CN113728105A - 生产l-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-氨基酸的生产方法 - Google Patents

生产l-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-氨基酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及L‑氨基酸生产能力得到提高的生产L‑氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L‑氨基酸的生产方法。根据本发明的生产L‑氨基酸的大肠杆菌突变株和谷氨酸棒状杆菌突变株发挥出与亲本菌株相比提高的L‑色氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑酪氨酸、L‑谷氨酰胺、L‑赖氨酸、L‑精氨酸、L‑缬氨酸、L‑亮氨酸、L‑异亮氨酸、L‑苏氨酸、L‑组氨酸、L‑丝氨酸、L‑瓜氨酸之类的L‑氨基酸的生产能力，可以以高收率生产高浓度的L‑氨基酸。

Description

生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及 利用其的L-氨基酸的生产方法
技术领域
本发明涉及L-氨基酸生产能力得到提高的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L-氨基酸的生产方法。
背景技术
L-色氨酸(L-tryptophan)作为必需氨基酸中的一种，是生物体内聚合蛋白质或者合成烟酰胺等维生素所必需的氨基酸，广泛用作氨基酸类强化剂、饲料添加剂、输液剂等医药原料及保健食品原料。L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)作为必需氨基酸中的一种，在生物体内用作作为非必需氨基酸的酪氨酸；多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素等神经递质；作为皮肤色素的黑色素等的前体，广泛用作食品、化妆品、医药原料等。除此以外，L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-瓜氨酸等各种L-氨基酸广泛用于食品、化妆品、医药品等各种领域。
这样的L-氨基酸利用在自然状态下获得的微生物菌株或者以提高该菌株的L-氨基酸生产能力的方式转变的突变株，通过发酵法进行工业生产。作为突变株，使用大肠杆菌、棒状杆菌等微生物的营养缺陷型菌株(auxotroph)或调节位点突变株，20世纪80年代以来，随着基因重组技术急速发展，代谢过程和其调控机制得到详细地查明，许多研究人员利用基因操作技术开发出优异的重组菌株并取得了丰硕的成果。
在使用基因重组技术时，可以通过增加参与氨基酸生物合成的酶的活性，或者抑制所生产的L-氨基酸的反馈来提高氨基酸生产能力。此外，还可以通过调控氨基酸排出基因的表达来改善氨基酸生产能力。在美国授权专利第5972663号中，记载了人为地使大肠杆菌等各种菌株的基因mex、bmr、qacA等过度表达，从而提高L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸、噻唑烷衍生物的生产能力，在欧洲授权专利第1016710号中，记载了人为地使大肠杆菌属菌株的基因yahN、yeaS、yfiK、yggA过度表达，从而提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸的生产能力，在韩国授权专利第10-1023925号中，记载了人为地使大肠杆菌属菌株的基因yddG过度表达，从而提高L-色氨酸、L-苯丙氨酸的生产能力。
基于这样的现有研究，本发明的发明人们通过调整大肠杆菌属菌株和棒状杆菌属菌株内L-氨基酸排出基因的表达，制造了多种L-氨基酸生产能力得到提高的生产L-氨基酸的突变株，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)美国授权专利第5972663号
(专利文献2)欧洲授权专利第1016710号
(专利文献3)韩国授权专利第10-1023925号
发明内容
为了解决上述问题，
本发明的目的在于，提供过度表达选自yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC和emrD中的一种以上的基因而L-氨基酸生产能力得到提高的大肠杆菌(Escherichia coli)突变株。
另外，本发明的目的在于，提供过度表达选自yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC和emrD中的一种以上的基因而L-氨基酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株。
另外，本发明的目的在于，提供包括在培养基中培养上述突变株的步骤；以及从上述突变株或者培养基中回收L-氨基酸的步骤的L-氨基酸的生产方法。
作为根据本发明的一具体例的生产L-氨基酸的突变株，可以是过度表达选自yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC和emrD中的一种以上的基因而L-氨基酸生产能力得到提高的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株。
作为现有技术，曾经通过以过度表达大肠杆菌属突变株的氨基酸排出基因yddG的方式进行调整，从而提高作为芳香族氨基酸的L-色氨酸和L-苯丙氨酸的生产。但是，本发明的发明人们尝试确认了上述基因yddG对L-氨基酸的生产能力产生的影响，结果确认了L-色氨酸和L-苯丙氨酸仍然在去除了基因yddG的菌株中进行表达(参考实验例1)。由此，本发明的发明人们认识到除了基因yddG以外，还有其它基因参与氨基酸生产，因此筛选出新型氨基酸排出基因，制造了优异的L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-瓜氨酸等L-氨基酸的生产能力得到提高的生产L-氨基酸的突变株。
根据本发明的一具体例，作为与氨基酸排出有关的基因，可以是由SEQ ID NO:1至7的碱基序列表示的基因中的一个基因。具体而言，可以是由SEQ ID NO:1的碱基序列表示的基因yicL、由SEQ ID NO:2的碱基序列表示的基因ydiN、由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:37的碱基序列表示的基因ydhK、由SEQ ID NO:4的碱基序列表示的基因aaeB、由SEQ ID NO:5的碱基序列表示的基因yeeA、由SEQ ID NO:6的碱基序列表示的基因rhtC、由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:39的碱基序列表示的基因emrD。
另外，作为上述与氨基酸排出有关的基因，可以是编码由SEQ ID NO:8至14的氨基酸序列表示的蛋白质的基因中的一个基因。具体而言，可以是由SEQ ID NO:8的氨基酸序列表示的yicL蛋白质、由SEQ ID NO:9的氨基酸序列表示的ydiN蛋白质、由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:38的氨基酸序列表示的ydhK蛋白质、由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的aaeB蛋白质、由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的yeeA蛋白质、由SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示的rhtC蛋白质、由SEQ ID NO:14的氨基酸序列表示的emrD蛋白质。
根据本发明的一具体例，突变株可以选择大肠杆菌属菌株(Escheric hia sp.)或棒状杆菌属菌株(Corynebacterium sp.)作为亲本菌株(parent strain)。
大肠杆菌属菌株广泛用于L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸等各种L-氨基酸的生产，特别是，已知其L-色氨酸生产率高。作为上述亲本菌株，优选为容易获得且便利性良好的大肠杆菌(Escherichia coli)。
棒状杆菌属菌株具有L-谷氨酸、L-赖氨酸等L-氨基酸的生产率高而副产物生成少的优点，即使在缺氧或糖耗尽等极限环境下，也可以稳定地生产氨基酸。作为上述亲本菌株，优选为主要用于生产氨基酸的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
这样的亲本菌株可以是在自然状态下获得的野生型(wild type)菌株、或者野生型菌株的基因事先经人为操作的菌株。
在本发明中，“生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株”和“生产L-氨基酸的谷氨酸棒状杆菌突变株”是指对其进行突变使得可以生产与亲本菌株相比更高浓度的L-氨基酸的微生物。这时，微生物的突变诱导可以通过该领域中公知的各种方法而实施，可以使用物理或化学突变诱导方法中的一种方法。例如，作为诱导化学突变的诱因，可以使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine；NTG)、二环氧丁烷(diepoxybutane)、甲磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate)、芥子(mustard)化合物、肼(hydrazine)和亚硝酸(nitrous acid)，但并不限定于这样的化合物。此外，诱导物理性突变的因素可以使用紫外线和伽马射线，但并不限定于此。在诱导突变时，亲本菌株在留存特定大小的存活种群的程度的浓度下受到突变诱导因子的影响。上述大小可以根据突变诱导因子的种类而不同，取决于突变因子以一定的杀伤率
Figure BDA0003133958680000041
在存活种群内诱导的突变的量。例如，在使用NTG的情况下，杀伤率为初始种群的10％至50％，利用亚硝酸发生的突变可以为初始种群的0.01％至0.1％。
