ID NO：14)。以MG1655的基因组DNA作为模板，分别使用引物对cadA-F/R和ldcC-F/R，通过PCR扩增获得cadA片段(SEQ ID NO：15)和ldcC片段(SEQ IDNO：16)。将plac、cadA片段、ldcC片段和HindIII单酶切后的pUC18载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将plac、cadA(或ldcC)片段和载体进行重组。重组后的混合物分别转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-cadA和plac-ldcC表达序列已分别插入到质粒载体pUC18的HindIII位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-cadA和pUC18-plac-ldcC。

然后，构建重组表达质粒pUC18-plac-cadA-plac-lysP和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在lysP基因序列的两端引入与pUC18-plac-cadA或pUC18-plac-ldcC载体SacI/XbaI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO：17)和(SEQ ID NO：18)，获得引物对lysP-F/R(SEQ ID NO：19和20)。以大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物对lysP-F/R(SEQID NO：19和20)，通过PCR扩增获得lysP基因片段(SEQ ID NO：21)。将lysP基因片段分别与SacI和XbaI酶切后的pUC18-plac-cadA和pUC18-plac-ldcC载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将lysP基因片段分别与上述两个载体进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实lysP基因已插入到质粒载体pUC18-plac-cadA和pUC18-plac-ldcC的SacI和XbaI位点之间，得到正确的表达载体pUC18-plac-cadA-plac-lysP和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP。

实施例3构建1,5-戊二胺生产菌株和生产1,5-戊二胺

首先，构建L-赖氨酸生产菌株：使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态。将实施例2构建得到的表达载体pUC18-plac-cadA、pUC18-plac-ldcC、pUC18-plac-cadA-plac-lysP和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP分别转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

上述含有pUC18-plac-cadA、pUC18-plac-ldcC、pUC18-plac-cadA-plac-lysP和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP质粒的突变株各选取3个转化子和出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(同实施例1)平板上进行筛选。进一步地，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表2)。

表2核磁检测突变株与出发菌株相比的戊二胺产量及OD₆₀₀

如表2所示，含有质粒pUC18-plac-cadA和pUC18-plac-cadA-plac-lysP的转化株的戊二胺的产量分别为1.47g/kg和2.07g/kg。两个转化株的L-赖氨酸转化率分别为82.5％和93.1％。含有质粒pUC18-plac-ldcC和pUC18-plac-ldcC-plac-lysP的转化株的戊二胺的产量分别为1.31g/kg和1.87g/kg，两个转化株的L-赖氨酸转化率分别为78.0％和91.5％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析，lysP促进胞外Lysine向细胞内的运送，lysP和cadA基因或ldcC基因同时过表达均能够加速L-赖氨酸高效转化为戊二胺，菌株M11-A3/pUC18-plac-cadA-plac-lysP和M11-A3/pUC18-plac-ldcC-plac-lysP可用于戊二胺的生产。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

CIBT美国公司

<120> 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其应用

<130> KHP181118795.1

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atggtttccg aaactaaaac cacagaagcg ccgggcttac gccgtgaatt aaaggcgcgt 60