根据本发明的一具体例，上述L-氨基酸可以选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸和L-瓜氨酸，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株和谷氨酸棒状杆菌突变株通过上述氨基酸排出基因而转化(transformation)，或者上述氨基酸排出基因的拷贝(copy)数在上述菌株的染色体上的强启动子(promoter)控制下扩增，从而可以过度表达(overexpression)上述基因。根据本发明的一具体例，通过将上述与氨基酸排出有关的7个基因中的一种以上的基因插入包含启动子的细菌的质粒而引入到亲本菌株中，从而与亲本菌株相比，上述氨基酸排出基因过度表达，从而可以得到L-氨基酸的生产能力得到提高的突变菌株。
利用这样的突变株，可以以高收率生产高浓度的L-氨基酸。具体而言，L-氨基酸的生产方法可以包括在培养基中培养上述突变株的步骤；以及从上述突变株或者培养基中回收L-氨基酸的步骤。
在本发明中，“培养基”是指用于本发明的大肠杆菌突变株和谷氨酸棒状杆菌突变株的培养的、以上述突变株可以生产高收率的L-氨基酸的方式包含碳源、氮源和无机盐类的培养基，上述L-氨基酸例如包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸或L-瓜氨酸。
作为上述培养基中的碳源，例如，可以包括葡萄糖、砂糖、柠檬酸盐、果糖、乳糖、麦芽糖或糖蜜之类的糖和碳水化合物；大豆油、向日葵油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸，但并不限定于此，这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用。优选地，上述大肠杆菌突变株的培养基可以是包含葡萄糖的培养基。此外，优选地，上述谷氨酸棒状杆菌突变株的培养基可以包含葡萄糖、糖蜜、或者葡萄糖和糖蜜，最优选地，相对于葡萄糖100重量份，上述培养基可以包含5至60重量份的糖蜜作为碳源。
作为上述培养基中的氮源，例如，可以使用蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、干酵母、玉米浆、豆饼、尿素、硫脲、铵盐、硝酸盐和其它包含有机或无机氮的化合物，但并不限定于此。此外，上述培养基中的无机盐类可以使用包含镁、锰、钾、钙、铁、锌、钴等的化合物，但并不限定于此。
另一方面，作为可以用于上述培养基的磷源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐。上述化合物可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。
另外，除了上述碳源、氮源和无机盐类成分以外，可以在本发明的培养基中进一步添加氨基酸、维生素、核酸和与其相关的化合物。上述原料可以在培养过程中通过适当的方式分批或连续地添加到培养基中。
另一方面，可以以适当的方式使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨之类的基础化合物或者磷酸或硫酸之类的化合物来调节培养基的pH。此外，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。为了维持有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。
在本发明中，“培养”是指在适当地人工调控的环境下培育微生物。本发明的培养微生物的方法可以利用该领域中公知的大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的培养方法来实施。具体而言，在上述培养方法的例子中，包括分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)和补料分批式培养(fed-batchculture)，但并不限定于此。
在培养时，温度通常可以为20℃至45℃，但并不限定于此。培养持续到L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-瓜氨酸之类的L-氨基酸的期望的产生量得到最大化为止。这样的培养通常可以进行10至160小时，但并不限定于此。所产生的L-氨基酸可以排放到培养基中，或者包含在上述突变株内。
从上述突变株或者培养突变株的培养基中回收L-氨基酸的步骤可以使用该领域中公知的各种方法，例如，离心分离、过滤、阴离子交换色谱、结晶化和HPLC等，但并不限定于此。
根据本发明的生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株或者谷氨酸棒状杆菌突变株可以发挥出与亲本菌株相比得到提高的L-氨基酸的生产能力，可以高收率生产高浓度的L-氨基酸。
具体实施方式
下面，参照所附上的附图，对根据本发明的生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株或者谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L-氨基酸的生产方法更详细地进行说明。但是，这样的说明只为了帮助理解本发明而例示性地提出，本发明的范围并不限定于这样的例示性的说明。
实验例1-1.缺失基因yddG的突变株的制造
为了确认在L-氨基酸生产中基因yddG产生的影响，制造了缺失菌株的基因yddG的突变株。
作为亲本菌株，使用了生产L-色氨酸的大肠杆菌W0G菌株(保藏号：KFCC11660P)、生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌MWTR42菌株(保藏号：KFCC10780)，实验方法参考了文献[One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts,Datsenko KA,Wanner BL.,Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun 6；97(12):6640-5]，从而制造了缺失基因yddG的突变株。
首先，为了制造用于基因yddG破碎的DNA片段，以各亲本菌株的染色体和pKD13质粒为模板，使用下述表1的引物，实施了聚合酶链反应法(PCR)。这时，PCR条件按照(i)变性(denaturation)步骤：在95℃30秒，(ii)退火(annealing)步骤：在58℃30秒，以及(iii)延伸(extension)步骤：在72℃2分钟实施共30次。将上述PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳后，得到了期望的大小的条带，利用该条带的片段，再次通过与上述PCR条件相同的条件实施重叠PCR(overlap PCR)，从而制造了用于基因yddG破碎的一个DNA片段。将上述DNA片段转化到各亲本菌株中，涂抹在含有卡那霉素的固体培养基中，在37℃培养24小时。对在这里得到的菌落(colony)再次通过与上述PCR条件相同的条件实施PCR。
[表1]
引物(primer) 碱基序列(5'>3')
yddG H1F(SEQ ID NO:15) CAATGCCGCTACTGTTGTTCCAGCC
yddG H1R(SEQ ID NO:16) CAGTGGTGCGTTTTTCTACCGCTAT
yddG H2F(SEQ ID NO:17) AATAACTGCCGGGTCTACGGCC
yddG H2R(SEQ ID NO:18) AACGTATTTTCTAAACGAATTTTAAACGGCGTC
yddG CF(SEQ ID NO:19) CGGAACAGTATGTGCAGGTGTTACGG
yddG CR(SEQ ID NO:20) AACAAACCAGTTACAACCACCGCAAC
结果确认了各菌落中的基因yddG缺失。
并且，将大肠杆菌W0G菌株中缺失基因yddG的突变株命名为W1G菌株，将大肠杆菌MWTR42菌株中缺失基因yddG的突变株命名为MWTR5菌株。
实验例1-2.缺失基因yddG的突变株的L-色氨酸、L-苯丙氨酸生产能力的确认
确认了W0G和W1G菌株的L-色氨酸生产能力、MWTR42和MWT R5菌株的L-苯丙氨酸生产能力。
在装有如下述表2所示的组成的各个培养基10mL的烧瓶中接种各菌株各1％，在37℃以200rpm震荡培养70小时。将各培养液在OD610nm下测定吸光度，比较L-色氨酸或L-苯丙氨酸的生产量，其结果如下述表3所示。
[表2]
Figure BDA0003133958680000081
[表3]
菌株 L-色氨酸(g/L) 菌株 L-苯丙氨酸(g/L)
W0G 4.21±0.113 MWTR42 21.3±0.115
W1G 2.53±0.132 MWTR5 11.7±0.141
如上述表3所示，确认了缺失基因yddG的突变株(W1G菌株、MWTR5菌株)依然分别生产L-色氨酸、L-苯丙氨酸。即，即使去除了已知为芳香族氨基酸的排出基因的yddG，也维持了各突变株的L-氨基酸生产能力，因此可知除了yddG以外，还存在参与基酸的排出的基因。
实验例2-1.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的制造
制造了分别插入有基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD的大肠杆菌突变株。
作为亲本菌株，使用了生产L-色氨酸的大肠杆菌W0G菌株(保藏号：KFCC11660P)。
首先，以W0G菌株为模板，使用下述表4的引物，将各基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD通过PCR而扩增后，用限制酶SacI、XbaI处理，从而进行了准备。
碱基序列分析结果，确认了yicL基因的碱基序列为SEQ ID NO:1的碱基序列，ydiN基因的碱基序列为SEQ ID NO:2的碱基序列，ydhK基因的碱基序列为SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:37的碱基序列，aaeB基因的碱基序列为SEQ ID NO:4的碱基序列，yeeA基因的碱基序列为SEQ ID NO:5的碱基序列，rhtC基因的碱基序列为SEQ ID NO:6的碱基序列，emrD基因的碱基序列为SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:39的碱基序列。