cacctgacga tgattgccat tggcggttcc atcggtacag gtctttttgt tgcctctggc 120

gcaacgattt ctcaggcagg tccgggcggg gcattgctct cgtatatgct gattggcctg 180

atggtttact tcctgatgac cagtctcggt gaactggctg catatatgcc ggtttccggt 240

tcgtttgcca cttacggtca gaactatgtt gaagaaggct ttggcttcgc gctgggctgg 300

aactactggt acaactgggc ggtgactatc gccgttgacc tggttgcagc tcagctggtc 360

atgagctggt ggttcccgga tacaccgggc tggatctgga gtgcgttgtt cctcggcgtt 420

atcttcctgc tgaactacat ctcagttcgt ggctttggtg aagcggaata ctggttctca 480

ctgatcaaag tcacgacagt tattgtcttt atcatcgttg gcgtgctgat gattatcggt 540

atcttcaaag gcgcgcagcc tgcgggctgg agcaactgga caatcggcga agcgccgttt 600

gctggtggtt ttgcggcgat gatcggcgta gctatgattg tcggcttctc tttccaggga 660

accgagctga tcggtattgc tgcaggcgag tccgaagatc cggcgaaaaa cattccacgc 720

gcggtacgtc aggtgttctg gcgaatcctg ttgttctatg tgttcgcgat cctgattatc 780

agcctgatta ttccgtacac cgatccgagc ctgctgcgta acgatgttaa agacatcagc 840

gttagtccgt tcaccctggt gttccagcac gcgggtctgc tctctgcggc ggcggtgatg 900

aacgcagtta ttctgacggc ggtgctgtca gcgggtaact ccggtatgta tgcgtctact 960

cgtatgctgt acaccctggc gtgtgacggt aaagcgccgc gcattttcgc taaactgtcg 1020

cgtggtggcg tgccgcgtaa tgcgctgtat gcgacgacgg tgattgccgg tctgtgcttc 1080

ctgacctcca tgtttggcaa ccagacggta tacctgtggc tgctgaacac ctccgggatg 1140

acgggtttta tcgcctggct ggggattgcc attagccact atcgcttccg tcgcggttac 1200

gtattgcagg gacacgacat taacgatctg ccgtaccgtt caggtttctt cccactgggg 1260

ccgatcttcg cattcattct gtgtctgatt atcactttgg gccagaacta cgaagcgttc 1320

ctgaaagata ctattgactg gggcggcgta gcggcaacgt atattggtat cccgctgttc 1380

ctgattattt ggttcggcta caagctgatt aaaggaactc acttcgtacg ctacagcgaa 1440

atgaagttcc cgcagaacga taagaaataa 1470

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Val Ser Glu Thr Lys Thr Thr Glu Ala Pro Gly Leu Arg Arg Glu