对载体pTrc99A用限制酶SacI、XbaI处理并切割，向其中插入所准备的各基因，从而制造了表达载体pTrc99A::yicL、pTrc99A::ydiN、pTrc99A::ydhK、pTrc99A::aaeB、pTrc99A::yeeA、pTrc99A::rhtC、pTrc99A::emrD。将各表达载体转化到W0G菌株中，从而制造了各基因扩增的突变株W0G/pTrc99A::yicL、W0G/pTrc99A::ydiN、W0G/pTrc99A::ydhK、W0G/pTrc99A::aaeB、W0G/pTrc99A::yeeA、W0G/pTrc99A::rhtC、W0G/pTrc99A::emrD。
[表4]
引物(primer) 碱基序列(5'>3')
yicL_F(SEQ ID NO:21) GCGAGCTCATGGGTTCCACCAGAAAGGG
yicL_R(SEQ ID NO:22) GCTCTAGATCACTTATGCCGCGCCGGA
ydiN_F(SEQ ID NO:23) GCGAGCTCATGTCTCAAAATAAGGCTTTCAGCA
ydiN_R(SEQ ID NO:24) GCTCTAGAGGCCATCAACCCAATCAATT
ydhK_F(SEQ ID NO:25) GCGAGCTCATGAACGCATCGTCATGGTCCTTGC
ydhK_R(SEQ ID NO:26) GCTCTAGATCACTTATGCCGCGCCGGA
aaeB_F(SEQ ID NO:27) GCGAGCTCATGGGTATTTTCTCCATTGCT
aaeB_R(SEQ ID NO:28) GCTCTAGATTTTGACTTAACTATCGGTca
yeeA_F(SEQ ID NO:29) GCGAGCTCGTGCGTGCCGATAAGTC
yeeA_R(SEQ ID NO:30) GCTCTAGATTATTTGCGCAAGGCCCG
rhtC_F(SEQ ID NO:31) GCGAGCTCATGTTGATGTTATTTCTCACCGT
rhtC_R(SEQ ID NO:32) gctctagaCTGGCATCACCGCGAAATAA
emrD_F(SEQ ID NO:33) GCGAGCTCATGAAAAGGCAAAGAAACG
emrD_R(SEQ ID NO:34) GCTCTAGACGGTGACGTGCGCTTAAAC
实验例2-2.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的L-色氨 酸生产能力确认
确认了W0G中只插入有载体pTrc99A的W0G/pTrc99A和突变株W0G/pTrc99A::yicL、W0G/pTrc99A::ydiN、W0G/pTrc99A::ydhK、W0G/pTrc99A::aaeB、W0G/pTrc99A::yeeA、W0G/pTrc99A::rhtC、W0G/pTrc99A::emrD的L-色氨酸生产能力。
在装有如上述表2所示的组成的各个培养基10mL的烧瓶中接种各菌株各1％，在34℃以200rpm震荡培养72小时。将各培养液在OD610nm下测定吸光度，比较L-色氨酸的生产量，其结果如下述表5所示。
[表5]
菌株 L-色氨酸(g/L)
W0G/pTrc99A(对照组) 4.21±0.113
W0G/pTrc99A::yicL 4.83±0.102
W0G/pTrc99A::ydiN 4.86±0.169
W0G/pTrc99A::ydhK 4.88±0.133
W0G/pTrc99A::aaeB 4.91±0.101
W0G/pTrc99A::yeeA 4.95±0.123
W0G/pTrc99A::rhtC 5.02±0.131
W0G/pTrc99A::emrD 5.26±0.156
如上述表5所示，确认了各基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的大肠杆菌突变株与对照组相比，L-色氨酸生产能力增加。
实验例3-1.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的制造
制造了分别插入有基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD的大肠杆菌突变株。
使用生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌MWTR42菌株(保藏号：KFCC10780)代替W0G菌株，除此以外，通过与上述实验例2-1相同的方法制造了表达载体。将各表达载体转化到MWTR42菌株中，从而制造了各基因扩增的突变株MWTR42/pTrc99A::yicL、MWTR42/pTrc99A::ydiN、MWT R42/pTrc99A::ydhK、MWTR42/pTrc99A::aaeB、MWTR42/pTrc99A::yeeA、MWTR42/pTrc99A::rhtC、MWTR42/pTrc99A::emrD。
实验例3-2.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的L-苯丙 氨酸生产能力确认
确认了MWTR42中只插入有载体pTrc99A的MWTR42/pTrc99A和突变株MWTR42/pTrc99A::yicL、MWTR42/pTrc99A::ydiN、MWTR42/pTrc99A::ydhK、MWTR42/pTrc99A::aaeB、MWTR42/pTrc99A::yeeA、MWTR42/pTrc99A::rhtC、MWTR42/pTrc99A::emrD的L-苯丙氨酸生产能力。
通过与上述实验例2-2相同的方法，比较了L-苯丙氨酸的生产量，其结果如下述表6所示。
[表6]
菌株 L-苯丙氨酸(g/L)
MWTR42/pTrc99A(对照组) 21.3±0.115
MWTR42/pTrc99A::yicL 27.1±0.081
MWTR42/pTrc99A::ydiN 27.2±0.165
MWTR42/pTrc99A::ydhK 27.3±0.105
MWTR42/pTrc99A::aaeB 27.0±0.111
MWTR42/pTrc99A::yeeA 27.3±0.103
MWTR42/pTrc99A::rhtC 26.7±0.122
MWTR42/pTrc99A::emrD 27.1±0.085
如上述表6所示，确认了各基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的大肠杆菌突变株与对照组相比，L-苯丙氨酸生产能力增加。
实验例4-1.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的制造
制造了分别插入有基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD的谷氨酸棒状杆菌突变株。
作为亲本菌株，利用了生产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌DW28G(保藏号：KTCT13769BP)。
首先，以上述实验例2-1中制造的表达载体pTrc99A::yicL、pTrc99A::ydiN、pTrc99A::ydhK、pTrc99A::aaeB、pTrc99A::yeeA、pTrc99A::rhtC、pTrc99A::emrD为模板，使用下述表7的引物，将各基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD通过PCR扩增后，进行磷酸化(5'-phosphorylation)处理，从而进行了准备。对载体pEKO用限制酶Eco53KI处理并切割，向其中插入所准备的各基因，从而制造了表达载体pEKO::yicL、pEKO::ydiN、pEKO::ydhK、pEKO::aaeB、pEKO::yeeA、pEKO::rhtC、pEKO::emrD。将各表达载体转化到DW28G菌株中，从而制造了各基因扩增的突变株DW28G/pEKO::yicL、DW28G/pEKO::ydiN、DW28G/pEKO::ydhK、DW28G/pEKO::aaeB、DW28G/pEKO::yeeA、DW28G/pEKO::rhtC、DW28G/pEKO::emrD。
[表7]
引物(primer) 碱基序列(5'>3')
primer_F(SEQ ID NO:35) gcgccgacatcataacggttctgg
primer_R(SEQ ID NO:36) cgcaacgttcaaatccgctcccg
实验例4-2.基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的突变株的L-色氨 酸生产能力确认
确认了DW28G中只插入有载体pEKO的DW28G/pEKO和突变株DW28G/pEKO::yicL、DW28G/pEKO::ydiN、DW28G/pEKO::ydhK、DW28G/pEKO::aaeB、DW28G/pEKO::yeeA、DW28G/pEKO::rhtC、DW28G/pEKO::emrD的L-色氨酸生产能力。
使用下述表8的组成作为培养基，除此以外，通过与上述实验例2-2相同的方法比较了L-色氨酸的生产量。其结果如下述表9所示。
[表8]
组成 含量
甘蔗糖蜜(葡萄糖)(Cane molasses(glucose)) 100.00g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 5.00g/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 5.00g/L
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 0.40g/L
MgSO<sub>4</sub> 0.25g/L
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 20g/L
玉米浆(Corn steep liquor) 10g/L
CaCO<sub>3</sub> 3％
[表9]
菌株 L-色氨酸(g/L)
DW28G/pEKO(对照组) 2.64±0.107
DW28G/pEKO::yicL 3.57±0.115
DW28G/pEKO::ydiN 3.05±0.089
DW28G/pEKO::ydhK 3.11±0.095
DW28G/pEKO::aaeB 2.95±0.102
DW28G/pEKO::yeeA 3.21±0.113
DW28G/pEKO::rhtC 3.31±0.091
DW28G/pEKO::emrD 3.45±0.115
如上述表9所示，确认了各基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD扩增的谷氨酸棒状杆菌突变株与对照组相比，L-色氨酸生产能力增加。
结果，本发明通过诱导氨基酸排出基因yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC、emrD的过度表达，从而得到了与亲本菌株相比L-色氨酸或L-苯丙氨酸的生产能力得到提高的大肠杆菌突变株和谷氨酸棒状杆菌突变株，确认了利用这样的突变株，可以以高收率得到高浓度的L-色氨酸或L-苯丙氨酸。
到目前为止，对本发明围绕其优选实施例进行了研究。本发明所属技术领域的技术人员可以理解本发明在不脱离本发明的本质性的特性的范围内可以以变形的形态实现。因此，公开的实施例应从说明性的角度进行考虑而不是从限制性的角度进行考虑。本发明的范围显示在权利要求书中而不是上述的说明中，并且应被解释为在与其等同范围内的所有的差异包括在本发明中。
<110> 大象株式会社
<120> 生产L-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L-氨基酸的生产方法
<130> PX190055PCT
<150> KR 10-2018-0169847
<151> 2018-12-26
<160> 39
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yicL
<400> 1
atgggttcca ccagaaaggg gatgctgaac gttctgattg ccgccgtgtt gtggggaagt 60
tcaggggtct gcgcgcaata catcatggag caaagccaga tgtcgtcgca gtttttgact 120
atgacgcgtt tgatattcgc cggtttgatt ctactgacgc tgtcatttgt tcatggcgat 180
aaaatctttt ctattattaa caatcataaa gatgccatta gcctgctgat tttttccgtg 240
gttggcgcgc taactgtaca gctcactttt ttgctaacca tcgaaaaatc gaacgcagcc 300
acggcaacgg tgctgcaatt cctctcaccg acgattatcg tcgcctggtt ctcactggtg 360
cgtaaatcgc gcccgggcat tctggttttc tgcgctattt tgacatcgct ggtcgggact 420
tttttattgg tgacacacgg taatccgacg tcattatcga tctctcctgc cgcgttgttc 480
tggggcattg cctcggcatt tgctgctgca ttctatacca cctatccctc aacgctaatt 540
gcccgctatg gcacgttacc agtcgtcggc tggagtatgc tgattggcgg tctgattctg 600
ttgccttttt atgccagaca aggaacaaac tttgtcgtta acggcagttt gattctggcg 660
tttttttatt tggtggtcat tggtacgtcc ctgacattta gtctgtacct gaaaggagca 720
caattaattg gcggtccaaa agccagcatt ttgagctgtg cagaaccatt aagtagcgcg 780
ctactctctt tgctgttgct ggggatcacg ttcacattac cggactggct gggaacgctg 840
ctgattctgt catcggtgat tttgatttca atggattccc gtcgccgcgc cagaaaaata 900
aatcgtccgg cgcggcataa gtga 924
<210> 2
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydiN
<400> 2
atgtctcaaa ataaggcttt cagcacgcca tttatcctgg ctgttctttg tatttacttc 60
agctacttcc tgcacggcat tagtgttatt acgcttgccc aaaatatgtc atctctggcg 120
gaaaagtttt ccactgacaa cgcgggcatt gcctacttaa tttccggtat cggtttgggg 180
cgattgatca gtattttatt cttcggtgtg atctccgata agtttggtcg tcgggcggtg 240
atattaatgg cagtaataat gtatctgcta ttcttctttg gtattcccgc ttgcccgaat 300
ttaactctcg cctacggtct ggcagtgtgc gtaggtatcg ctaactcagc gctggatacg 360
ggtggctacc ccgcgctcat ggaatgcttt ccgaaagcct ctggttcggc ggtcatactg 420
gttaaagcga tggtgtcatt tgggcaaatg ttctacccaa tgctggtgag ctatatgttg 480
ctcaataata tctggtacgg ctatgggctg attattccgg gtattctatt tgtactgatc 540
acgctgatgc tgttgaaaag caaattcccc agccagttgg tggacgccag cgtaactaat 600
gaattaccgc aaatgaacag caaaccgtta gtctggctgg aaggtgtttc atcggtactg 660
ttcggtgtag ccgcattctc gaccttttat gtgattgtgg tgtggatgcc caaatatgcg 720
atggcttttg ctggtatgtc agaagctgag gcattaaaaa ccatctctta ttacagtatg 780
ggctcgttgg tctgtgtctt tatttttgcc gcactactga aaaaaatggt ccggcccatc 840
tgggctaatg tatttaactc tgcactggca acaataacag cagccattat ctacctgtac 900
ccttctccac tggtgtgcaa tgccggagcc tttgttatcg gtttctcagc agctggcggc 960
attttacagc tcggcgtttc ggtcatgtca gagttttttc ccaaaagcaa agccaaagtc 1020
accagtattt atatgatgat gggtggactg gctaactttg ttattccact gattaccggt 1080
tatctgtcga acatcggcct gcaatatatc attgttctcg attttacttt cgcgctgctg 1140
gccctgatta ccgcaattat tgtttttatc cgctattacc gcgttttcat tattcctgaa 1200
aatgatgtgc ggtttggcga gcgtaaattt tgcacccggt taaacacaat taagcataga 1260
ggttaa 1266
<210> 3
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydhK
<400> 3
atgaacgcat cgtcatggtc cttgcgcaat ttgccctggt tcagggccac gctggcgcaa 60
tggcgttatg cgttacgcaa taccattgcc atgtgtctgg cgctgacggt tgcctattat 120
ttaaatctgg atgaacccta ttgggcgatg acctcggctg cagtggttag ctttcccacc 180
gttggcggtg ttatcagcaa aagcctcgga cgcatcgctg gcagtttgct cggagccatt 240
gcggcactgc ttcttgccgg gcatacgctc aatgagccgt ggttttttct attgagcatg 300
tcggcgtggc ttggcttttg tacctgggcc tgtgcgcact tcacgaataa cgtcgcgtat 360
gcatttcaac tggcgggcta cacggctgcc atcatcgcct ttccgatggt taatattact 420
gaggccagcc agctgtggga tatcgctcag gcgcgcgttt gcgaggtaat agtcggtatt 480
ttgtgcggcg gcatgatgat gatgatcctg ccgagcagtt ccgatgctac tgccctttta 540
accgcattga aaaacatgca cgcccgatta ctggaacatg ccagtttact ctggcagcct 600
gaaacaaccg atgccattcg tgcagcacat gaaggggtga ttgggcagat actgaccatg 660