1 5 10 15

Leu Lys Ala Arg His Leu Thr Met Ile Ala Ile Gly Gly Ser Ile Gly

20 25 30

Thr Gly Leu Phe Val Ala Ser Gly Ala Thr Ile Ser Gln Ala Gly Pro

35 40 45

Gly Gly Ala Leu Leu Ser Tyr Met Leu Ile Gly Leu Met Val Tyr Phe

50 55 60

Leu Met Thr Ser Leu Gly Glu Leu Ala Ala Tyr Met Pro Val Ser Gly

65 70 75 80

Ser Phe Ala Thr Tyr Gly Gln Asn Tyr Val Glu Glu Gly Phe Gly Phe

85 90 95

Ala Leu Gly Trp Asn Tyr Trp Tyr Asn Trp Ala Val Thr Ile Ala Val

100 105 110

Asp Leu Val Ala Ala Gln Leu Val Met Ser Trp Trp Phe Pro Asp Thr

115 120 125

Pro Gly Trp Ile Trp Ser Ala Leu Phe Leu Gly Val Ile Phe Leu Leu

130 135 140

Asn Tyr Ile Ser Val Arg Gly Phe Gly Glu Ala Glu Tyr Trp Phe Ser

145 150 155 160

Leu Ile Lys Val Thr Thr Val Ile Val Phe Ile Ile Val Gly Val Leu

165 170 175

Met Ile Ile Gly Ile Phe Lys Gly Ala Gln Pro Ala Gly Trp Ser Asn

180 185 190

Trp Thr Ile Gly Glu Ala Pro Phe Ala Gly Gly Phe Ala Ala Met Ile

195 200 205

Gly Val Ala Met Ile Val Gly Phe Ser Phe Gln Gly Thr Glu Leu Ile

210 215 220

Gly Ile Ala Ala Gly Glu Ser Glu Asp Pro Ala Lys Asn Ile Pro Arg

225 230 235 240

Ala Val Arg Gln Val Phe Trp Arg Ile Leu Leu Phe Tyr Val Phe Ala

245 250 255

Ile Leu Ile Ile Ser Leu Ile Ile Pro Tyr Thr Asp Pro Ser Leu Leu

260 265 270

Arg Asn Asp Val Lys Asp Ile Ser Val Ser Pro Phe Thr Leu Val Phe

275 280 285

Gln His Ala Gly Leu Leu Ser Ala Ala Ala Val Met Asn Ala Val Ile

290 295 300

Leu Thr Ala Val Leu Ser Ala Gly Asn Ser Gly Met Tyr Ala Ser Thr

305 310 315 320

Arg Met Leu Tyr Thr Leu Ala Cys Asp Gly Lys Ala Pro Arg Ile Phe

325 330 335

Ala Lys Leu Ser Arg Gly Gly Val Pro Arg Asn Ala Leu Tyr Ala Thr

340 345 350

Thr Val Ile Ala Gly Leu Cys Phe Leu Thr Ser Met Phe Gly Asn Gln

355 360 365

Thr Val Tyr Leu Trp Leu Leu Asn Thr Ser Gly Met Thr Gly Phe Ile

370 375 380

Ala Trp Leu Gly Ile Ala Ile Ser His Tyr Arg Phe Arg Arg Gly Tyr

385 390 395 400

Val Leu Gln Gly His Asp Ile Asn Asp Leu Pro Tyr Arg Ser Gly Phe

405 410 415

Phe Pro Leu Gly Pro Ile Phe Ala Phe Ile Leu Cys Leu Ile Ile Thr

420 425 430

Leu Gly Gln Asn Tyr Glu Ala Phe Leu Lys Asp Thr Ile Asp Trp Gly

435 440 445

Gly Val Ala Ala Thr Tyr Ile Gly Ile Pro Leu Phe Leu Ile Ile Trp

450 455 460

Phe Gly Tyr Lys Leu Ile Lys Gly Thr His Phe Val Arg Tyr Ser Glu

465 470 475 480

Met Lys Phe Pro Gln Asn Asp Lys Lys

485

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctgtttcc tgtgtgaaat tgtta 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 30

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatc 55

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt ccacttccct tgtacgagct aatt 54

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 30

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacatca ttgccattat gggac 55

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt ccggaagccg ctctggcaag 50

<210> 14

<211> 338

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 14

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 180

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 240

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 300

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagct 338

<210> 15

<211> 2230

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 15

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg 60

ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac 120

ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg 180

cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt 240

agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat 300

gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct 360

gaagatattg ctaataagat caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct 420

ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct 480

ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc 540

tttggtccga ataccatgaa atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg 600

ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca 660

gaccgcagct acatggtgac caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac 720

tctgctccag caggcagcac cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac 780

ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt 840

attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa 900

gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt 960

ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac 1020

tccgcgtggg tgccttacac caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc 1080

ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg 1140

gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac 1200

gaagcctaca tgatgcacac caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa 1260

accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa 1320

cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc 1380

tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac 1440

agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa 1500

gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg 1560

gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg 1620

tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg 1680

cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg 1740

ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct 1800

cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt 1860

gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt 1920

atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt 1980

ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt 2040

ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa 2100

accgatattc acggtgcata ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa 2160

gaagaaagca aaaaataatt agctcgtaca agggaagtgg aagcttggca ctggccgtcg 2220

ttttacaacg 2230

<210> 16

<211> 2222

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 16

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacatca ttgccattat gggaccgcat 60