aatttgctgc gtatccaggc tttctggagc cactatcgtt ttcgccagca aaacgcgcgc 720
cttaatgcgc tgctccacca gcaattacgt atgaccagtg tcatctccag cctgcgacgt 780
atgttgctca actggccctc accgccaggt gccacacgag aaattctcga acagttgctg 840
acggcgctcg ccagttcgca aacagatgtt tacaccgtcg cacgtattat cgccccgcta 900
cgcccgacca acgtcgccga ctatcggcac gtcgccttct ggcagcgact acgttatttt 960
tgccgccttt atctgcaaag tagtcaggaa ttacatcgtc tgcaaagcgg tgtagatgat 1020
cataccagac tcccacggac atccggcctg gctcgtcata ccgataacgc cgaagctatg 1080
tggagcgggc tgcgtacatt ttgtacgttg atgatgattg gcgcatggag tattgcttcg 1140
caatgggatg ccggtgccaa tgcattaacg ctggcagcaa ttagctgcgt actctactcc 1200
gccgtcgcag caccgtttaa gtcgttgtca cttctgatgc gcacgctggt gttactttcg 1260
ctattcagct ttgtggtcaa atttggtctg atggtccaga ttagcgatct gtggcaattt 1320
ttactgtttc tctttccact gctggcgaca atgcagcttc ttaaattgca gatgccaaaa 1380
tttgccgcat tgtgggggca actgattgtt tttatgggtt cttttatcgc tgtcactaat 1440
cccccggtgt atgattttgc tgattttctt aacgataatc tggcaaaaat cgttggcgtc 1500
gcgttggcgt ggttagcgtt cgccattctg cgtccaggat cggatgctcg taaaagccgc 1560
cgccatattc gcgcgctgcg ccgggatttt gtcgatcagc taagccgcca tccaacactg 1620
agtgaaagcg aatttgaatc gctcacttat catcacgtca gtcagttgag taacagccag 1680
gatgcgctgg ctcgccgttg gttattacgc tggggtgtag tgctgctgaa ctgttctcat 1740
gttgtctggc aattgcgcga ctgggaatcg cgttccgatc cgttatcgcg agtacgggat 1800
aactgtattt cactgttgcg gggagtgatg agtgagcgtg gcgttcagca aaaatcactg 1860
gcggccacac ttgaagaatt acagcggatt tgcgacagcc ttgcccgtca tcatcaacct 1920
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<211> 1968
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aaeB
<400> 4
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gccgccagcg cgatgcaggg gatgggcacc ggcgttggcg gcgtaatggc gcgtacttta 360
ccgcgagatt tatatgaacg gacacagttg cgccatgcta acagcctgtt aaacatgggg 420
attctcgtca gtccgttgct cgcaccgcta atcggcggtc tgctggatac gatgtggaac 480
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gccgggattg ccgcctttga agcctgctcc ggcgtgctga tgggcgcggt gttagggctg 720
agcagtatga cggtcagtat tttgtttatt ctgccgattc cggcagcgtt ttttggcgca 780
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Gln Met Ser Ser Gln Phe Leu Thr Met Thr Arg Leu Ile Phe Ala Gly
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Leu Ile Leu Leu Thr Leu Ser Phe Val His Gly Asp Lys Ile Phe Ser
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Ile Ile Asn Asn His Lys Asp Ala Ile Ser Leu Leu Ile Phe Ser Val
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Val Gly Ala Leu Thr Val Gln Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ile Glu Lys
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Ser Asn Ala Ala Thr Ala Thr Val Leu Gln Phe Leu Ser Pro Thr Ile
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Ile Val Ala Trp Phe Ser Leu Val Arg Lys Ser Arg Pro Gly Ile Leu
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Val Phe Cys Ala Ile Leu Thr Ser Leu Val Gly Thr Phe Leu Leu Val
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Trp Gly Ile Ala Ser Ala Phe Ala Ala Ala Phe Tyr Thr Thr Tyr Pro
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Met Leu Ile Gly Gly Leu Ile Leu Leu Pro Phe Tyr Ala Arg Gln Gly
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Gln Leu Ile Gly Gly Pro Lys Ala Ser Ile Leu Ser Cys Ala Glu Pro
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Met Ala Phe Ala Gly Met Ser Glu Ala Glu Ala Leu Lys Thr Ile Ser
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Tyr Tyr Ser Met Gly Ser Leu Val Cys Val Phe Ile Phe Ala Ala Leu
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Leu Trp Asp Ile Ala Gln Ala Arg Val Cys Glu Val Ile Val Gly Ile
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Leu Cys Gly Gly Met Met Met Met Ile Leu Pro Ser Ser Ser Asp Ala
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Leu Asn Ala Leu Leu His Gln Gln Leu Arg Met Thr Ser Val Ile Ser
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Cys Arg Leu Tyr Leu Gln Ser Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Ser
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Gly Val Asp Asp His Thr Arg Leu Pro Arg Thr Ser Gly Leu Ala Arg
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Gly Ala Asn Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ile Ser Cys Val Leu Tyr Ser
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Ala Val Ala Ala Pro Phe Lys Ser Leu Ser Leu Leu Met Arg Thr Leu
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Gln Ile Ser Asp Leu Trp Gln Phe Leu Leu Phe Leu Phe Pro Leu Leu
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Ala Thr Met Gln Leu Leu Lys Leu Gln Met Pro Lys Phe Ala Ala Leu
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Gly Ser Asp Ala Arg Lys Ser Arg Arg His Ile Arg Ala Leu Arg Arg
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Arg Ile Pro Lys Ser Ile Tyr Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asn Arg Asn
225 230 235 240
Leu Val Cys Met Leu Glu Leu Gln Ile Asn Ala Tyr Trp Ala Thr Arg
245 250 255
Pro Ser His Phe Val Leu Leu Asn Ala Gln Lys Leu Arg Asp Thr Gln
260 265 270
His Met Met Gln Gln Ile Leu Leu Ser Leu Val His Ala Leu Tyr Glu
275 280 285
Gly Asn Pro Gln Pro Val Phe Ala Asn Thr Glu Lys Leu Asn Asp Ala
290 295 300
Val Glu Glu Leu Arg Gln Leu Leu Asn Asn His His Asp Leu Lys Val
305 310 315 320
Val Glu Thr Pro Ile Tyr Gly Tyr Val Trp Leu Asn Met Glu Thr Ala
325 330 335
His Gln Leu Glu Leu Leu Ser Asn Leu Ile Cys Arg Ala Leu Arg Lys
340 345 350
<210> 13
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC
<400> 13
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 14
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> emrD
<400> 14
Met Lys Arg Gln Arg Asn Val Asn Leu Leu Leu Met Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ala Val Gly Gln Met Ala Gln Thr Ile Tyr Ile Pro Ala Ile Ala
20 25 30
Asp Met Ala Arg Asp Leu Asn Val Arg Glu Gly Ala Val Gln Ser Val
35 40 45
Met Gly Ala Tyr Leu Leu Thr Tyr Gly Val Ser Gln Leu Phe Tyr Gly
50 55 60
Pro Ile Ser Asp Arg Val Gly Arg Arg Pro Val Ile Leu Val Gly Met
65 70 75 80
Ser Ile Phe Met Leu Ala Thr Leu Val Ala Val Thr Thr Ser Ser Leu
85 90 95
Thr Val Leu Ile Ala Ala Ser Ala Met Gln Gly Met Gly Thr Gly Val
100 105 110
Gly Gly Val Met Ala Arg Thr Leu Pro Arg Asp Leu Tyr Glu Arg Thr
115 120 125
Gln Leu Arg His Ala Asn Ser Leu Leu Asn Met Gly Ile Leu Val Ser
130 135 140
Pro Leu Leu Ala Pro Leu Ile Gly Gly Leu Leu Asp Thr Met Trp Asn
145 150 155 160
Trp Arg Ala Cys Tyr Leu Phe Leu Leu Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
165 170 175
Phe Ser Met Ala Arg Trp Met Pro Glu Thr Arg Pro Val Asp Ala Pro
180 185 190
Arg Thr Arg Leu Leu Thr Ser Tyr Lys Thr Leu Phe Gly Asn Ser Gly
195 200 205
Phe Asn Cys Tyr Leu Leu Met Leu Ile Gly Gly Leu Ala Gly Ile Ala
210 215 220
Ala Phe Glu Ala Cys Ser Gly Val Leu Met Gly Ala Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Ser Ser Met Thr Val Ser Ile Leu Phe Ile Leu Pro Ile Pro Ala Ala
245 250 255
Phe Phe Gly Ala Trp Phe Ala Gly Arg Pro Asn Lys Arg Phe Ser Thr
260 265 270
Leu Met Trp Gln Ser Val Ile Cys Cys Leu Leu Ala Gly Leu Leu Met
275 280 285
Trp Ile Pro Asp Trp Phe Gly Val Met Asn Val Trp Thr Leu Leu Val
290 295 300
Pro Ala Ala Leu Phe Phe Phe Gly Ala Gly Met Leu Phe Pro Leu Ala
305 310 315 320
Thr Ser Gly Ala Met Glu Pro Phe Pro Phe Leu Ala Gly Thr Ala Gly
325 330 335
Ala Leu Val Gly Gly Leu Gln Asn Ile Gly Ser Gly Val Leu Ala Ser
340 345 350
Leu Ser Ala Met Leu Pro Gln Thr Gly Gln Gly Ser Leu Gly Leu Leu
355 360 365
Met Thr Leu Met Gly Leu Leu Ile Val Leu Cys Trp Leu Pro Leu Ala
370 375 380
Thr Arg Met Ser His Gln Gly Gln Pro Val
385 390
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG H1F
<400> 15
caatgccgct actgttgttc cagcc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG H1R
<400> 16
cagtggtgcg tttttctacc gctat 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG H2F
<400> 17
aataactgcc gggtctacgg cc 22
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG H2R
<400> 18
aacgtatttt ctaaacgaat tttaaacggc gtc 33
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG CF
<400> 19
cggaacagta tgtgcaggtg ttacgg 26
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yddG CR
<400> 20
aacaaaccag ttacaaccac cgcaac 26
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yicL_F
<400> 21
gcgagctcat gggttccacc agaaaggg 28
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yicL_R
<400> 22
gctctagatc acttatgccg cgccgga 27
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydiN_F
<400> 23
gcgagctcat gtctcaaaat aaggctttca gca 33
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydiN_R
<400> 24
gctctagagg ccatcaaccc aatcaatt 28
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydhK_F
<400> 25
gcgagctcat gaacgcatcg tcatggtcct tgc 33
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydhK_R
<400> 26
gctctagatc acttatgccg cgccgga 27
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aaeB_F
<400> 27
gcgagctcat gggtattttc tccattgct 29
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aaeB_R
<400> 28
gctctagatt ttgacttaac tatcggtca 29