ggcgtctttt ataaagatga gcccatcaaa gaactggagt cggcgctggt ggcgcaaggc 120

tttcagatta tctggccaca aaacagcgtt gatttgctga aatttatcga gcataaccct 180

cgaatttgcg gcgtgatttt tgactgggat gagtacagtc tcgatttatg tagcgatatc 240

aatcagctta atgaatatct cccgctttat gccttcatca acacccactc gacgatggat 300

gtcagcgtgc aggatatgcg gatggcgctc tggttttttg aatatgcgct ggggcaggcg 360

gaagatatcg ccattcgtat gcgtcagtac accgacgaat atcttgataa cattacaccg 420

ccgttcacga aagccttgtt tacctacgtc aaagagcgga agtacacctt ttgtacgccg 480

gggcatatgg gcggcaccgc atatcaaaaa agcccggttg gctgtctgtt ttatgatttt 540

ttcggcggga atactcttaa ggctgatgtc tctatttcgg tcaccgagct tggttcgttg 600

ctcgaccaca ccgggccaca cctggaagcg gaagagtaca tcgcgcggac ttttggcgcg 660

gaacagagtt atatcgttac caacggaaca tcgacgtcga acaaaattgt gggtatgtac 720

gccgcgccat ccggcagtac gctgttgatc gaccgcaatt gtcataaatc gctggcgcat 780

ctgttgatga tgaacgatgt agtgccagtc tggctgaaac cgacgcgtaa tgcgttgggg 840

attcttggtg ggatcccgcg ccgtgaattt actcgcgaca gcatcgaaga gaaagtcgct 900

gctaccacgc aagcacaatg gccggttcat gcggtgatca ccaactccac ctatgatggc 960

ttgctctaca acaccgactg gatcaaacag acgctggatg tcccgtcgat tcacttcgat 1020

tctgcctggg tgccgtacac ccattttcat ccgatctacc agggtaaaag tggtatgagc 1080

ggcgagcgtg ttgcgggaaa agtgatcttc gaaacgcaat cgacccacaa aatgctggcg 1140

gcgttatcgc aggcttcgct gatccacatt aaaggcgagt atgacgaaga ggcctttaac 1200

gaagccttta tgatgcatac caccacctcg cccagttatc ccattgttgc ttcggttgag 1260

acggcggcgg cgatgctgcg tggtaatccg ggcaaacggc tgattaaccg ttcagtagaa 1320

cgagctctgc attttcgcaa agaggtccag cggctgcggg aagagtctga cggttggttt 1380

ttcgatatct ggcaaccgcc gcaggtggat gaagccgaat gctggcccgt tgcgcctggc 1440

gaacagtggc acggctttaa cgatgcggat gccgatcata tgtttctcga tccggttaaa 1500

gtcactattt tgacaccggg gatggacgag cagggcaata tgagcgagga ggggatcccg 1560

gcggcgctgg tagcaaaatt cctcgacgaa cgtgggatcg tagtagagaa aaccggccct 1620

tataacctgc tgtttctctt tagtattggc atcgataaaa ccaaagcaat gggattattg 1680

cgtgggttga cggaattcaa acgctcttac gatctcaacc tgcggatcaa aaatatgcta 1740

cccgatctct atgcagaaga tcccgatttc taccgcaata tgcgtattca ggatctggca 1800

caagggatcc ataagctgat tcgtaaacac gatcttcccg gtttgatgtt gcgggcattc 1860

gatactttgc cggagatgat catgacgcca catcaggcat ggcaacgaca aattaaaggc 1920

gaagtagaaa ccattgcgct ggaacaactg gtcggtagag tatcggcaaa tatgatcctg 1980

ccttatccac cgggcgtacc gctgttgatg cctggagaaa tgctgaccaa agagagccgc 2040

acagtactcg attttctact gatgctttgt tccgtcgggc aacattaccc cggttttgaa 2100

acggatattc acggcgcgaa acaggacgaa gacggcgttt accgcgtacg agtcctaaaa 2160

atggcgggat aacttgccag agcggcttcc ggaagcttgg cactggccgt cgttttacaa 2220

cg 2222

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctc 36

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatgg tttccgaaac taaaaccaca 60

<210> 20

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttatttctta tcgttctgcg ggaact 56