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yeeA_F
<400> 29
gcgagctcgt gcgtgccgat aagtc 25
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yeeA_R
<400> 30
gctctagatt atttgcgcaa ggcccg 26
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC_F
<400> 31
gcgagctcat gttgatgtta tttctcaccg t 31
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC_R
<400> 32
gctctagact ggcatcaccg cgaaataa 28
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> emrD_F
<400> 33
gcgagctcat gaaaaggcaa agaaacg 27
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> emrD_R
<400> 34
gctctagacg gtgacgtgcg cttaaac 27
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer_F
<400> 35
gcgccgacat cataacggtt ctgg 24
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer_R
<400> 36
cgcaacgttc aaatccgctc ccg 23
<210> 37
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ydhK 1945G
<400> 37
atgaacgcat cgtcatggtc cttgcgcaat ttgccctggt tcagggccac gctggcgcaa 60
tggcgttatg cgttacgcaa taccattgcc atgtgtctgg cgctgacggt tgcctattat 120
ttaaatctgg atgaacccta ttgggcgatg acctcggctg cagtggttag ctttcccacc 180
gttggcggtg ttatcagcaa aagcctcgga cgcatcgctg gcagtttgct cggagccatt 240
gcggcactgc ttcttgccgg gcatacgctc aatgagccgt ggttttttct attgagcatg 300
tcggcgtggc ttggcttttg tacctgggcc tgtgcgcact tcacgaataa cgtcgcgtat 360
gcatttcaac tggcgggcta cacggctgcc atcatcgcct ttccgatggt taatattact 420
gaggccagcc agctgtggga tatcgctcag gcgcgcgttt gcgaggtaat agtcggtatt 480
ttgtgcggcg gcatgatgat gatgatcctg ccgagcagtt ccgatgctac tgccctttta 540
accgcattga aaaacatgca cgcccgatta ctggaacatg ccagtttact ctggcagcct 600
gaaacaaccg atgccattcg tgcagcacat gaaggggtga ttgggcagat actgaccatg 660
aatttgctgc gtatccaggc tttctggagc cactatcgtt ttcgccagca aaacgcgcgc 720
cttaatgcgc tgctccacca gcaattacgt atgaccagtg tcatctccag cctgcgacgt 780
atgttgctca actggccctc accgccaggt gccacacgag aaattctcga acagttgctg 840
acggcgctcg ccagttcgca aacagatgtt tacaccgtcg cacgtattat cgccccgcta 900
cgcccgacca acgtcgccga ctatcggcac gtcgccttct ggcagcgact acgttatttt 960
tgccgccttt atctgcaaag tagtcaggaa ttacatcgtc tgcaaagcgg tgtagatgat 1020
cataccagac tcccacggac atccggcctg gctcgtcata ccgataacgc cgaagctatg 1080
tggagcgggc tgcgtacatt ttgtacgttg atgatgattg gcgcatggag tattgcttcg 1140
caatgggatg ccggtgccaa tgcattaacg ctggcagcaa ttagctgcgt actctactcc 1200
gccgtcgcag caccgtttaa gtcgttgtca cttctgatgc gcacgctggt gttactttcg 1260
ctattcagct ttgtggtcaa atttggtctg atggtccaga ttagcgatct gtggcaattt 1320
ttactgtttc tctttccact gctggcgaca atgcagcttc ttaaattgca gatgccaaaa 1380
tttgccgcat tgtgggggca actgattgtt tttatgggtt cttttatcgc tgtcactaat 1440
cccccggtgt atgattttgc tgattttctt aacgataatc tggcaaaaat cgttggcgtc 1500
gcgttggcgt ggttagcgtt cgccattctg cgtccaggat cggatgctcg taaaagccgc 1560
cgccatattc gcgcgctgcg ccgggatttt gtcgatcagc taagccgcca tccaacactg 1620
agtgaaagcg aatttgaatc gctcacttat catcacgtca gtcagttgag taacagccag 1680
gatgcgctgg ctcgccgttg gttattacgc tggggtgtag tgctgctgaa ctgttctcat 1740
gttgtctggc aattgcgcga ctgggaatcg cgttccgatc cgttatcgcg agtacgggat 1800
aactgtattt cactgttgcg gggagtgatg agtgagcgtg gcgttcagca aaaatcactg 1860
gcggccacac ttgaagaatt acagcggatt tgcgacagcc ttgcccgtca tcatcaacct 1920
gccgcccgtg agctggcggc aattgtctgg cggctgtact gctcgctttc gcaacttgag 1980
caagcaccac cgcaaggtac gctggcctct taa 2013
<210> 38
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ydhK 649V
<400> 38
Met Asn Ala Ser Ser Trp Ser Leu Arg Asn Leu Pro Trp Phe Arg Ala
1 5 10 15
Thr Leu Ala Gln Trp Arg Tyr Ala Leu Arg Asn Thr Ile Ala Met Cys
20 25 30
Leu Ala Leu Thr Val Ala Tyr Tyr Leu Asn Leu Asp Glu Pro Tyr Trp
35 40 45
Ala Met Thr Ser Ala Ala Val Val Ser Phe Pro Thr Val Gly Gly Val
50 55 60
Ile Ser Lys Ser Leu Gly Arg Ile Ala Gly Ser Leu Leu Gly Ala Ile
65 70 75 80
Ala Ala Leu Leu Leu Ala Gly His Thr Leu Asn Glu Pro Trp Phe Phe
85 90 95
Leu Leu Ser Met Ser Ala Trp Leu Gly Phe Cys Thr Trp Ala Cys Ala
100 105 110
His Phe Thr Asn Asn Val Ala Tyr Ala Phe Gln Leu Ala Gly Tyr Thr
115 120 125
Ala Ala Ile Ile Ala Phe Pro Met Val Asn Ile Thr Glu Ala Ser Gln
130 135 140
Leu Trp Asp Ile Ala Gln Ala Arg Val Cys Glu Val Ile Val Gly Ile
145 150 155 160
Leu Cys Gly Gly Met Met Met Met Ile Leu Pro Ser Ser Ser Asp Ala
165 170 175
Thr Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asn Met His Ala Arg Leu Leu Glu
180 185 190
His Ala Ser Leu Leu Trp Gln Pro Glu Thr Thr Asp Ala Ile Arg Ala
195 200 205
Ala His Glu Gly Val Ile Gly Gln Ile Leu Thr Met Asn Leu Leu Arg
210 215 220
Ile Gln Ala Phe Trp Ser His Tyr Arg Phe Arg Gln Gln Asn Ala Arg
225 230 235 240
Leu Asn Ala Leu Leu His Gln Gln Leu Arg Met Thr Ser Val Ile Ser
245 250 255
Ser Leu Arg Arg Met Leu Leu Asn Trp Pro Ser Pro Pro Gly Ala Thr
260 265 270
Arg Glu Ile Leu Glu Gln Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ser Ser Gln Thr
275 280 285
Asp Val Tyr Thr Val Ala Arg Ile Ile Ala Pro Leu Arg Pro Thr Asn
290 295 300
Val Ala Asp Tyr Arg His Val Ala Phe Trp Gln Arg Leu Arg Tyr Phe
305 310 315 320
Cys Arg Leu Tyr Leu Gln Ser Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Ser
325 330 335
Gly Val Asp Asp His Thr Arg Leu Pro Arg Thr Ser Gly Leu Ala Arg
340 345 350
His Thr Asp Asn Ala Glu Ala Met Trp Ser Gly Leu Arg Thr Phe Cys
355 360 365
Thr Leu Met Met Ile Gly Ala Trp Ser Ile Ala Ser Gln Trp Asp Ala
370 375 380
Gly Ala Asn Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ile Ser Cys Val Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Ala Val Ala Ala Pro Phe Lys Ser Leu Ser Leu Leu Met Arg Thr Leu
405 410 415
Val Leu Leu Ser Leu Phe Ser Phe Val Val Lys Phe Gly Leu Met Val
420 425 430
Gln Ile Ser Asp Leu Trp Gln Phe Leu Leu Phe Leu Phe Pro Leu Leu
435 440 445
Ala Thr Met Gln Leu Leu Lys Leu Gln Met Pro Lys Phe Ala Ala Leu
450 455 460
Trp Gly Gln Leu Ile Val Phe Met Gly Ser Phe Ile Ala Val Thr Asn
465 470 475 480
Pro Pro Val Tyr Asp Phe Ala Asp Phe Leu Asn Asp Asn Leu Ala Lys
485 490 495
Ile Val Gly Val Ala Leu Ala Trp Leu Ala Phe Ala Ile Leu Arg Pro
500 505 510
Gly Ser Asp Ala Arg Lys Ser Arg Arg His Ile Arg Ala Leu Arg Arg
515 520 525
Asp Phe Val Asp Gln Leu Ser Arg His Pro Thr Leu Ser Glu Ser Glu
530 535 540
Phe Glu Ser Leu Thr Tyr His His Val Ser Gln Leu Ser Asn Ser Gln
545 550 555 560
Asp Ala Leu Ala Arg Arg Trp Leu Leu Arg Trp Gly Val Val Leu Leu
565 570 575
Asn Cys Ser His Val Val Trp Gln Leu Arg Asp Trp Glu Ser Arg Ser
580 585 590
Asp Pro Leu Ser Arg Val Arg Asp Asn Cys Ile Ser Leu Leu Arg Gly
595 600 605
Val Met Ser Glu Arg Gly Val Gln Gln Lys Ser Leu Ala Ala Thr Leu
610 615 620
Glu Glu Leu Gln Arg Ile Cys Asp Ser Leu Ala Arg His His Gln Pro
625 630 635 640
Ala Ala Arg Glu Leu Ala Ala Ile Val Trp Arg Leu Tyr Cys Ser Leu
645 650 655
Ser Gln Leu Glu Gln Ala Pro Pro Gln Gly Thr Leu Ala Ser
660 665 670
<210> 39
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ermD 1071G
<400> 39
atgaaaaggc aaagaaacgt caatttgtta ttgatgttgg tattactcgt ggccgtcggt 60
cagatggcgc aaaccattta tattccagct attgccgata tggcgcgcga tctcaacgtc 120
cgtgaagggg cggtgcagag cgtaatgggc gcttatctgc tgacttacgg tgtctcacag 180
ctgttttatg gcccgatttc cgaccgcgtg ggccgccgac cggtgatcct cgtcggaatg 240
tccattttta tgctggcaac gctggtcgcg gtcacgacct ccagtttgac ggtgttgatt 300
gccgccagcg cgatgcaggg gatgggcacc ggcgttggcg gcgtaatggc gcgtacttta 360
ccgcgagatt tatatgaacg gacacagttg cgccatgcta acagcctgtt aaacatgggg 420
attctcgtca gtccgttgct cgcaccgcta atcggcggtc tgctggatac gatgtggaac 480
tggcgcgcct gttatctctt tttgttggtt ctttgtgctg gtgtgacctt cagtatggcc 540
cgctggatgc cggaaacgcg tccggtcgat gcaccgcgca cgcgcctgct taccagttat 600
aaaacgcttt tcggtaacag cggttttaac tgttatttgc tgatgctgat tggcggtctg 660
gccgggattg ccgcctttga agcctgctcc ggcgtgctga tgggcgcggt gttagggctg 720
agcagtatga cggtcagtat tttgtttatt ctgccgattc cggcagcgtt ttttggcgca 780
tggtttgccg gacgtcccaa taaacgcttc tccacgttaa tgtggcagtc ggttatctgc 840
tgcctgctgg ctggcttgct gatgtggatc cccgactggt ttggcgtgat gaatgtctgg 900
acgctgctcg ttcccgccgc gctgttcttt ttcggtgccg ggatgctgtt tccgctggcg 960
accagcggcg cgatggagcc gttccccttc ctggcgggca cggctggcgc gctggtcggc 1020
ggtctgcaaa acattggttc cggcgtgctg gcgtcgctct ctgcgatgtt gccgcaaacc 1080
ggtcagggca gcctggggtt gttgatgacc ttaatgggat tgttgatcgt gctgtgctgg 1140
ctgccgctgg cgacgcggat gtcgcatcag gggcagcccg tttaa 1185

Claims (5)

1.一种突变株，是过度表达选自yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC和emrD中的一种以上的基因而L-氨基酸生产能力得到提高的突变株，所述突变株为大肠杆菌(Escherichiacoli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
2.根据权利要求1所述的突变株，其中，所述yicL由SEQ ID NO:1的碱基序列构成，ydiN由SEQ ID NO:2的碱基序列构成，ydhK由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:37的碱基序列构成，aaeB由SEQ ID NO:4的碱基序列构成，yeeA由SEQ ID NO:5的碱基序列构成，rhtC由SEQ IDNO:6的碱基序列构成，emrD由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:39的碱基序列构成。
3.根据权利要求1所述的突变株，其中，所述L-氨基酸选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸和L-瓜氨酸。
4.一种L-氨基酸的生产方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养权利要求1所述的突变株的步骤；以及
(b)从所述突变株或者培养基中回收L-氨基酸的步骤。
5.根据权利要求4所述的L-氨基酸的生产方法，其中，所述L-氨基酸选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸和L-瓜氨酸。
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