<210> 21

<211> 1539

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 21

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatgg tttccgaaac taaaaccaca 60

gaagcgccgg gcttacgccg tgaattaaag gcgcgtcacc tgacgatgat tgccattggc 120

ggttccatcg gtacaggtct ttttgttgcc tctggcgcaa cgatttctca ggcaggtccg 180

ggcggggcat tgctctcgta tatgctgatt ggcctgatgg tttacttcct gatgaccagt 240

ctcggtgaac tggctgcata tatgccggtt tccggttcgt ttgccactta cggtcagaac 300

tatgttgaag aaggctttgg cttcgcgctg ggctggaact actggtacaa ctgggcggtg 360

actatcgccg ttgacctggt tgcagctcag ctggtcatga gctggtggtt cccggataca 420

ccgggctgga tctggagtgc gttgttcctc ggcgttatct tcctgctgaa ctacatctca 480

gttcgtggct ttggtgaagc ggaatactgg ttctcactga tcaaagtcac gacagttatt 540

gtctttatca tcgttggcgt gctgatgatt atcggtatct tcaaaggcgc gcagcctgcg 600

ggctggagca actggacaat cggcgaagcg ccgtttgctg gtggttttgc ggcgatgatc 660

ggcgtagcta tgattgtcgg cttctctttc cagggaaccg agctgatcgg tattgctgca 720

ggcgagtccg aagatccggc gaaaaacatt ccacgcgcgg tacgtcaggt gttctggcga 780

atcctgttgt tctatgtgtt cgcgatcctg attatcagcc tgattattcc gtacaccgat 840

ccgagcctgc tgcgtaacga tgttaaagac atcagcgtta gtccgttcac cctggtgttc 900

cagcacgcgg gtctgctctc tgcggcggcg gtgatgaacg cagttattct gacggcggtg 960

ctgtcagcgg gtaactccgg tatgtatgcg tctactcgta tgctgtacac cctggcgtgt 1020

gacggtaaag cgccgcgcat tttcgctaaa ctgtcgcgtg gtggcgtgcc gcgtaatgcg 1080

ctgtatgcga cgacggtgat tgccggtctg tgcttcctga cctccatgtt tggcaaccag 1140

acggtatacc tgtggctgct gaacacctcc gggatgacgg gttttatcgc ctggctgggg 1200

attgccatta gccactatcg cttccgtcgc ggttacgtat tgcagggaca cgacattaac 1260

gatctgccgt accgttcagg tttcttccca ctggggccga tcttcgcatt cattctgtgt 1320

ctgattatca ctttgggcca gaactacgaa gcgttcctga aagatactat tgactggggc 1380

ggcgtagcgg caacgtatat tggtatcccg ctgttcctga ttatttggtt cggctacaag 1440

ctgattaaag gaactcactt cgtacgctac agcgaaatga agttcccgca gaacgataag 1500

aaataatcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttctt 1539

Claims

1.L-赖氨酸透性酶基因在微生物发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述L-赖氨酸透性酶基因，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述L-赖氨酸透性酶来自于微生物；优选来自大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)、乳球菌属(Lactococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

4.用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA至少包括L-赖氨酸透性酶基因，以及1,5-戊二胺生物合成途径的相关基因和/或反馈抑制脱敏的相关基因。

5.根据权利要求4所述的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA至少包括L-赖氨酸透性酶基因和赖氨酸脱羧酶基因；

优选地，所述L-赖氨酸透性酶是来自大肠杆菌的lysP基因，所述赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌的cadA基因或ldcC基因。

6.含有权利要求4或5所述重组DNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

7.一种表达载体，其特征在于，包含L-赖氨酸透性酶基因和L-赖氨酸脱羧酶基因，以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒；

优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌的细胞；

优选地，所述骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101以及它们的衍生质粒；

优选地，所述表达载体含有启动子、cadA、lysP的DNA序列或含有启动子、ldcC、lysP的DNA序列；

8.高产1,5-戊二胺的工程菌，其特征在于，其包含权利要求4或5所述的重组DNA，且所述工程菌的出发菌株为具有生产L-赖氨酸能力的菌株；

优选地，所述出发菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种；

9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌包含启动子-cadA-启动子-lysP、启动子-ldcC-启动子-lysP、启动子-lysP-启动子-cadA或启动子-lysP-启动子-ldcC的DNA序列；所述启动子选自plac、trp、tac、trc或PL。

10.权利要求8或9所述工程菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

11.1,5-戊二胺的生产方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求8或9所述工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。